Name: Genereren van een gehumaniseerd muis lever met behulp van menselijke lever stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Leer hoe je een gehumaniseerde muizenlever genereert met menselijke leverstamcellen via splenische transplantatie. Deze methode creëert een chimerisch model voor onderzoek naar humane leverfunctie en geneesmiddelmetabolisme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We wensen het Mammalian Genetics Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, te danken voor het verstrekken van de muizen. We danken ook S. Aoyama en Y. Adachi van het ADME (Absorptie, Distributie, Metabolisme, Uitscheiding) & Toxicology Research Institute, Sekisui Medical Company Ltd., Japan, en K. Kozakai en Y. Yamada voor hun hulp bij de LC-MS/MS analyse. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Grants-in-Aid van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT), Japan aan Y-W.Z. (18591421, 20591531 en 23591872); door het Jiangsu innovatieve en ondernemende project voor de introductie van hoogwaardig talent en het Jiangsu wetenschap en technologie planning project (BE2015669); en door subsidies aan H.T. voor Strategische Bevordering van Innovatieve Onderzoek en Ontwikkeling (S-innovatie, 62890004) van de Japan Science and Technology Agency.

Alle dierlijke experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen Animal Protection van Yokohama City University. 1. Generatie van de acute leverschade muismodel <ol><li> Voeg 1 ml fenol 0,85% NaCl-oplossing (0,6 g fenol in 100 ml van 0,85% NaCl-oplossing) tot 1 mg difterietoxine (DT) van een 1 mg / ml voorraadoplossing DT maken. Noot: DT bij een concentratie van 1 mg / ml kan worden opgeslagen gedurende ongeveer 2 jaar bij 3 ° C tot 8 ° C. </li><li> Serieel verdunnen de 1 mg / ml DT stockoplossing aan 0,3 ug / ml DT fenol 0,85% NaCl-oplossing en bereid een hoeveelheid van de 0,3 ug / ml DT-oplossing is als werkoplossing. Opmerking: Deze werkoplossing moet vers worden bereid. </li><li> Experimenten met behulp van een subletale dosis (~ 50% sterfte) uit te voeren, te beheren 8 weken oude muizen een 1,5 ug dosis / kg van DT. <ol><li> Voer een intraperitoneale injectie van DT door het houden van de muis in dorsale decubitus en steek de needle onder de buiging van de knieën, links of rechts van de middellijn. Vermijd de middellijn penetratie van de blaas te voorkomen. Hoek de naald bij ongeveer 45 ° aan het lichaam. </li><li> Met een insulinespuit Injecteer de muizen met 100 pl vers bereide 0,3 ug / ml DT per 20 gram muis gewicht. Bijvoorbeeld, zou een 18-g muis 90 pl van het 0,3 ug / ml DT oplossing ontvangt. </li></ol></li><li> Op 48 uur na DT-injectie, het verzamelen van bloed uit de staartader door het plaatsen van de muis in een restrainer en opwarming muis staart van de in een 37 ° C waterbad gedurende ongeveer 10 minuten aan de bloedvaten verwijden. Maak dan een 1-mm inkeping in de staart 2 cm vanaf de punt met een scherp scalpel en het verzamelen van het bloed met een microcapillaire buis. <ol><li> Centrifugeer de microcapillaire buis met het bloed bij 1500 g gedurende 5 minuten en verzamel het serum door het scheiden van het supernatant en celpellet. </li></ol></li><li> Pipetteer 50 ul van 1:20 verdund muis serum op GOT / AST-PIII glijdt. Meet de absorptie van het reactieproduct (blauwe kleurstof) bij 650 nm onder toepassing van een multifunctionele automatische droge-chemie-analysator volgens het protocol van de fabrikant. LET OP: Het uitlezen van aspartaataminotransferase (AST) / glutaminezuur oxaalazijnzuur transaminase (GOT) activiteit wordt automatisch weergegeven. 2 dagen na DT injectie, ongeveer 60% van de muizen vertoonden AST waarden tussen 12.000 - 16.000 IU / L en werden beschouwd te lijden aan acute beschadiging van de lever. Deze muizen werden overgebracht naar een nieuwe kooi en gebruikt als ontvangers celtransplantatie. </li></ol> 2. Voorbereiding van de humane lever stamcellen <ol><li> Isoleer humane lever stamcellen uit menselijke primaire foetale levercellen met een mobiele sorter met behulp van de CDCP1, CD90 en CD66 cel antigenen aan een CDCP1 + CD90 + CD66- subpopulatie te krijgen, dan is het zaad van de geïsoleerde cel populatie op collageen IV-gecoate cultuur gerechten, zoals eerder vermeld 15. Gebruik primaire foetale levercellen van een embryonale menselijkeleeftijd tussen week 14 en 18. </li><li> Verzamel humane lever stamcellen gekweekt tot 80% - 90% samenvloeiing op 100-mm cultuur gerechten, zuigen het kweekmedium, was de cellen met 10 ml PBS, en verwijder de PBS. Trypsinize de cellen met 2 ml 0,05% trypsine / EDTA-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Opmerking: Cellen groter dan 90% confluentie zijn niet geschikt voor celtransplantatie sinds celdifferentiatie hun proliferatieve vermogen kunnen beïnvloeden muizen. </li><li> De status van de cel dispersie onder een microscoop. Wanneer de cellen lijken te zweven of vrij stromende, stopt de enzymatische digestie door het toevoegen van 8 ml van DMEM / F12 met 10% FBS. </li><li> Hang de cellen langzaam met behulp van een 10-ml serologische pipet en overdracht van de cellen in een 15-mL conische buis. Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 100 xg en 4 ° C. </li><li> resuspendeer voorzichtig de cel pellet in 10 ml DMEM / F12 met 10% FBS en het bepalen van het aantal cellen met behulp van een microscoop telkamer. </li><li>Verdeel de cellen in 1,0 x 10 6 cellen per 50 pl PBS porties voor elke individuele muis en opgeslagen op ijs tot transplantatie. </li></ol> 3. milt Transplantatie van humane lever stamcellen <ol><li> Plaats een schone kooi op een 37 ° C elektrische verwarming pad. </li><li> Verdoven de muis met behulp van isofluraan inhalatie (1-1,5% (vol / vol) in 2 L zuurstof per min) door deze onder het mondstuk. U kunt ook gebruik maken van buizen met gaas doordrenkt met isofluraan. <ol><li> Zorg ervoor dat de muis wordt verdoofd door licht te knijpen de achterste voetzool. Als een knie ruk wordt opgewekt, plaatst u de muis terug in de kamer. Gebruik dierenarts zalf op de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving. </li></ol></li><li> Scheren de operatieplaats via tondeuse en toepassen 70% (vol / vol) ethanol en povidonjood te steriliseren. maak dan 1 cm huidincisie in de linker flank net onder de ribben rand van de ribben, gevolgd door een insnijdingde buikwand en het peritoneum. </li><li> bloot de milt zorgvuldig. Gebruik een 100-gl microinjectie spuit met een 32 G-1/2-inch naald direct te injecteren 1,0 x 10 6 humane lever stamcellen in 50 pi PBS in de milt van elke muis. Kantel de naald in een 5 ° hoek voor injectie. <ol><li> Waarborgen dat de diepte van de injectie minder dan de helft van de dikte van de milt. De naald moet de milt voeren aan één uiteinde (het hoofd) en de cellen aan het andere uiteinde (de staart) te deponeren. </li></ol></li><li> Om lekkage van de cellen na de injectie te voorkomen, voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van een vinger gedurende 2 minuten en verwijder de naald. </li><li> Plaats de milt terug in de muis lichaam en sluit de holte met een normale doorlopende draad voor de spieren en de huid. </li><li> Breng de muizen in een 37 ° C voorverwarmde kooi onmiddellijk na transplantatie. Om de muis te waarborgen is in staat om comfortabel te ademen, plaatst u de muis op zijn kant in de kooi, eenvoiding contact tussen de aanwezige kooi en de plaats van de operatie. </li><li> Bewaken van de muizen tot de verdoving is uitgewerkt om ervoor te zorgen de hechtingen gesloten blijven en de muizen terug te keren naar pre-operatie omstandigheden. </li><li> Zorg ervoor dat de muizen worden geleverd met een normale drinkwater en voedsel. Na 1 uur terug de kooi om de muis ruimte van het dier centrum en dagelijks toezicht op de muizen. </li></ol> 4. Detectie van getransplanteerde humane lever stamcel-afgeleide hepatocyten in de muizenlever Opmerking: Voor de volgende procedures, euthanaseren alle dieren met behulp van een overdosis van ketamine en xylazine, gevolgd door cervicale dislocatie. <ol><li> Op 4-6 weken na transplantatie, euthanaseren de muizen en open de buikholte door tegelijkertijd het snijden van de cutis en fascia met behulp van chirurgische schaar. </li><li> Ontleden het bindweefsel boven het peritoneum, met de schaar als spreader, en snijd het buikvlies langs de linea alba de peritoneale openenholte. </li><li> Til het borstbeen met een tang, doorboren het membraan en doorsnijden weerskanten van het borstbeen omhoog door de baarmoederhals gordel. </li><li> Scheidt de vena cava de thoracale zijde van de lever en trek de slokdarm door de lever in de voorste richting. Verwijder het membraan om de lever te verwijderen. Opmerking: Wees voorzichtig te houden van de uiteinden van de schaar wees naar boven om eventuele schade aan de thoracale organen eronder te voorkomen. De thymus heeft de neiging om af vasthouden aan de dorsale zijde van het borstbeen en dit moet zorgvuldig worden vermeden. </li><li> Met het membraan als handgreep, beginnen trekken van de lever uit de buikholte. Het interieur vena cava zal worden met de lever op zijn plaats. Snijd het interieur vena cava; wees niet te vroeg te bevrijden van de juiste bijnier. Let op: Muizen hebben een vier-lobbig lever, bestaande uit een mediane kwab, links kwab, rechter kwab, en de Spiegelse kwab. De galblaas hangt in kleine vertakking vande mediaan kwab. </li><li> Scheid de lobben van elkaar op de kruispunten en insluiten in optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding volgens protocol van de fabrikant. Bevriezen van de LGO met het leverweefsel in de metalen roosters op de cryostaat. </li><li> Cut-5 urn dikke secties monster met behulp van een cryostaat bij -18 ° C en brengen ze op RT objectglaasjes. Bewaar de voorraad bij -80 ° C. Bereid de dia&#39;s hematoxyline en eosine (H &amp; E) en immunofluorescentie kleuring volgens eerder beschreven procedures 16. </li></ol> 5. Detectie van humaan albumine secretie en berekening van de chimere Rate <ol><li> Lever reconstitutie menselijke meten uitvoeren humaan albumine ELISA met serum en humaan albumine ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Bereken het gehumaniseerde lever chimere rente met real-time PCR-analyse van expressie niveaus in de hele-gehumaniseerde lever. Bepaal de relatieve expression hoogte verhouding van humaan-specifieke actine mens-muis kruis actine (verhouding 1) en de verhouding van muisspecifieke actine mens-muis kruis actine (verhouding 2). Het chimere wordt berekend als verhouding 1 / (verhouding 1 + verhouding 2). </li></ol>

