Methoden voor acute en subacute muizen achterbeen ischemie

Het algemene doel van dit protocol is om menselijke perifere arterieziekte te modelleren door het plaatsen van hechtingen of ameroid constrictoren op de femorale arterie van de muis voor de inductie van respectievelijk acute of subacute ischemie van de achterpoot. Perifere arterieziekte is een belangrijk klinisch probleem, en deze technieken met gebruik van diermodellen zijn ontwikkeld om de menselijke ziekte beter weer te geven. Het primaire voordeel van deze technieken is dat de ernst en het tijdstip van het ontstaan van ledemaatischemie door de onderzoeker kunnen worden gecontroleerd.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Mike Padgett, een technicus uit mijn laboratorium. Bevestig één tot twee dagen voor de procedure of de muis volledig gesedeerd is door het gebrek aan reactie op een knijpreflex in de teen, en breng oogzalf aan. Gebruik vervolgens een kleine elektrische trimmer om het haar van beide achterpoten af te scheren.

Wanneer al het haar is getrimd, brengt u voorverwarmde ontharingscrème aan. Veeg de crème na één minuut voorzichtig af met een bevochtigd gaasje. Plaats de muis vervolgens in een herstelkooi die is bekleed met papieren handdoeken totdat het dier in staat is om in sternale recumbens te blijven.

Plaats de volledig gesedateerde muis op de dag van de operatie in rugligging onder een technic stereodissectiemicroscoop en zet beide achterpoten vast met chirurgische tape. Indien er een verwarmingsmat met temperatuurregeling wordt gebruikt, bevestig dan de temperatuursensor en zet deze met chirurgische tape vast aan de basis van het operatieplatform. Reinig vervolgens de operatieplaats met drie afwisselend gebruikte povidonjodium- en alcoholdoekjes en dek het dier af met een steriel chirurgisch afdekdoek met een opening op de plaats van de incisie.

Maak met een scalpel een eerste incisie langs het midden van de mediale zijde van het dijbeen, vanaf de knie richting de buik. Gebruik vervolgens een fijne schaar om de incisie te verlengen tot ongeveer één centimeter. Open de incisie met een pincet om het membraan dat het inguïnale vetweefsel bedekt bloot te leggen.

Gebruik vervolgens gesloten pincetten om door het membraan heen te steken, in de ruimte tussen het vetweefsel en de buikholte. Laat de druk op de pincetten voorzichtig los om het vetweefsel van de buikspieren te scheiden, waardoor het neurovasculaire bundel vrijkomt. Het is cruciaal dat de belangrijkste bloedvaten en hun vertakkingen correct zijn geïdentificeerd vóór de dissectie van het neurovasculaire bundel.

Variaties in de locatie van de constrictoren of de ligatieplaatsen kunnen de ernst van de ischemie aanzienlijk beïnvloeden en leiden tot een aanzienlijke variabiliteit in de resultaten. Plaats een retractor in de incisie en trek het abdominale weefsel richting de kop van het dier om de proximale plaats van de ameroid constrictor bloot te leggen, die zich net proximaal van de arteria circumflexa femoris lateralis bevindt. Plaats vervolgens één mediale en één laterale retractor in het distale deel van de incisie om het operatieveld te verbreden, waarbij het inguinale vetweefsel richting de voet en weg van de operatieplaats wordt getrokken.

De proximale en oppervlakkige caudale takken van de arteria femoralis zouden gemakkelijk waarneembaar moeten zijn. De arteria circumflexa femoris lateralis bevindt zich ongeveer vijf millimeter proximaal van de caudale takken en kan door vlies worden aanHet zicht onttrokken. Schuif nu voorzichtig de punt van één pincet onder het vlies dat de vaten samenbindt, om de helft van de punt tussen de vene en de arterie te plaatsen.

Sluit vervolgens de pincet en scheur voorzichtig het membraan weg. Wanneer al het membraan is verwijderd, steekt u de punt van de gesloten pincet tussen de ader en de slagader en laat u de druk op de pincet los om een opening tussen de vaten te creëren. Voor subacute ledemaatische ischemie schuift u de punt van de pincet onder de arteria femoralis om het vat te isoleren van de neurovasculaire bundel.

