Een celvrij Assay met behulp van

Het algemene doel van deze procedure is om extracten van Xenopus-eicellen en embryo's te gebruiken voor het opzetten van een assay waarin grote celkernen krimpen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de nucleaire celbiologie, zoals: wat zijn de mechanismen die de grootte van de kern reguleren? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de samenstelling en activiteiten van het celvrije Xenopus-extract eenvoudig kunnen worden gemanipuleerd om de feiten over de kerngrootte te beoordelen.

Nadat de Xenopus-ielextracten, gedemembraneerde spermacellen en geassembleerde kernen zijn voorbereid volgens het tekstprotocol, worden vers gelegde eitjes verzameld door kikkers boven een glazen, herbruikbare Petrischaal te houden. Stimuleer de eiafzetting door voorzichtig druk uit te oefenen op de onderrug nabij de cloaca. Zet de schaal onder een hoek van ongeveer 45 graden om de eitjes langs de rand van de schaal te laten verzamelen.

Verwijder vervolgens het overtollige buffer en voeg voldoende one-third X MMR toe om de eitjes net te bedekken. Verslijm en homogeniseer met een nauwsluitende stamper 1/4 van een testis in een 1,5 milliliter buisje met 500 microliters high-salt Modified Barth's Saline, of MBS. Voeg vervolgens de verslijmde testis toe aan de eitjes en laat de bevruchting 15 minuten lang plaatsvinden bij kamertemperatuur.

Vul na de incubatie de eitjes aan met een derde X MMR. Controleer vervolgens na vijf tot 10 minuten of de bevruchting is geslaagd door te kijken naar de contractie van de donkergepigmenteerde animalpool en door de embryo's te roteren zodat hun animalpolen naar boven wijzen. Verwijder nauwgezet dode, gelyseerde of onbevruchte, niet-gedeelde eitjes met een plastic pipet met een wijde opening, aangezien deze snel de dood van naburige embryo's zullen veroorzaken.

Verwijder de gelei van de embryo's tussen één en 2,5 uur na bevruchting in twee tot drie procent cysteïne opgelost in een derde X MMR, waarbij de pH is bijgesteld naar 7,9. Vóór het verwijderen van de gelei bevinden de embryo's zich in een relatief groot volume. Voer twee bufferwisselingen uit van telkens drie tot vier minuten.

Was daarna de embryo's grondig met zes tot 10 korte spoelingen met een derde X MMR om alle resten cysteïne te verwijderen. Na het ontdoen van de gelei zitten de embryo's dicht op elkaar gepakt en nemen ze een relatief klein volume in. Breng vervolgens met een glazen pipet met een wijde opening de gezonde, bevruchte embryo's over naar een Petrischaal met verse een derde X MMR.

Laat ze bij kamertemperatuur verder ontwikkelen tot het gewenste stadium. Verwijder doodgeslagen of gelyseerde embryo's, herkenbaar aan het uitblijven van de eerste deling of een wit, opgezwollen uiterlijk. Wanneer de embryo's stadium 11,5 tot 12 hebben bereikt, worden ze overgebracht naar vers een-derde X MMR aangevuld met 0,5 millimolair cycloheximide en worden de embryo's gedurende één uur bij kamertemperatuur geïncubeerd om ze in de late interfase te arresteren.

Breng met een glazen of plastic pipet met een wijde opening minimaal 15 embryo's die in de interfase zijn gearresteerd over naar een microcentrifugebuisje. Voeg één milliliter ei-lysisbuffer, of ELB, aangevuld met één microliter LPC-stamoplossing, toe aan de embryo's. Keer het buisje voorzichtig om om de embryo's te wassen.

Laat de embryo's vervolgens naar de bodem van de buis zakken. Voordat de buffer wordt verwijderd, wordt de wasstap nog twee keer herhaald. Resuspendeer de embryo's in 500 µL ELB, aangevuld met 0,5 µL LPC-stock, 5 µL 19,7 mM cycloheximide en 5 µL 35,5 mM cytochalasin D om actinpolymerisatie te remmen.

Centrifugeer de monsters in een tafelcentrifuge bij 200 ×g gedurende één minuut, verwijder vervolgens de overtollige buffer en gebruik een vijzel om de embryo's grondig te verbrijzelen. Plaats de verbrijzelde monsters in een swing-out rotor en centrifugeer bij 10.000 ×g en 16 °C gedurende 10 minuten. Doorboor met een 200 µL pipetpunt de lipidenlaag aan de bovenzijde en verwijder met een schone pipetpunt de middelste, barnsteelkleurige cytoplasmatische laag naar een passende buis.

Vul het embryo-extract aan met de volgende reagentia. Keer de buis vervolgens voorzichtig om om te mengen. Nadat de endogene embryonale kernen in het extract zijn gevisualiseerd door een squash-preparaat te maken volgens het tekstprotocol, worden de kernen uit het extract verwijderd door eerst een gelijk volume ELB toe te voegen dat de hier vermelde reagentia bevat.

Keer de buis voorzichtig om om te mengen. Centrifugeer het monster in een swinging-bucket-rotor bij 17 000 xg bij 16 °C gedurende 15 minuten. Verzamel vervolgens het supernatant, waarbij u er zorg voor draagt om eventuele resterende lipiden aan de bovenkant te vermijden, en laat de gepelletteerde kernen onderin ongemoeid.

Bereid een squash voor zoals beschreven in het tekstprotocol om er zeker van te zijn dat de meeste kernen zijn verwijderd. Gebruik vervolgens het verse extract, of verdeel het monster in aliquots en bewaar deze bij min 80 graden Celsius. Isoleer kernen die zijn samengesteld in eiextract door 25 tot 150 µL van de vooraf samengestelde kernen te verdunnen in 1 mL ELB in een 1,5 mL buis.

