Name: De fibular Nerve Injury Methode: Een betrouwbare Assay kunnen identificeren en Test factoren die Repair neuromusculaire verbindingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor zenuwletsel bij muizen om neuromusculaire verbindingen te onderzoeken. Deze techniek maakt vergelijking van herinnerveringspercentages mogelijk zonder myogene veranderingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de leden van het Valdez-laboratorium voor intellectuele input over experimenten en opmerkingen over het manuscript.

Alle experimenten werden uitgevoerd in het kader van de NIH richtlijnen en protocollen dier door de Tech Institutional Animal Care en gebruik Comite Virginia goedgekeurd uitgevoerd. 1. Voorbereiding Dieren voor Heelkunde <ol><li> Verdoven muizen met een mengsel van ketamine (90 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) via subcutane injectie inguinale met een steriele 1 ml insulinespuit. Drageroplossing bevat een mengsel van 0,9% zoutoplossing, 17,4 mg / ml ketamine en 2,6 mg / ml xylazine. Plaats de dieren terug in kooien in afwachting van medicatie door te voeren. Opmerking: Als de aanvangsdosis onvoldoende verdoving biedt voor de duur van de procedure, kan een extra 25% van de aanvangsdosis injecteren. </li><li> Monitor dieren na de injectie om te controleren op regelmatige respiratoire tarieven en passende verlaging van opwinding niveaus. Controleer opwinding niveau met een achterpoot snuifje, waarvoor geen reactie mag wekken indien voldoende verdoofd. OPMERKING: Dit duurt meestal 3-5min voor een jong volwassen muis van gemiddeld 25 tot 30 g. Als het dier is nog steeds reageert na 10 minuten na de injectie, kan een extra 25% van het verdovingsmiddel oplaaddosis worden geïnjecteerd. </li><li> Toepassen vaseline en lichte minerale olie oogzalf ogen van het dier te voorkomen droogheid. Verwijder dieren uit de kooi en plaats op een schone, vlakke ondergrond. Scheer de gewenste achterste ledematen van voet naar het bekken met een elektrische tondeuse, het blootstellen van alleen de laterale aspect van het ledemaat. </li><li> Breng een chemische haar remover op de geschoren site voor 1 min. Handmatig het haar te verwijderen met behulp van laboratorium doekjes. Maak de onthaarde met laboratorium doekje gedrenkt in ethanol. </li></ol> 2. Chirurgische Procedure <ol><li> Steriliseren chirurgische instrumenten via autoclaaf of een andere geschikte methode. Maak de operatiewond en chirurgische bord met 80% ethanol / H 2 0. Ontsmet de chirurgische site met proviodine. Plaats de muis op chirurgische boord en af ​​te stemmen op de ledematen hoofdsteunen. Houdenhet doel achterste ledematen in een anatomisch natuurlijke positie met het kniegewricht iets verlengd zonder interne of externe rotatie. </li><li> Plaats dier en bord onder de chirurgische microscoop. Oriënteren de goede incisie via palpatie oppervlakkige oriëntatiepunten bijzonder de benige kniegewricht en de kam tussen de tibialis anterior en gastrocnemius spieren. </li><li> Maak een ongeveer 3 cm incisie door de huid met behulp van een scalpel of lente schaar tijdens het gebruik van algemene tang voor het grijpen. Maak de incisie loodrecht op het onderliggende verloop van de gemeenschappelijke fibulaire zenuw. </li><li> Ga door met de incisie door de oppervlakkige fascia, waardoor de biceps femoris en vastus lateralis spieren. Scheid deze spieren door het doorsnijden van de verbindende diepe fascia. Een 1-2 cm gesneden moet voldoende zijn. </li><li> Trek de biceps femoris caudaal met behulp van mechanische oprolmechanismen, het openbaren van de gemeenschappelijke fibulaire zenuw. </li><li> Trace de zenuw proximaal tot haar interdeel met de pees van de laterale kop van de gastrocnemius spier wordt gevonden. Opmerking: Blootstelling kan additionele manipulatie van de teruggetrokken huid en spieren nodig. Deze kruising wordt gebruikt als de stabiele mijlpaal voor de zenuwletsel. </li><li> Pak de zenuw met een fijne tang, het afstemmen van de tips in een parallelle wijze aan de laterale rand van de gastrocnemius pees. Plet de gemeenschappelijke fibularis zenuw door het toepassen van constante, harde druk gedurende 5 sec. </li><li> Bevestigen volledige verpletteren van de zenuw door visuele inspectie door de chirurgische scope. Het zal verschijnen doorzichtige op de plaats van verwonding. Bij gebruik van muizen die fluorescentie eiwitten in perifere axonen zal de fluorescentie verdwijnt uit de plaats van verwonding. </li><li> Verwijder oprolmechanismen en lijnt de spieren in hun anatomische posities. Sluit de incisie met 6-0 zijden hechtingen. 