Genereren van een gehumaniseerd muis lever met behulp van menselijke lever stamcellen

Het algemene doel van deze chirurgische stamceltransplantatieprocedure is het genereren van een nieuw chimeer muismodel met menselijke leverfuncties, gebruikmakend van menselijke onrijpe hepatische stamprogenitorcellen die celproliferatie, rijping en differentiatie mogelijk maken voor de verwerving van geneesmiddelenmetabolisme. Deze methode biedt een krachtig instrument voor het creëren van een micro-omgeving die de progenese van menselijke donor-hepatische stamcellen ondersteunt om uit te breiden, te differentiëren en de beschadigde lever van de muis-recipient te reconstitueren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat gerijpte geprolifereerde cellen kunnen worden gebruikt en dat de lever bijna volledig wordt herbevolkt.

Begin met het maken van een voorraadoplossing van difterietoxine (DT) van 1 mg/mL door 1 mL gefenoliseerde 0,85% natriumchloride-oplossing toe te voegen aan 1 mg DT. Voer een intraperitoneale injectie van DT uit door een albtrek scid-muis in rugligging vast te houden en, onder de knik van de knieën links of rechts van de middellijn, de naald in een hoek van 45 graden ten opzichte van het lichaam in te brengen. Injecteer met een insulinespuit 100 µL vers bereide 0,3 µg/mL DT per 20 gram muis. 48 uur na de DT-injectie plaatst u de muis in een fixatieapparaat en warmt u de staart ongeveer 10 minuten op in een waterbad van 30 °C om de bloedvaten te dilateren.

Maak vervolgens, twee centimeter vanaf de punt van de staart, met een scherp scalpelmesje een inkeping van één millimeter in de staart en gebruik een capillaire buis om het bloed op te vangen. Centrifugeer de microcapillaire buis met het bloed bij 1500 ×g gedurende vijf minuten en verzamel het serum door het supernatant van het celpellet te scheiden. Pipetteer 50 µL van een 1:20 verdunning van het serum op GOT ASTP3-dia's.

Meet vervolgens de absorbentie van het reactieproduct bij 650 nanometer met een multifunctionele automatische droge chemie-analyzer volgens het protocol van de fabrikant. Isoleer met een cel sorter humane hepatische stamcellen uit humane primaire foetale levercellen met de celantigenen CDCP1, CD90 en CD66 om een CDCP1-positieve, CD90-positieve, CD66-negatieve subpopulatie te verkrijgen. Zaai de cellen uit op met collageen IV gecoate kweekschaaltjes en incubeer deze bij 37 °C.

Wanneer de cellen een confluentie van 80 tot 90% bereiken, worden de cellen eenmaal gewassen met PBS. Voeg vervolgens 0,05% Trypsin EDTA toe en incubeer dit bij kamertemperatuur. Wanneer de cellen onder een microscoop lijken te zweven of vrij bewegen, wordt de enzymatische digestie gestopt door acht milliliter DMF12 met 10% FBS toe te voegen.

Resuspendeer de cellen voorzichtig met een serologische pipette van 10 milliliter voordat u ze overbrengt naar een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de cellen bij 100 ×g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Resuspendeer de celpellet voorzichtig met 10 milliliters DMF12 met 10% FBS en bepaal het aantal cellen met een celteller.

Verdeel de cellen in aliquots van 1 × 10⁶ cellen per 50 µL PBS voor elke muis en bewaar deze op ijs tot de transplantatie. Controleer na het anesthetiseren van een muis volgens het tekstprotocol op een reflex door zachtjes in het kussentje van de achterpoot te knijpen. Breng vervolgens veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.

Scheer de chirurgische plaats met een elektrische trimmer en breng 70% ethanol en povidonjodium aan om te desinfecteren. Maak een huidincisie van één centimeter in de linkerflank, net onder de costale rand van de ribben. Maak vervolgens een incisie in de linker buikwand, gevolgd door een incisie in het peritoneum.

Leg vervolgens de milt voorzichtig bloot. Steek daarna, onder een hoek van vijf graden, een micro-injectiespuit van 100 µL met een 32 gauge naald van een halve inch in tot een diepte van de helft van de dikte van de milt. Injecteer 1 × 10⁶ humane hepatische stamcellen in 50 µL PBS direct door het orgaan, van het ene uiteinde naar het andere, en verwijder vervolgens de naald. Om lekkage van de cellen na injectie te voorkomen, wordt met een vinger gedurende twee minuten voorzichtig druk uitgeoefend.