<ol><li>Muruganandan, S., Sinal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+as+clinically+relevant+models+for+the+study+of+cytochrome+P450-dependent+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+chimeric+mice+with+humanized+livers+to+predict+human+drug+metabolism+and+a+drug-drug+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).</li>
<li>Suemizu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+humanized+model+of+liver+using+NOD%2FShi-scid+IL2Rgnull+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).</li>
<li>Tateno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+completely+humanized+liver+in+mice+shows+human-type+metabolic+responses+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs.</a> Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).</li>
<li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstituted+%27humanized+liver%27in+TK-NOG+mice+is+mature+and+functional%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).</li>
<li>Azuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+expansion+of+human+hepatocytes+in+Fah%E2%88%92%2F%E2%88%92%2FRag2%E2%88%92%2F%E2%88%92%2FIl2rg%E2%88%92%2F%E2%88%92+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice.</a> Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).</li>
<li>Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+diseased+mouse+liver+by+hepatic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation.</a> Science. 263, 1149-1152 (1994).</li>
<li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+efficiencies+of+adult+hepatocytes%2C+fetal+liver+progenitor+cells%2C+and+embryonic+stem+cell-derived+hepatic+cells+in+albumin-promoter-enhancer+urokinase-type+plasminogen+activator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice.</a> Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).</li>
<li>Sharma, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+embryonic+stem+cell-derived+hepatic+progenitor+cells+engraft+in+recipient+livers+with+limited+capacity+of+liver+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation.</a> Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).</li>
<li>Peltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+%27humanized%27+mice+improve+drug+development+in+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century.</a> Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+repopulation+with+hepatocytes+generated+from+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts.</a> Nature. 508, 93-97 (2014).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+toxin+receptor-mediated+conditional+and+targeted+cell+ablation+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice.</a> Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).</li>
<li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+embryonic+stem+cell-derived+endodermal+cells+into+mice+with+induced+lethal+liver+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage.</a> Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).</li>
<li>Machimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+survival+rate+by+fetal+liver+cell+transplantation+in+a+mice+lethal+liver+failure+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model.</a> Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).</li>
<li>Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).</li>
<li>Zhang, R. -R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cells+transplanted+into+a+fulminant+hepatic+failure+Alb-TRECK%2FSCID+mouse+model+exhibit+liver+reconstitution+and+drug+metabolism+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities.</a> Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).</li>
<li>Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrom%2C+SC+%22Hepatocytes%22">Hepatocytes</a>. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).</li>
<li>Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+experimental+models+of+drug+metabolism+and+disposition+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm.+Sin.+B%22%5BJournal%5D)">Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development.</a> Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).</li>
<li>Nowak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+expandable+human+hepatic+progenitors+which+differentiate+into+mature+hepatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo.</a> Gut. 54, 972-979 (2005).</li>
<li>Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+a+diphtheria+toxin+receptor%3A+identity+with+a+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor.</a> Cell. 69, 1051-1061 (1992).</li>
<li>Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+toxin+binds+to+the+epidermal+growth+factor+%28EGF%29-like+domain+of+human+heparin-binding+EGF-like+growth+factor%2Fdiphtheria+toxin+receptor+and+inhibits+specifically+its+mitogenic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity.</a> J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).</li>
<li>Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+organs+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regener%22%5BJournal%5D)">Generation of functional organs from stem cells.</a> Cell Regener. 2, 1(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te onthullen.