1-3 eenvoudige onderbroken hechtingen worden volstaan. Plaats recupereren muis op een verwarmingselement in een schone kooi. </li><li> Monitor alle dieren gedurende 2 uur post-operatie om te controleren op de ademhaling en de eventuele bijwerkingen van de narcose. Dien een initiële dosis van buprenorfine 0,05-0,10 mg / kg via subcutane injectie lies onmiddellijk na herstel van een operatie. Geef 3 extra doses elke 12 uur in de komende 48 uur. Na volledig herstel, terug muizen om het dier zorginstelling. </li></ol> 3. Isolatie en kleuring van Extensor digitorum Longus (EDL) Spieren <ol><li> Sacrifice dieren met behulp van isofluraan. Verdeel 0,5 ml vloeistof isofluraan in een 50 ml buis gevuld met absorberend labwipes. Plaats de afgetopte buis met het dier in een afgesloten 2.500 cm 3 kamer. Tenminste 4 min van blootstelling voldoende. Test voor het verlies van de bilaterale oogleden, teen-snuifje, en de staart-knijpen reflexen om ervoor te zorgen dat elk dier bewusteloos is alvorens met perfusie. </li><li> Transcardially perfuseren 16 dieren eerst met 10 ml 0,1 M PBS, vervolgens 25 ml van 4% paraformaldehyde in 0,1 M PBS (pH 7,4). Heparine (30 eenheden / 20g dier gewicht) kan worden toegevoegd met de PBS (10 eenheden / ml) om de bloedstolling te voorkomen in kleine capillaire bedden, het verbeteren van perfusie resultaten. </li><li> Verwijder de huid die achterpoten met een schaar om dwars doorsnijden de huid rond de omtrek van de buik. Schil beneden de huid langs de achterpoten en voeten behulp van een tang. </li><li> Verwijder oppervlakkige fascia van de achterpoten door vast te pakken en peeling met een pincet. Bij gebruik van muizen die fluorescentie eiwitten in perifere axonen, &#39;s nachts post-fix hele muizen in 4% PFA in 50 ml buizen. Spoel driemaal met PBS. OPMERKING: Vaste muizen kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C. Zo niet, dan slaat u deze stap en ga dan naar stap 3.6, zonder na de vaststelling van dieren. </li><li> Ontleden EDL spieren 18 uit muis achterpoten, en zorg ervoor dat proximale en distale pezen zoveel mogelijk intact te houden. </li><li> Incubeer EDL spieren in blokkerende buffer (1x PBS dat 0,5% Triton X-100, 3% BSA en 5% geit serum) gedurende ten minste 1 uur. </li><li&gt; Om motorische axons en hun zenuwuiteinden, plaats spieren visualiseren in buisjes die neurofilament (1: 1000) en synaptotagmine-2 (1: 250) antilichamen verdund in blokkerende buffer gedurende 3 dagen. Was spieren driemaal met 1x PBS en 10 minuten per keer. Opmerking: Sla deze stap over als het gebruik van muizen die fluorescentie-eiwitten (XFP) in perifere axonen. </li><li> Vlekken op de contralaterale ongedeerd EDL als een positieve controle voor complete NMJ innervatie. Negatieve controles dient een EDL verkrijgen op 4 dagen na het letsel, een tijdstip waar de NMJ volledig gedenerveerde, en een EDL gekleurd met alleen secundair antilichaam omvatten. </li><li> Incubate spieren met de juiste fluorescent gelabeld secundaire antilichamen tegen neurofilament en synaptotagmin-2 sporen voor 1 dag. Was spieren driemaal met 1x PBS en 10 minuten per keer. Opmerking: Deze stap kan worden uitgevoerd samen met stap 3.10 worden uitgevoerd. Sla deze stap over als het gebruik van muizen die fluorescentie eiwitten in perifere axonen. </li><li> Om de postsy visualiserennaptic gebied van de NMJ, incubeer spieren met 5 ug / ml Alexa-555 geconjugeerd a-bungarotoxine verdund in blokkerende buffer gedurende ten minste 2 uur. Was spieren driemaal met 1x PBS en 10 minuten per keer. </li><li> Om hele spieren op glasplaatjes positief geladen te monteren, plaatst u de spier rechtstreeks op de dia, voeg een paar druppels van glycerol op basis montage medium op de dia en bedek met een dekglaasje. Druk op de dekglaasje tegen de dia om de spier af te vlakken. Losweken montage media uit de omtrek van de glijbaan en dekglaasje met behulp van laboratorium doekjes. Solliciteer nagellak aan de randen tussen het dekglaasje en de glijbaan af te