Generatie Parabiotic zebravis embryo's door Surgical Fusion of Developing Blastulae

Het algemene doel van deze methode is het genereren van parabiotische zebravissenembryo's, die kunnen worden gebruikt om cel-intrinsieke versus cel-extrinsieke functies van kandidaatgenen van belang te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over celautonomie. Zo kan in het hematopoëtische systeem worden bepaald of essentiële defecten in de migratie van HSC's intrinsiek zijn aan de HSC's of aan de niche-micro-omgeving.

Het belangrijkste voordeel van dit protocol is een verbeterde mogelijkheid om succesvol parabiotische zebravissenembryo's te genereren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de ontwikkelende embryo's uiterst fragiel zijn en gemakkelijk beschadigd raken. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de chirurgische hechtstappen moeilijk aan te leren kunnen zijn omdat ze een hoge mate van nauwkeurigheid en precisie vereisen.

Hier bieden we stapsgewijze instructies om parabiotische zebravisembryo's te genereren door chirurgische fusie van ontwikkelende blastulae. Deze methode demonstreert hoe de efficiëntie van parabiotische fusies kan worden verhoogd en het overlevingspercentage van samengevoegde embryo's kan worden verbeterd. Nadat de reagentia en instrumenten volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, bereid je twee tot drie gemodificeerde Pasteur-pipetten voor door het uiteinde van de pipet kort te verhitten boven een Bunsenbrander.

Buig vervolgens, terwijl de pipet nog heet is, het uiteinde met een grote pincet ongeveer 45 graden. Houd het uiteinde van de pipet één tot twee seconden boven een Bunsenbrander om er zeker van te zijn dat er geen scherpe randen zijn die de embryo's kunnen beschadigen. Micro-injecteer de embryo's binnen één uur na verzameling met plasma DNA, mRNA of morpholino, en laat ze uitgroeien tot het 256-cellige stadium.

Zodra de embryo's het 256-celstadium naderen, brengt u elk genetische achtergrond over naar afzonderlijke met agarose gecoate schaaltjes, krasvrije glazen bekerglazen of petrischalen. Nadat de embryo's volgens het tekstprotocol zijn gedechorioneerd, ontdooit u vooraf bereide methylcellulose en gebruikt u een tafelcentrifuge op maximale snelheid om onopgeloste kristallen te pelletteren, aangezien deze de embryo's kunnen beschadigen of de dooiers kunnen doen scheuren. Markeer ondertussen met een stift 12 tot 15 vooraf bepaalde posities op de bodem van een met agarose gecoate petrischaal van 100 milliliter.

Breng vervolgens, na centrifugatie, met behulp van de heldere bovenste fractie van de methylcellulose druppels van 1,5 centimeter over naar de gemarkeerde plekken in de petrischaal. Bereid daarna per zojuist geprepareerde agarose-gecoate schaal één aliquot van 40 milliliter hoog-calcium Ringer, oftewel HCR-oplossing. Voeg aan elke aliquot antibiotica toe zoals hier vermeld.

Wanneer u klaar bent om blastulafusies uit te voeren, gebruikt u de aliquots van HCR met antibiotica om voorzichtig elke schaal met methylcellulose-druppels te vullen, waarbij u er op let de druppels niet te verstoren. Bevestig een eerder voorbereide gemodificeerde glazen Pasteurpipet aan een pipetpomp van 10 milliliter. Verzamel vervolgens, onder een stereoscoop, één gedechoreoneerd embryo van elke genetische achtergrond.

Voordat de twee embryo's worden overgebracht, gebruikt u de Pasteur-pipet om een kleine inkeping in het midden van de methylcellulose-druppel te maken. Plaats vervolgens de twee embryo's in de inkeping. Gebruik nu een dissectienaald met een gel-laadpunt aan het uiteinde en maak voorzichtig vegende bewegingen, zonder de embryo's direct aan te raken, om de embryo's binnen de methylcellulose zorgvuldig te repositioneren, zodat hun animalpolen elkaar direct raken.

Het correct oriënteren van de ontwikkelende embryo's bepaalt hoe de embryo's zullen fuseren en zich zullen ontwikkelen. Zorg er bij kop-aan-kopfusies voor dat elke fusie is uitgelijnd bij hun animale polen. Laat de embryo's vijf minuten rusten zodat de methylcellulose zich rondom hen kan stabiliseren.

Laad tijdens deze tijd het volgende paar in een andere druppel. Om de operatie uit te voeren, dient u met het glazen naaldinstrument elke embryo voorzichtig te verwonden op het contactpunt. Trek vervolgens met een zachte naaiende beweging de cellen van het eerste embryo in het tweede embryo en weer terug.

Houd aan het einde van de beweging de naald twee tot drie seconden op zijn plaats voordat u deze zeer langzaam terugtrekt. Precisie met de glazen naald is cruciaal om ervoor te zorgen dat de embryo's correct aan elkaar worden gehecht. Er moet voorzichtig worden gewerkt om beschadiging van de dooierzakken te voorkomen, terwijl voldoende verbinding behouden blijft voor een succesvolle fusie.