Recente studies hebben aangetoond dat de muizenlever kan worden herbevolkt met menselijke hepatocyten, met inbegrip van volwassen hepatocyten en proliferatieve hepatische stamcellen 17. Deze bevolkt levers zijn gebruikt als preklinische experimentele modellen voor geneesmiddelmetabolisme testen en geneesmiddelen en ontwikkeling 18; bovendien hebben zij voorzien in een in vivo omgeving voor cellen rijping en differentiatie 19. Het belangrijkste doel van dit onderzoek was om een ​...

Muizen worden vaak gebruikt voor farmaceutisch onderzoek omdat biomedisch onderzoek bij mensen beperkt is1; deze modellen zijn echter niet altijd nuttig omdat ze de effecten die bij mensen worden waargenomen mogelijk onnauwkeurig simuleren. De meeste medicijnen die momenteel in de geneeskunde worden gebruikt, worden voornamelijk in de lever gemetaboliseerd. Echter, hetzelfde medicijn kan in de lever van een muis en een mens in verschillende metabolieten worden omgezet vanwege verschillen tussen soorten. Daarom is het vaak moeilijk om tijdens de ontwikkeling vast te stellen of een potentieel medicijn risico's met zich meebrengt voor klinische toepassingen2,3. 
Om dit probleem aan te pakken, zijn "gehumaniseerde" muizenlevers ontwikkeld door menselijke levercellen in muizen te laten groeien4-6; deze modellen vertonen drugsreacties die vergelijkbaar zijn met die in de menselijke lever. De belangrijkste muismodellen die momenteel worden gebruikt voor het genereren van een gehumaniseerde lever, zijn uroplasminogene activator (uPA+/+) muizen4,7, fumarylacetoacetaat hydrolase (Fah−/−) muizen6 en de recent gerapporteerde thymidinekinase (TK-NOG) muizen. 
Echter, eerdere rapporten hebben aangetoond dat getransplanteerde menselijke onrijpe cellen of stamcellen minder concurrerend zijn dan volwassen menselijke hepatocyten in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) muizenlevers8-10. Bovendien bieden Fah−/− muizen alleen een groeisvoordeel voor gedifferentieerde hepatocyten en niet voor onrijpe levervoorlopercellen11. De transplantatie van menselijke hepatische stamcellen (HpSCs) in TK-NOG muizen in het laboratorium is niet succesvol geweest. Daarom bestaat er momenteel geen nuttig muismodel voor de efficiënte aanplant van menselijke onrijpe levercellen. 
Daarom hebben we een nieuwe Alb-TRECK/SCID muismodel ontwikkeld die efficiënt kan worden gerepleept met menselijke onrijpe hepatocyten. Dit transgene muismodel drukt humane heparine-bindende EGF-achtige groeifactor (HB-EGF) receptoren uit onder controle van een levercel-specifieke albumine-promotor. Na toediening van difterietoxine (DT) ontwikkelen deze muizen fulminante hepatitis door conditionele ablatie van hepatocyten, waardoor donorcelresidentie en -proliferatie mogelijk wordt12. Hoewel muizenhepatocyten in eerdere studies met succes zijn getransplanteerd in Alb-TRECK/SCID muizen13,14, is de generatie van een gehumaniseerde lever met behulp van Alb-TRECK/SCID muizen nog niet gerapporteerd. 
In deze studie werden gehumaniseerde leveren in Alb-TRECK/SCID muizen gegenereerd via transplantatie van HpSCs. Deze gehumaniseerde lever biedt een in vivo omgeving voor universele stamceldifferentiatie en de mogelijkheid om menselijke drugsmetabolismepatronen en interacties tussen geneesmiddelen te voorspellen.