dichten. </li></ol> 4. Imaging en Data-analyse <ol><li> Om de structuur van NMJs, imago van de EDL spier met behulp van een confocale laser scanning microscoop uitgerust om 488, 555 en 633 nm licht prikkelen en vastleggen van het uitgezonden licht met 20X en 40X doelstellingen te analyseren. </li><li> Om hele NMJs visualiseren, creëren maximale intensiteit projectie beelden van optische secties afstand 1-2 urn afgezien uitstrekt van de laagste tot de hoogste zichtbare gebieden van de NMJ. Maak een maximale intensiteit projecties met behulp van commercieel verkrijgbare imaging software. </li><li> Om de tarieven van de reïnnervatie bepalen, categoriseren NMJs als: 1) volledig gedenerveerde = postsynaptische site is volledig verstoken van contact met de axon, minder dan 5% colocalization tussen de axon en AChRs. 2) Half geprikkeld = de axon overlapt gedeeltelijk postsynapse, 5-95% colocalization tussen de axon en AChRs. 3) Volledige innervatie = bijna perfect appositie tussen de pre- en post-synaps, meer dan 95% colocalization tussen de axon en AChRs. Uitsluiten NMJs dat loodrecht op het beeldvlak liggen of niet volledig zichtbaar in het beeld. Opmerking: In al deze experimenten werden ten minste 3 dieren en 50 NMJs per dier wordt. De resultaten werden significant geacht met een student t-test met een p-waarde van minder dan 0,05. </li><li> Om de operator te verblinden, kan afzonderlijke individuen uit te voerende operatie en beeldanalyse. Zonder kennis van de behandelingsgroepen, kan de analysator doelstelling met NMJ scoren zijn. Als alternatief, kunnen de beelden worden gerandomiseerd en voorgelegd aan de exploitant voor de analyse zonder kennis van de dierlijke bron. </li></ol> 5. Kwantitatieve PCR <ol><li> Sacrifice dieren met behulp van isofluraan en cervicale dislocatie. Verwijder het vel en oppervlakkige fascia die beenspieren volgens stap 3.3. Ontleden tibialis anterior spieren en EDL volgens stap 3,4. </li><li> Flash bevriezen de hele tibialis anterior en EDL spieren in een 1,5 ml buis over vloeibare stikstof. Verwijder weefsel van de buis en plaats in een pre-gekoelde mortel gedeeltelijk ondergedompeld in vloeibare stikstof. Grind bevroren spier tot een fijn poeder met behulp van een mortier en een stamper. </li><li> Lossen ingevroren spier poeder in een commercieel verkrijgbare RNA-extractie reagens en uitvoeren RNA extractie en genomisch DNA verwijderen met een commercieel verkrijgbare kit volgens i fabrikantNSTRUCTIES. </li><li> Voeren reverse transcriptie met een commercieel verkrijgbaar mengsel reverse transcriptase volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Voer qPCR met behulp van een commercieel verkrijgbare kit met behulp van geschikte housekeeping genen (zie tabel van materialen). Gebruik een los verkrijgbare kwantitatieve PCR thermische cycler voor het uitvoeren van PCR (zie tabel van materialen). </li><li> Stel annealing temperatuur 58 ° C. Pas extra fietsen parameters om de specificaties van de fabrikant van Taq-polymerase / SYBR groen mix. Onder een smelteindtemperatuur kromme stap in thermocycler programma dat bestaat uit 0,5 ° C incrementeel verhoogd van 65 ° C tot 95 ° C om te testen op specificiteit primer en primer dimeer vorming. </li><li> Bepaal relatieve mRNA-expressieniveaus door 2 - ΔΔCT werkwijze 21 gebruikt 18S RNA als controle gen. </li></ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction%2C+assembly%2C+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).</li>
<li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+as+a+distal+axonopathy%3A+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Front. Neurosci. 8, 252(2014).</li>
<li>Apel, P. J., Alton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+age+impairs+the+response+of+the+neuromuscular+junction+to+nerve+transection+and+repair%3A+An+experimental+study+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats.</a> J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).</li>
<li>Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+neuromuscular+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve+Suppl%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in neuromuscular innervation.</a> Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PloS one. 7 (4), e34640(2012).</li>