Gebruik een tweede set gebogen pincetten om de rand van de constrictor vast te pakken en geleid deze onder de arteria femoralis. Plaats vervolgens de arterie in de sleuf van de constrictor. Positioneer daarna de distale constrictor op de arteria femoralis, direct proximaal van het punt waar de arterie zich splitst in de arteria poplitea en de arteria saphena, en plaats de arteria femoralis in de sleuf van de constrictor.

Voor acute ledemaatischemie wordt een 7-0 hechtdraad onder de arterie doorgevoerd op dezelfde positie als de proximale constrictor, waarna de arterie wordt afgebonden. Bind vervolgens een tweede ligatuur ongeveer één millimeter distaal van de eerste en gebruik veerschaar om de arterie tussen de twee ligaturen door te snijden. Voor de distale arteriële transectie worden de ligaturen ongeveer één millimeter uit elkaar geplaatst, net proximaal van het punt waar de arteria femoralis zich splitst in de arteria poplitea en de arteria saphena.

Sluit vervolgens de incisie met onderbroken 5-0 vicryl-hechtingen en verplaats de muis naar een verwarmingsmat van 37 °C onder een laser-doppler perfusie-imager. Zet nu de imager aan en start de software voor beeldvastlegging. Klik op het pictogram Nieuwe enkelvoudige afbeelding om het venster voor de scannerinstellingen te openen, en stel de scansize in op groot en de scansnelheid op 4 ms per pixel.

Wijzig de X- en Y-waarden onder het paneel Scan Area units naar de juiste waarden, klik vervolgens op het tabblad Video and Distance en positioneer beide achterpoten binnen het scangebied. Klik op Auto Distance en klik daarna op Next om het venster Subject Details te openen, en voer de informatie van het subject in. Klik op Next om door te gaan naar het scanvenster.

Klik vervolgens op de knop Start Measurement om het dialoogvenster Confirm or Override Scan Distance te openen, en klik op OK om het scanproces te starten. Wanneer het scannen is voltooid, verplaatst u de muis naar een lege herstelkooi met monitoring totdat deze volledig is hersteld. Naast de variaties die inherent zijn aan dierstudies, kunnen andere factoren variabiliteit introduceren binnen de laserdoppler-perfusie-imaging, waaronder de lichaamstemperatuur en de positie van het dier.

Het model voor subacute ischemie van de achterpoot is afhankelijk van de kwaliteit van de ameroid constrictoren, die sterk kan variëren binnen een bepaalde batch. Laser Doppler-perfusie-imaging moet onmiddellijk na de procedure worden uitgevoerd terwijl het dier nog onder narcose is, om de effecten van de operatie aan te tonen en een baseline postoperatief perfusieniveau vast te stellen. Na het induceren van acute ledemaatischemie moet een volledig verlies van de perfusie van de achterpoot worden waargenomen, terwijl na het plaatsen van de ameroid constrictor in het subacute model doorgaans slechts een lichte afname van de perfusie wordt gezien.

Deze procedures maken het mogelijk om de effecten van verschillende graden van ischemie op vasculaire remodellering en regeneratie van skeletspieren in de muis te onderzoeken als model voor perifeer arterieel vaatlijden bij mensen. Eenmaal beheerst, kunnen deze procedures in ongeveer 15 minuten worden voltooid mits ze correct worden uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze operaties is het belangrijk om de lichaamstemperatuur en de toereikendheid van de anesthesie bij het dier continu te bewaken.

Door de plaatsing van de ligaturen of de constrictors aan te passen, kan de ernst van het ischemische letsel worden gewijzigd, wat een belangrijke variabele kan zijn afhankelijk van de genetische achtergrond van het dier of de aanwezigheid van cardiovasculaire risicofactoren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe zowel acute als subacute ischemie van de achterpoot bij de muis kan worden geïnduceerd, en hoe de vasculaire anatomie kan worden gedefinieerd om een correct resultaat en reproduceerbaarheid van de procedure te garanderen.