<table><tbody><tr><td>Human albumin</td><td>Sigma</td><td>A6684</td><td>Muis</td></tr><tr><td>Human CK19</td><td>Dako</td><td>M088801</td><td>Muis</td></tr><tr><td>Human nuclei</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Muis</td></tr><tr><td>Human CK8/18</td><td>Progen</td><td>GP11</td><td>Mare</td></tr><tr><td>CDCP1</td><td>Biolegend</td><td>324006</td><td>Muis</td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>559869</td><td>Muis</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>551479</td><td>Muis</td></tr><tr><td>GOT/AST-PIII</td><td>Fujifilm</td><td>14A2X10004000009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Diphtheria Toxin</td><td>Sigma</td><td>D0564-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Human Albumin ELISA Kit</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Spuit (1 ml)</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>32G 1/2" naald</td><td>TSK</td><td>PRE-32013</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound(118 ml)</td><td>Sakura Finetek Japan</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo hoge snelheid celsorteerder</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>DRI-CHEM 7000</td><td>Fujifilm</td><td>14B2X10002000046</td><td></td></tr></tbody></table>

genereren van een gehumaniseerd muis lever met behulp van menselijke lever stamcellen

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Een nieuw diermodel met chimerische muizen met gehumaniseerde leveren, gevestigd via transplantatie van menselijke hepatocyten, is ontwikkeld. Deze muizen, waarbij de lever is herbevolkt met functionele menselijke hepatocyten, kunnen dienen als een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van menselijke hepatische celbiologie, geneesmiddelmetabolisme en andere preklinische toepassingen. Een van de belangrijkste factoren die vereist zijn voor succesvolle transplantatie van menselijke hepatocyten in muizen is het elimineren van de endogene hepatocyten om concurrentie met de menselijke cellen te voorkomen en een geschikte ruimte en micro-omgeving te bieden voor het bevorderen van de expansie en differentiatie van donorcellen van mensen. Tot nu toe zijn er twee belangrijke muismodellen met leverbeschadiging gevestigd met behulp van fumarylacetoacetaat hydrolase (Fah) en uroplasminogeen activator (uPA) muizen. Echter, Fah-muizen worden voornamelijk gebruikt met volwassen hepatocyten en de toepassing van het uPA-model wordt beperkt door verminderde fok. Om deze beperkingen te overwinnen, werden Alb-toxine receptor gemedieerde cel knockout (TRECK)/SCID-muizen gebruikt voor in vivo differentiatie van onvolgroeide menselijke hepatocyten en de generatie van gehumaniseerde leveren. Menselijke hepatische stamcellen (HpSCs) hebben met succes de leveren van Alb-TRECK/SCID-muizen herbevolkt die een dodelijke fulminante leverfalen hadden ontwikkeld na behandeling met difterietoxine (DT). Dit model van een gehumaniseerde lever in Alb-TRECK/SCID-muizen zal functionele toepassingen hebben in studies met geneesmiddelmetabolisme en interacties tussen geneesmiddelen en zal andere in vivo en in vitro studies bevorderen.

Alb-treck / SCID-muizen hepatocyten uiten het menselijk DT-receptor HB-EGF-gen onder de controle van een albumine promoter en cytotoxische effecten vertonen na toediening DT 12. Om de effecten van DT behandeling op leverbeschadiging evalueren, werden DT doses van 1,5 gg / kg geïnjecteerd in 8 weken oude Alb-treck / SCID-muizen en aandoeningen van lever 48 uur na toediening DT werden histologisch beoordeeld. Vergeleken met controlemuizen (niet behandeld met DT), de DT-behandeld...

