Generatie Parabiotic zebravis embryo's door Surgical Fusion of Developing Blastulae

Het algemene doel van deze methode is het genereren van parabiotische zebravis embryo's, die kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van intrinsieke versus extrinsieke celfuncties voor genkandidaten van belang. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over celautonomie. Bijvoorbeeld, in het hematopoëtische systeem, zijn vitale defecten in HSC-migratie intrinsiek voor de HSC's of het nis-micro-omgeving.

Het belangrijkste voordeel van dit protocol is een verbeterde mogelijkheid om met succes parabiotische zebravis embryo's te genereren. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen, omdat de zich ontwikkelende embryo's uiterst kwetsbaar zijn en gemakkelijk beschadigd raken. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de chirurgische stap van het naaien moeilijk te leren is omdat ze een hoge mate van nauwkeurigheid en precisie vereisen.

Hier bieden we stapsgewijze instructies om parabiotische zebravis embryo's te genereren door chirurgische fusie van zich ontwikkelende blastula's. Deze methode laat zien hoe de efficiëntie van parabiotische fusies kan worden verhoogd en de overleving van samengestelde embryo's kan worden verbeterd. Na het voorbereiden van reagentia en gereedschappen volgens het tekstprotocol, bereid twee tot drie gemodificeerde Pasteur-pipetten voor door het uiteinde van de pijp kort te verwarmen boven een Bunsen-brander.

Gebruik vervolgens, met behulp van grote pincetten, terwijl het nog warm is, het uiteinde van de pijp ongeveer 45 graden te buigen. Om ervoor te zorgen dat er geen scherpe randen zijn die de embryo's kunnen beschadigen, houd het uiteinde van de pijp gedurende één tot twee seconden boven een Bunsen-brander. Gebruik plasma-DNA, mRNA of morpholino om embryo's binnen een uur na verzameling micro-injecteren, en laat ze zich ontwikkelen tot het 256-celstadium.

Terwijl de embryo's het 256-celstadium naderen, breng elk genetisch achtergrond over in afzonderlijke agarose-gecoate schalen, krasvrije glazen bekers of petrischalen. Na het dechorioneren van de embryo's volgens het tekstprotocol, ontdooi eerder bereide methylcellulose en gebruik een tafelcentrifuge op maximale snelheid om onopgeloste kristallen te pelletten, die de embryo's kunnen beschadigen of de dooiers kunnen scheuren. Gebruik ondertussen een marker om 12 tot 15 vooraf bepaalde plekken op de onderkant van een 100 milliliter agarose-gecoate petrischaal te markeren.

Na centrifugatie, gebruik de heldere bovenste fractie van de methylcellulose om één tot 1,5 centimeter druppels over te brengen naar de gemarkeerde plekken in de petrischaal. Bereid vervolgens een 40 milliliter aliquot van hoog-calcium ringer of HCR-oplossing per zojuist bereide agarose-gecoate schaal voor. Voeg aan elk aliquot antibiotica toe zoals hier vermeld.

Wanneer u klaar bent om blastula-fusies uit te voeren, gebruik de aliquots van HCR met antibiotica om voorzichtig elke schaal met de methylcellulose druppels te vullen, zorg ervoor dat de druppels niet worden verstoord. Bevestig een eerder bereide gemodificeerde glazen Pasteur-pijp, voorbereid aan een 10 milliliter pijp-pomp. Verzamel vervolgens, onder een stereoscoop, één dechorioneerd embryo uit elke achtergrond.

Voordat u de twee embryo's afgeeft, gebruik de Pasteur-pijp om een kleine inkeping te maken in het midden van de methylcellulose druppel. Deponeer vervolgens de twee embryo's in de inkeping. Gebruik nu een tweelingsnaald met een gel-laadtip aan het uiteinde, gebruik zacht zwaaiende bewegingen zonder de embryo's direct aan te raken om de embryo's voorzichtig opnieuw te positioneren in de methylcellulose, zodat hun dierlijke polen elkaar direct aanraken.

Het correct oriënteren van de zich ontwikkelende embryo's bepaalt hoe de embryo's zullen fuseren en zich ontwikkelen. Voor kop-aan-kop fusies, zorg ervoor dat elke fusie op hun dierlijke polen is uitgelijnd. Laat de embryo's vijf minuten zitten om de methylcellulose rond hen te laten bezinken.

Gedurende deze tijd, laad het volgende paar in een andere druppel. Om de chirurgie uit te voeren, gebruik de glazen naald om voorzichtig elk embryo op hun contactpunt te verwonden. Trek vervolgens, met een zachte naaisteek, de cellen van het eerste embryo in het tweede embryo en weer terug.

Aan het einde van de beweging, houd de naald twee tot drie seconden op zijn plaats voordat u deze heel langzaam weg trekt. Nauwkeurigheid met de glazen naald is cruciaal om ervoor te zorgen dat de embryo's goed met elkaar zijn gestikt. Zorg ervoor dat de dooiers niet worden beschadigd, terwijl voldoende verbinding wordt gehandhaafd voor een succesvolle fusie.

Laat de embryo's 10 tot 15 minuten op kamertemperatuur zitten. In de tussentijd, naai extra paren embryo's. Na de incubatie, beoordeel of de embryo's aan elkaar zijn gebleven, en herhaal de verwondingsstap indien nodig.

Incubeer de embryo's in dezelfde schaal en medium bij 28,5 graden Celsius gedurende de nacht. Tegen de volgende ochtend zullen de embryo's uit de grotendeels opgeloste methylcellulose zijn bewogen. Verwijder eventuele embryo's die niet met succes zijn gefuseerd.

Decant vervolgens het medium en gebruik 25 milliliter E3 om het te vervangen. Om beelden van de gefuseerde embryo's te verkrijgen, bereid 0,8% lage smeltpunt agarose voor. Terwijl het nog heet is, doseer 1 milliliter van de agarose in 1,5 milliliter microfuge buisjes die in een 37 graden Celsius verwarmingsblok staan.

Verdoofd de parabiotische embryo's door een milliliter van vier milligram per milliliter pH 7,0 tricaine toe te voegen aan de 25 milliliter E3-medium met de embryo's. Zwaai voorzichtig met de schaal zodat de embryo's zich in het midden verzamelen. Gebruik vervolgens een breed-tip plastic overdrachtspijp om de embryo's op met zo min mogelijk vloeistof op te nemen.

Keer vervolgens de pijp omhoog en laat de embryo's voorzichtig vallen, zodat ze zich op de bodem van de pijp nestelen. Breng vervolgens de embryo's over naar een