Plaats de milt terug in het lichaam van de muis en gebruik een normale doorlopende hechting voor de musculatuur en de huid om de holte te sluiten. Plaats de muis onmiddellijk op zijn zij in een voorverwarmde kooi van 37 °C. Voorkom contact tussen de kooi-bedding en de operatieve plek en monitor het dier volgens het tekstprotocol.

Vier tot zes weken na transplantatie, nadat de muis volgens het tekstprotocol is geëuthanaseerd, opent u de buikholte met een chirurgische schaar door de huid en fascia gelijktijdig door te snijden. Gebruik de schaar als spreider om het bindweefsel boven het peritoneum langs de linea alba te dissekeren en zo de peritoneale holte te openen. Til het sternum op met een pincet.

Doorboor vervolgens het diafragma en snijd aan beide zijden van het sternum tot aan de cervicale gordel. Sever de vena cava aan de thoracische zijde van de lever en trek de slokdarm in anterieure richting door de lever. Verwijder het diafragma en trek, met het diafragma als handgreep, de lever uit de buikholte.

De vena cava inferior houdt de lever op zijn plaats. Snijd daarom de vena cava inferior door, waarbij u er zorg voor draagt de rechterbijnier niet voortijdig vrij te maken. Scheid de leverloben van elkaar bij de overgangen en bed ze in OCT volgens het protocol van de fabrikant.

Bevries het OCT met het leverweefsel in de metalen roosters op de cryostaat. Snijd met de cryostaat monstersecties van vijf micrometer dikte bij minus 18 °C en monteer deze op microscoopglaasjes op kamertemperatuur. Bewaar de voorraad bij minus 80 °C.

Bereid ten slotte de coupes voor H&E-kleuring volgens eerder beschreven procedures en de ELISA volgens het tekstprotocol. Zoals te zien is in deze H&E-gekleurde coupes, vertoonden DT-behandelde muizen een gedesorganiseerde hepatische architectuur en een correctie voor congestie met een verhoogde serum-AST-activiteit. Zes weken na transplantatie herstelden de uit menselijke hepatische stamcellen afgeleide cellen de leverstructuur door de aanwezige muishepatocyten te vervangen.

Macroscopisch gezien werden vier dagen na transplantatie kleine menselijke hepatische clusters gedetecteerd die uniform over de lever waren verdeeld. Na 45 dagen waren deze clusters geprolifereerd tot grote clusters. Zoals hier te zien is, werd de aanwezigheid van menselijke hepatocyten in muizenlevers voor het eerst bevestigd zes weken na transplantatie door kleuring met antilichamen tegen menselijke kernen en cytokeratine 8/18.

Menselijke ALB-positieve en CK19-negatieve hepatocyten vertoonden gelijkenissen met functionele hepatocyten, terwijl cellen die positief co-kleurden voor menselijk ALB en CK19 een bipotentieel vermogen vertoonden om te differentiëren tot hepatocyten en cholangiocyten. De aanwezigheid van meerdere ronde clusters rondom de leverkwabben met duidelijke menselijke kernen en CK8/18-expressie werd gedetecteerd, wat het kolonie-vormende vermogen van menselijke hepatische stamcellen in de gehumaniseerde levers aantoont. Ten slotte bereikte het herbevolkingsniveau tot 90% één maand na transplantatie en werd de secretie van menselijk albumine gedetecteerd in de herbevolkte muizenlevers.

Zodra de techniek beheerst is, kan chirurgische celtransplantatie in 10 minuten worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat leverschade beperkt blijft tot de lever van de donor. Bij cellekage moet celtransplantatie worden voorkomen.

In combinatie met deze procedure kunnen andere methoden, zoals gentransfectie voor in vivo directe herprogrammering met menselijke cellen, worden uitgevoerd om de convergentie van menselijke cellen met ons huidige model te onderzoeken. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de hepatologie om het menselijke medicijnmetabolisme, geneesmiddelinteracties, hepatische toxiciteit en het hepatitisvirus te bestuderen in een gehumaniseerd levermodel. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u hepatische stamcellen isoleert en expandeert, leverbeschadiging induceert en cellen via de milt transplanteert om een chimeer muismodel met menselijke leverfunctie te genereren.

Vergeet niet dat difterietoxine beheerst kan worden en dat belangrijke voorzorgsmaatregelen, zoals het vermijden van necrose van het hart en de lever, altijd in acht moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.