Hier presenteren we een nieuw model van een gehumaniseerde muizenlever, gegenereerd in Alb-toxinereceptor-gemedieerde cel-knockout (TRECK)/SCID-muizen na de transplantatie van onvolgroeide en uitbreidbare menselijke hepatische stamcellen.

Genereren van een gehumaniseerd muis lever met behulp van menselijke lever stamcellen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Het algemene doel van deze chirurgische stamceltransplantatieprocedure is het genereren van een nieuw chimeer muismodel met menselijke leverfuncties, gebruikmakend van menselijke onrijpe hepatische stamprogenitorcellen die celproliferatie, rijping en differentiatie mogelijk maken voor de verwerving van geneesmiddelenmetabolisme. Deze methode biedt een krachtig instrument voor het creëren van een micro-omgeving die de progenese van menselijke donor-hepatische stamcellen ondersteunt om uit te breiden, te differentiëren en de beschadigde lever van de muis-recipient te reconstitueren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat gerijpte geprolifereerde cellen kunnen worden gebruikt en dat de lever bijna volledig wordt herbevolkt.Begin met het maken van een voorraadoplossing van difterietoxine (DT) van 1 mg/mL door 1 mL gefenoliseerde 0,85% natriumchloride-oplossing toe te voegen aan 1 mg DT. Voer een intraperitoneale injectie van DT uit door een albtrek scid-muis in rugligging vast te houden en, onder de knik van de knieën links of rechts van de middellijn, de naald in een hoek van 45 graden ten opzichte van het lichaam in te brengen. Injecteer met een insulinespuit 100 µL vers bereide 0,3 µg/mL DT per 20 gram muis. 48 uur na de DT-injectie plaatst u de muis in een fixatieapparaat en warmt u de staart ongeveer 10 minuten op in een waterbad van 30 °C om de bloedvaten te dilateren.Maak vervolgens, twee centimeter vanaf de punt van de staart, met een scherp scalpelmesje een inkeping van één millimeter in de staart en gebruik een capillaire buis om het bloed op te vangen. Centrifugeer de microcapillaire buis met het bloed bij 1500 ×g gedurende vijf minuten en verzamel het serum door het supernatant van het celpellet te scheiden. Pipetteer 50 µL van een 1:20 verdunning van het serum op GOT ASTP3-dia's.Meet vervolgens de absorbentie van het reactieproduct bij 650 nanometer met een multifunctionele automatische droge chemie-analyzer volgens het protocol van de fabrikant. Isoleer met een cel sorter humane hepatische stamcellen uit humane primaire foetale levercellen met de celantigenen CDCP1, CD90 en CD66 om een CDCP1-positieve, CD90-positieve, CD66-negatieve subpopulatie te verkrijgen. Zaai de cellen uit op met collageen IV gecoate kweekschaaltjes en incubeer deze bij 37 °C.Wanneer de cellen een confluentie van 80 tot 90% bereiken, worden de cellen eenmaal gewassen met PBS. Voeg vervolgens 0,05% Trypsin EDTA toe en incubeer dit bij kamertemperatuur. Wanneer de cellen onder een microscoop lijken te zweven of vrij bewegen, wordt de enzymatische digestie gestopt door acht milliliter DMF12 met 10% FBS toe te voegen.Resuspendeer de cellen voorzichtig met een serologische pipette van 10 milliliter voordat u ze overbrengt naar een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de cellen bij 100 ×g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Resuspendeer de celpellet voorzichtig met 10 milliliters DMF12 met 10% FBS en bepaal het aantal cellen met een celteller.Verdeel de cellen in aliquots van 1 × 10⁶ cellen per 50 µL PBS voor elke muis en bewaar deze op ijs tot de transplantatie. Controleer na het anesthetiseren van een muis volgens het tekstprotocol op een reflex door zachtjes in het kussentje van de achterpoot te knijpen. Breng vervolgens veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.Scheer de chirurgische plaats met een elektrische trimmer en breng 70% ethanol en povidonjodium aan om te desinfecteren. Maak een huidincisie van één centimeter in de linkerflank, net onder de costale rand van de ribben. Maak vervolgens een incisie in de linker buikwand, gevolgd door een incisie in het peritoneum.Leg vervolgens de milt voorzichtig bloot. Steek daarna, onder een hoek van vijf graden, een micro-injectiespuit van 100 µL met een 32 gauge naald van een halve inch in tot een diepte van de helft van de dikte van de milt. Injecteer 1 × 10⁶ humane hepatische stamcellen in 50 µL PBS direct door het orgaan, van het ene uiteinde naar het andere, en verwijder vervolgens de naald. Om lekkage van de cellen na injectie te voorkomen, wordt