Laat de embryo's 10 tot 15 minuten rusten bij kamertemperatuur. Hecht in de tussentijd extra paren embryo's. Beoordeel na de incubatie of de embryo's bevestigd zijn gebleven en herhaal indien nodig de stap met het toebrengen van de wond.

Incubeer de embryo's in dezelfde schaal en hetzelfde medium bij 28,5 °C gedurende de nacht. De volgende ochtend zullen de embryo's zich buiten de grotendeels opgeloste methylcellulose hebben bewogen. Verwijder alle embryo's die niet succesvol zijn gefuseerd.

Giet vervolgens het medium af en vervang dit door 25 milliliters E3. Om beelden van de gefuseerde embryo's te verkrijgen, wordt 0,8% agarose met een laag smeltpunt voorbereid. Verdeel, terwijl de agarose nog warm is, 1 milliliter van de agarose over 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes die in een verwarmingsblok van 37 °C zijn geplaatst.

Anestheseer de parabiotische embryo's door één milliliter tricaine (4 mg/mL, pH 7,0) toe te voegen aan de 25 milliliter E3-medium waarin de embryo's zich bevinden. Draai de schaal voorzichtig rond zodat de embryo's zich in het midden verzamelen. Zuig vervolgens, met behulp van een plastic transferpipet met een brede tip, de embryo's op met zo min mogelijk vloeistof.

Zet de pipet vervolgens rechtop en tik voorzichtig tegen de pipet zodat de embryo's naar de bodem zakken. Breng de embryo's daarna over naar een aliquot van 1 milliliter laagsmeltende agarose door de tip van de pipet lichtjes op het oppervlak van de agarose te plaatsen. Verwijder eventueel overtollige vloeistof uit de pipet en gebruik de pipet om de embryo's voorzichtig in de agarose te mengen.

Breng vervolgens met de pipet de agarose en de embryo's over naar de put van een glazen bodem zes-wells plaat. Gebruik onder een stereomicroscoop een gel-laadpunt dat aan het uiteinde van een dissectie-naald is bevestigd om de embryo's dicht bij het dekglas en in de gewenste oriëntatie voor beeldvorming te positioneren. Nadat de agarose is gestold en medium met tricaine aan de putten is toegevoegd, wordt een omgekeerde widefield epifluorescence laser scanning confocale of spinning disk confocale microscoop gebruikt om beelden te verkrijgen.

Gebruik een 4X objectief voor een gezichtsveld van het gehele embryo. Gebruik een 20X objectief om een specifiek weefsel af te beelden. Verwerk de beelden volgens het tekstprotocol.

Zoals hier wordt getoond, werden de embryo's na het oriënteren van twee blastulae met hun animale polen naar elkaar toe, voorzichtig gewond op het contactpunt. Een grotere mate van verwonding verhoogde de waarschijnlijkheid dat de embryo's een verbinding behielden die resulteerde in een succesvolle fusie zonder aanvullende morfologische defecten of vertraagde ontwikkeling. Zoals in deze figuur wordt gedemonstreerd, werden door het oriënteren van de twee blastulae met hun animale polen direct uitgelijnd, betrouwbare kop-aan-kop of dooierzak-aan-dooierzak fusies gegenereerd met een gedeelde circulatie.

In de meeste gevallen hadden de embryo's twee harten die een gemeenschappelijke circulatie aanstuurden. Om te bevestigen dat de embryo's inderdaad hun circulatie deelden, werden gefuseerde transgene embryo's met GFP-positieve erytrocyten gefuseerd met embryo's met mCherry-positieve vasculaire endotheelcellen. Zoals in deze film te zien is, werd er 48 uur na bevruchting waargenomen dat GFP-positieve erytrocyten circuleerden door het Flik 1 HRAS mCherry partnerembryo.

Ten slotte, om de temporele controle van genexpressie te onderzoeken, werd een van de twee embryo's geïnjecteerd met een hsp70 EGFP DNA-construct. Na een korte hitteshock van 30 minuten bij 37 °C werd er een duidelijk GFP-signaal vastgesteld in een van de embryo's, en in sommige gevallen werden GFP-positieve cellen waargenomen die circuleerden in het niet-geïnjecteerde partnerembryo. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vijf uur worden uitgevoerd indien deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig te zijn bij het hechten van de twee blastulae, en om fusers opnieuw te benaderen als de chirurgische ingreep bij de eerste poging niet succesvol was. Na deze procedure kunnen aanvullende methoden, zoals live-cell imaging, worden gebruikt om verdere vragen te beantwoorden, zoals of wild-type HSC's normaal kunnen functioneren in een mutante niche of omgekeerd, of mutante HSC's kunnen functioneren in een wild-type niche. Deze techniek biedt een krachtige methode voor onderzoekers in het veld van de hematologie om de regulatie van de bloedontwikkeling bij zebravissen te bestuderen.

Vergeet niet dat tricaine gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van passende veiligheidskleding, tijdens het uitvoeren van deze procedure. Na het bekijken van deze video en het volgen van onze aanbevolen technieken, hopen we dat u met meer succes betere biotische zebravissenembryo's zult kunnen genereren.