Centrifugeer bij 1600 ×g en vier graden Celsius gedurende drie minuten. Verwijder vervolgens de buffer, waarbij u erop let dat de pellet niet wordt verstoord. Voeg aan de pellet een volume embryo-extract toe dat gelijk is aan het oorspronkelijke volume eiextract, en tik voorzichtig tegen de buis om de pellet op te breken en de kernen te resuspenderen.

Incubeer gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur en tik elke 15 tot 30 minuten voorzichtig tegen de buis om te mengen. Tik na de incubatie tegen de buis om de kernen opnieuw te suspenderen, vlak voordat u 500 µL ELB met 15% glycerol en 2,6% paraformaldehyde toevoegt. Keer de buis onmiddellijk om en plaats de buis gedurende 15 minuten op een rotator bij kamertemperatuur.

Bereid spin-down buisjes voor door 15 milliliter rondeglazen buisjes te voorzien van plastic ronde inzetstukken. Voeg 5 milliliter kernkussenbuffer toe en laat vervolgens een cirkelvormig dekglas van 12 millimeter in het buisje vallen, waarbij u erop let dat dit plat op het plastic inzetstuk ligt. Breng met een pipetteertip met een wijde opening de gefixeerde kernoplossing voorzichtig in laagjes aan bovenop het kernkussen.

Centrifugeer dit in een swinging-bucket-rotor bij 1.000 ×g en 16 °C gedurende 15 minuten. Gebruik vervolgens een aspirator om alle buffer te verwijderen en houd de plastic insert tegen de bovenkant van de buis. Verwijder daarna met een fijne pincet het dekglas, waarbij u er zorgvuldig op let aan welke zijde van het dekglas de kernen zijn neergesponnen.

Fixeer het dekglas in koud methanol gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verplaats het dekglas met de kernzijde naar boven naar een vel plastic paraffinefolie dat een grote, plastic Petrischaal bekleedt. Plaats vervolgens natte, wegwerpbare doekjes langs de zijkant van de schaal om uitdroging te voorkomen.

Rehydrateeer de kernen op het dekglas gedurende vijf tot 10 seconden met 500 µL PBS NP40 en aspireer dit vervolgens. Breng daarna voorzichtig 75 µL PBS 3%BSA aan op het dekglas en laat dit gedurende één uur bij kamertemperatuur, of overnacht bij vier graden Celsius, blokkeren. Verwijder de blokkeringsbuffer en incubeer met het primaire antilichaam verdund in PBS 3%BSA.

Was de monsters vervolgens vijf keer achter elkaar met PBS NP40. Herhaal deze incubatie- en wasstappen met secundaire antilichamen. Incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur met 10 micrograms per milliliter Hoechst, verdund in PBS 3%BSA.

Was daarna vijf keer met PBS NP40 en verwijder alle overtollige buffer. Monteer tot slot het dekglas op een objectglas met vijf microliters anti-fade monteermedium. Gebruik transparante nagellak om het dekglas af te dichten en beeldvorm direct met een epifluorescentiemicroscoop of bewaar het bij 40 graden Celsius voor latere beeldvorming.

Deze figuur toont de assemblage van kernen in eiextract. 30-45 minuten na het starten van de reactie zouden de dunne, S-vormige spermakernen moeten beginnen te verdikken tot slakvormige chromatinemassa's. Nadat de nucleaire assemblage heeft plaatsgevonden, zou de vorm van de kern ronder moeten worden en zou het kernvolume moeten toenemen naarmate de kernenvelope uitzet en kernproteïnen worden geïmporteerd.

Zoals hier getoond, vertoont een met Hoechst gekleurd preparaat van een kleine aliquot van het embryo-extract veel gekleurde kernen, wat aangeeft dat de bereiding van het extract succesvol was. Na verwijdering van de kernen door centrifugatie zouden, in vergelijking met het eerste preparaat, zeer weinig kernen in het extract over moeten blijven, zoals in dit paneel te zien is, om ervoor te zorgen dat endogene kernen de daaropvolgende analyse niet verstoren. Als er nog steeds kernen aanwezig zijn, is een tweede ronde van centrifugatie vereist.

In deze assay voor nucleaire krimp worden celkernen uit eiextract, resuspendeerd in embryo-extract van een laat stadium, na verloop van tijd succesvol kleiner. Celkernen die echter zijn geïncubeerd met hitte-geïnactiveerd embryo-extract vertonen dit proces niet. Het is belangrijk om het experiment meerdere keren te herhalen om rekening te houden met de inherente variabiliteit van de assay.

Zodra de methode onder de knie is, kan het volledige protocol in twee dagen worden uitgevoerd, waarbij de eigenlijke assay voor nucleaire inkrimping ongeveer vier uur in beslag neemt. Tijdens deze procedure is het belangrijk om de eicellen en embryo's gedurende het proces kwaliteitsmatig te controleren en zeer voorzichtig te zijn om de pellet en lipidelaagen te vermijden bij het verzamelen van het cytoplasmatisch extract na centrifugatie. De resultaten die met deze procedure zijn behaald, dienen te worden gevalideerd.

Bijvoorbeeld mijn embryo-microinjectie of celcultuurtransfectie. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de grootte-regulatie van andere organellen te onderzoeken. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de nucleaire celbiologie om de regulatiemechanismen van de kerngrootte en de functionele rol van de kerngrootte bij ontwikkeling en carcinogenese te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kernen uit Xenopus-eiextract assembleert en isoleert, Xenopus-embryo's en embryo-extract genereert, de nuclear shrinking assay uitvoert en de resultaten visualiseert.