met een vinger gedurende twee minuten voorzichtig druk uitgeoefend.Plaats de milt terug in het lichaam van de muis en gebruik een normale doorlopende hechting voor de musculatuur en de huid om de holte te sluiten. Plaats de muis onmiddellijk op zijn zij in een voorverwarmde kooi van 37 °C. Voorkom contact tussen de kooi-bedding en de operatieve plek en monitor het dier volgens het tekstprotocol.Vier tot zes weken na transplantatie, nadat de muis volgens het tekstprotocol is geëuthanaseerd, opent u de buikholte met een chirurgische schaar door de huid en fascia gelijktijdig door te snijden. Gebruik de schaar als spreider om het bindweefsel boven het peritoneum langs de linea alba te dissekeren en zo de peritoneale holte te openen. Til het sternum op met een pincet.Doorboor vervolgens het diafragma en snijd aan beide zijden van het sternum tot aan de cervicale gordel. Sever de vena cava aan de thoracische zijde van de lever en trek de slokdarm in anterieure richting door de lever. Verwijder het diafragma en trek, met het diafragma als handgreep, de lever uit de buikholte.De vena cava inferior houdt de lever op zijn plaats. Snijd daarom de vena cava inferior door, waarbij u er zorg voor draagt de rechterbijnier niet voortijdig vrij te maken. Scheid de leverloben van elkaar bij de overgangen en bed ze in OCT volgens het protocol van de fabrikant.Bevries het OCT met het leverweefsel in de metalen roosters op de cryostaat. Snijd met de cryostaat monstersecties van vijf micrometer dikte bij minus 18 °C en monteer deze op microscoopglaasjes op kamertemperatuur. Bewaar de voorraad bij minus 80 °C.Bereid ten slotte de coupes voor H&amp;E-kleuring volgens eerder beschreven procedures en de ELISA volgens het tekstprotocol. Zoals te zien is in deze H&amp;E-gekleurde coupes, vertoonden DT-behandelde muizen een gedesorganiseerde hepatische architectuur en een correctie voor congestie met een verhoogde serum-AST-activiteit. Zes weken na transplantatie herstelden de uit menselijke hepatische stamcellen afgeleide cellen de leverstructuur door de aanwezige muishepatocyten te vervangen.Macroscopisch gezien werden vier dagen na transplantatie kleine menselijke hepatische clusters gedetecteerd die uniform over de lever waren verdeeld. Na 45 dagen waren deze clusters geprolifereerd tot grote clusters. Zoals hier te zien is, werd de aanwezigheid van menselijke hepatocyten in muizenlevers voor het eerst bevestigd zes weken na transplantatie door kleuring met antilichamen tegen menselijke kernen en cytokeratine 8/18.Menselijke ALB-positieve en CK19-negatieve hepatocyten vertoonden gelijkenissen met functionele hepatocyten, terwijl cellen die positief co-kleurden voor menselijk ALB en CK19 een bipotentieel vermogen vertoonden om te differentiëren tot hepatocyten en cholangiocyten. De aanwezigheid van meerdere ronde clusters rondom de leverkwabben met duidelijke menselijke kernen en CK8/18-expressie werd gedetecteerd, wat het kolonie-vormende vermogen van menselijke hepatische stamcellen in de gehumaniseerde levers aantoont. Ten slotte bereikte het herbevolkingsniveau tot 90% één maand na transplantatie en werd de secretie van menselijk albumine gedetecteerd in de herbevolkte muizenlevers.Zodra de techniek beheerst is, kan chirurgische celtransplantatie in 10 minuten worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat leverschade beperkt blijft tot de lever van de donor. Bij cellekage moet celtransplantatie worden voorkomen.In combinatie met deze procedure kunnen andere methoden, zoals gentransfectie voor in vivo directe herprogrammering met menselijke cellen, worden uitgevoerd om de convergentie van menselijke cellen met ons huidige model te onderzoeken. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de hepatologie om het menselijke medicijnmetabolisme, geneesmiddelinteracties, hepatische toxiciteit en het hepatitisvirus te bestuderen in een gehumaniseerd levermodel. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u hepatische stamcellen isoleert en expandeert, leverbeschadiging induceert en cellen via de milt transplanteert om een chimeer muismodel met menselijke leverfunctie te genereren.Vergeet niet dat difterietoxine beheerst kan worden en dat belangrijke voorzorgsmaatregelen, zoals het vermijden van necrose van het hart en de lever, altijd in acht moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

generation-of-a-humanized-mouse-liver-using-human-hepatic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