<li>Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+pathways+promote+precise+projection+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pre-existing pathways promote precise projection patterns.</a> Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).</li>
<li>Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+cellular+interactions+in+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration.</a> Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).</li>
<li>Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian+degeneration%3A+gaining+perspective+on+inflammatory+events+after+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury.</a> J Neuroinflammation. 8, 110(2011).</li>
<li>Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophages+in+Wallerian+degeneration+and+axonal+regeneration+after+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury.</a> Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).</li>
<li>Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sciatic+nerve+injury+model+in+pre-clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The sciatic nerve injury model in pre-clinical research.</a> J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).</li>
<li>Batt, J. A. E., Bain, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tibial+nerve+transection+-+a+standardized+model+for+denervation-induced+skeletal+muscle+atrophy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice.</a> J. Vis. Exp. (81), e50657(2013).</li>
<li>Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciatic+nerve+injury%3A+a+simple+and+subtle+model+for+investigating+many+aspects+of+nervous+system+damage+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery.</a> J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).</li>
<li>Kang, H., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+regeneration+and+muscle+reinnervation+in+young+adult+and+aged+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals.</a> J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Feng, G., Mellor, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Bowen, D. C., Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+regulation+of+MuSK+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction.</a> Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).</li>
<li>Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myostatin+deficiency+is+associated+with+an+increase+in+number+of+total+axons+and+motor+axons+innervating+mouse+tibialis+anterior+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle.</a> Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De methode die in dit handschrift biedt unieke mogelijkheden om mechanismen die betrokken zijn bij het herstel van neuromusculaire verbindingen (NMJ) te identificeren. Deze methode omvat het malen van gemeenschappelijke fibularis zenuw terwijl deze over de gastrocnemius pees bij de knie. We tonen aan dat na slechts 5 seconden van een beknelde zenuw met een tang, compleet degeneratie wordt opgemerkt door 4 dagen na het letsel. Bij jonge volwassen muizen, alpha-motor axonen beginnen te eerdere synaptische sites in de exte...

Bij jonge volwassen en gezonde dieren is de neuromusculaire junctie (NMJ) een zeer stabiele verbinding tussen de presynaps, de zenuwuiteinden van een α-motorische axon, en de postsynapse, het gespecialiseerde gebied van een extrafusale spiervezel waar nicotinerge acetylcholinereceptoren (AChR's) selectief aggregeren1. De bijna perfecte appositie van de pre- en postsynaptische apparaten is noodzakelijk voor een goede neurotransmissie, overleven van α-motorische neuronen en spiervezels en motorische functie. Helaas wordt de functie van de NMJ nadelig beïnvloed door veroudering, ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), auto-immuunziekten en letsel aan spieren en perifere zenuwen2-5. Deze aanvallen resulteren vaak in degeneratie van presynaptische zenuwuiteinden, waardoor spieren gedenerveerd raken en motorische vaardigheden aanzienlijk worden veranderd. Om deze reden is de identificatie van moleculen die functioneren om de NMJ te onderhouden en te repareren een prioriteit geworden. Omdat perifere zenuwen regenereren en reinnerveren doelen, zijn perifere zenuwletselmodellen gebruikt om moleculaire veranderingen geassocieerd met regenererende NMJ's te identificeren. 