Het genereren en karakteriseren van tumorspecifieke T-cellen met gehumaniseerde muizen wordt hier beschreven. Human thymusweefsel en genetisch gemodificeerde humane hematopoietische stamcellen worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen. Dit resulteert in de bereiding van een op menselijke immuunsysteem waardoor in vivo onderzoek van anti-tumor immuunrespons.

Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

This video demonstrates a method for generating a dual humanized mouse model with a human immune system and liver cells. It involves transplanting human liver cells and hematopoietic stem and progenitor cells into a transgenic immunodeficient mouse via intrasplenic injection, leading to engraftment of liver cells and development of human immune cells.

Developing a Humanized Mouse Model with Human Liver Cells and Immune Cells

Menselijke tumorxenotransplantaten in immunodeficiënte muizen zijn waardevolle instrumenten om kanker biologie studeren. Specifieke protocollen voor subcutane en intrahepatische xenograften uit menselijke hepatocellulair carcinoom cellen of tumorfragmenten genereren worden beschreven. Leverregeneratie geïnduceerd door gedeeltelijke hepatectomie in ontvangende muizen wordt gepresenteerd als een strategie om intrahepatische engraftment vergemakkelijken.

Generatie van subcutane en Intrahepatic Human Hepatocellular carcinoom Xenografts in immunodeficiënte muizen

Dit protocol beschrijft de methoden voor het construeren van een gehumaniseerd muismodel voor beenmerg/lever/thymus met stamcelgebaseerde geëngineerde immuniteit tegen HIV-infectie.

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een menselijke lever chimeer muismodel van familiale hypercholesterolemie met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten. Dit is een waardevol model voor het testen van nieuwe therapieën voor hypercholesterolemie.

Een familiale hypercholesterolemie menselijke lever chimeer muismodel met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten

Dit protocol beschrijft een semi-automatische aanpak voor de productie van de hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen in de indeling van een 96 goed plaat. Dit proces is snelle en kostenefficiënte, waardoor dat de productie van kwaliteit verzekerd batches van hepatocyte-achtige cellen voor fundamenteel en toegepast menselijke onderzoek.

Semi-automatische productie van Hepatocyte als cellen uit pluripotente stamcellen

Dit protocol biedt een betrouwbare methode om gehumaniseerde muizen te vestigen met zowel menselijk immuunsysteem als levercellen. Dubbele gereconstitueerde immunodeficiënte muizen bereikt via intrasplenische injectie van humane hepatocyten en CD34+ hematopoietische stamcellen zijn vatbaar voor humaan immunodeficiëntie virus-1 infectie en even leverschade zoals waargenomen in HIV-geïnfecteerde patiënten.

Oprichting van de dubbele gehumaniseerde TK-nog muis model voor HIV-geassocieerde lever pathogenese

Orthotopic humane lever gemetastaseerde ukalfs melanoom xenotransplantaatmodellen is Muismodellen werden gemaakt met behulp van chirurgische orthotopic implantatie technieken met patiënt-afgeleide tumor Brok en naald injectietechnieken met gekweekte menselijke ukalfs melanoom cellijnen.

Generatie van een lever Orthotopic humaan Ukalfs melanoom xenograft platform in Immunodeficiënte muizen

Hier presenteren we een niet-genetische methode om menselijke autologe leversferoïden te genereren met behulp van mononucleaire cellen geïsoleerd uit steady-state perifeer bloed.

Humane leversferoïden uit perifeer bloed voor leverziektestudies

Leer hoe je een gehumaniseerde muizenlever genereert met menselijke leverstamcellen via splenische transplantatie. Deze methode creëert een chimerisch model voor onderzoek naar humane leverfunctie en geneesmiddelmetabolisme.

Genereren van een gehumaniseerd muis lever met behulp van menselijke lever stamcellen

Meer video's verkennen