Perifere zenuwletselmodellen omvatten vaak het volledig doorsnijden of verpletteren van specifieke zenuwtakken6. Na een snede moet de endoneuriale buis worden gevormd, waardoor axonale regeneratie en reinnervatie van doelcellen en -weefsels worden vertraagd. De ernst van dit type letsel veroorzaakt ook dat axonen van hun oorspronkelijke pad afwijken, wat ertoe leidt dat ze hun oorspronkelijke doelen niet bereiken. Dit staat in contrast met zenuwen die gewond zijn door verplettering waarbij het endoneurium aaneengesloten blijft, wat een pad biedt voor efficiënte en goede regroei van regenererende axonen. Het stelt axonen ook in staat om hun oorspronkelijke spiervezelpartners te vinden en opnieuw te innerveren. Ongeacht het letselmodel, zijn er een aantal cellulaire en moleculaire veranderingen die moeten optreden voor axonen om te regenereren en doelen te reinnerveren. Na een letsel wordt het zenuwsegment proximaal van het doel gebroken en verwijderd via een proces dat Walleriaanse degeneratie wordt genoemd7. Dit proces omvat herprogrammering en de-differentiatie van Schwann-cellen in niet-myeliniserende cellen die regeneratieve factoren uitscheiden, myeline verwijderen en macrofagen naar de plaats van letsel aantrekken8. Macrofagen voltooien op hun beurt de opruiming van myeline en axonaal puin, wat anders de groei van de regenererende axon zou belemmeren9. Tevens activeren motorische en sensorische neuronen mechanismen die nodig zijn om de regeneratie van hun afgesneden axonen te bevorderen. Zodra de regenererende axon het doel bereikt, moet deze transformeren van een groeikogel tot een zenuweitje dat in staat is om goed te transporteren (voor motorische axonen) of te ontvangen (voor sensorische axonen) informatie10. In dit opzicht ondergaan alfa-motorische axonen een reeks goed georchestreerde veranderingen die culmineren in hun groeikogel die differentieert in een volledig functionele presynaptische zenuweit die bijna perfect tegenover de postsynaptische site op het doel spiervezel staat11. 
De sciatische, tibiale en accessoire zenuwen zijn de belangrijkste keuzes voor het bestuderen van axonale en NMJ-regeneratie12-14. Er zijn echter een aantal nadelen bij het gebruik van deze modellen om cellulaire en moleculaire veranderingen te onderzoeken die geassocieerd zijn met regenererende NMJ's tussen dieren en onder verschillende omstandigheden. Ten eerste voorziet de sciatische zenuw in de meerderheid van de spieren van het achterste ledemaat, waarbij letsel de beweging en sensatie aanzienlijk beperkt. Het is daarom niet mogelijk om deze methode te gebruiken om de impact van oefening alleen of in combinatie met andere factoren te bestuderen. Bovendien is de sciatische zenuw een vrij dikke structuur en vereist dus een grote hoeveelheid compressiekracht om alle axonen volledig te verwonden. Dit kan op zijn beurt resulteren in volledige doorknipping van de meer oppervlakkige axonen terwijl de endoneuriale buis van dieper liggende axonen intact blijft, wat aanzienlijke variabiliteit introduceert in de snelheid en trouw van regenerering tussen deze axonen. Volledige doorknipping van deze zenuw is zelfs nog onwenselijker aangezien veel axonen zullen falen om opnieuw verbinding te maken met dezelfde spiervezels. Complicaties ontstaan verder doordat de sciatische zenuw intrinsieke anatomische variabiliteit bezit, zowel in het aantal als de plaats van oorsprong van zijn terminale zenuwtakken. Het is daarom zeer moeilijk om dezelfde site te verwonden. Hoewel de tibiale zenuw kleiner is en meer vatbaar is voor verpletterende verwondingen, is er ook geen gemakkelijk beschikbare landmark die kan dienen als verwondingsplaats voor deze zenuwtak. 
De accessoire zenuwtak (onderdeel van de craniale zenuw XI) die de sternocleidomastoïde spier voorziet, is ook gebruikt om regeneratie van NMJ's te bestuderen15. Deze zenuw is bijzonder aantrekkelijk omdat NMJ's in de sternocleidomastoïde spier gemakkelijker kunnen worden afgebeeld in levende dieren in vergelijking met NMJ's in andere spieren. Maar net als de sciatische en tibiale zenuwen, is er geen specifiek landmark dat kan worden gebruikt om deze zenuw op dezelfde locatie te verwonden, waardoor het beperkt is als een model voor het vergelijken van regeneratie van NMJ's tussen individuele dieren van een experimentele cohort. Een inconsistente verwondingsplaats introduceert variabiliteit in de snelheden van NMJ-reinnervatie. Vanwege deze tekortkomingen gebruikt de hier gepresenteerde procedure de verwonding van een andere perifere zenuwtak om regenererende NMJ's te onderzoeken. 
De gemeenschappelijke fibulazenuw, ook wel de gemeenschappelijke peroneale zen

```html
<table><tbody><tr><td>Ketamine</td><td>VetOne</td><td>501072</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc. </td><td>003437 </td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td> Zoopharm</td><td>1Z-73000-150910 </td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kim-wipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Electric Razor</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-64800</td><td></td></tr><tr><td>80% EtOH/H20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% Proviodine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Insulin Syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Vannas</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>No. 15 scalpel</td><td>Braintree Scientific</td><td>SSS 15</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Dumont</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>6-0 silk suture on reverse cutting needle</td><td> Suture Express</td><td>752B </td><td></td></tr><tr><td>Rodent Heating Pad</td><td>Braintree Scientific</td><td>AP-R-18.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 conjugated alpha-BTX</td><td>Molecular Probes</td><td>B35451</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Stereo Zoom Microscope</td><td>Olympus</td><td>562037192</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 700 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Variable-flow peristaltic perfusion pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-3</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Total RNA Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>7326820</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad iScript RT Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725200</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet ointment</td><td>Puralube</td><td>1621</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin-2 antibody</td><td>Antibodies-Online</td><td>ABIN401605</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament antibody</td><td>Antibodies-Online</td><td>ABIN2475842</td><td></td></tr></tbody></table>
```

de fibular nerve injury methode: een betrouwbare assay kunnen identificeren en test factoren die repair neuromusculaire verbindingen

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

De neuromusculaire junctie (NMJ) ondergaat schadelijke structurele en functionele veranderingen als gevolg van de vergrijzing, letsel en ziekte. Derhalve is het noodzakelijk om de cellulaire en moleculaire veranderingen die samenhangen onderhoud en reparatie NMJs begrijpen. Hiervoor hebben we een methode ontwikkeld om op betrouwbare en consistente onderzoeken regenereren NMS bij muizen. Deze methode zenuwletsel omvat het breken van de gemeenschappelijke fibularis zenuw als het gaat over de laterale kop van de gastrocnemius spier pees in de buurt van de knie. Met behulp van 70 dagen oude vrouwelijke muizen, tonen we aan dat de motor axonen beginnen te eerdere postsynaptische targets reinnervate binnen 7 dagen na de crush. Ze volledig opnieuw te bezetten hun eerdere synaptische gebieden met 12 dagen. Om de betrouwbaarheid van deze methode schade vast te stellen, vergeleken we reinnervation tarieven tussen individuele 70 dagen oude vrouwelijke muizen. We vonden dat het aantal reinnervated postsynaptische plaatsen vergelijkbaar tussen muizen 7, 9 en 12 dagen na de crush. Om te bepalen ofDeze schade test kan ook worden gebruikt om moleculaire veranderingen vergelijken spieren onderzochten we de niveaus van gamma-subeenheid van de spier nicotinerge receptor (gamma-AChR) en de spier-specifieke kinase (MuSK). De gamma-AChR subunit en muskus om zijn zeer opgereguleerd na denervatie en terug te keren naar een normaal niveau na reïnnervatie van NMJs. We hebben een nauwe relatie tussen transcript niveaus voor deze genen en innervatie status van de spieren. Wij geloven dat deze methode ons begrip van de cellulaire en moleculaire veranderingen voor herstelling van de NMJ en andere synapsen versnellen.

De gemeenschappelijke fibulaire zenuw, ook wel de gemeenschappelijke peroneus, vloeit voort uit de heupzenuw boven de knieholte, waar zwaait rond het hoofd van de fibula het anteriore gedeelte van de poot (Figuur 1A). Daar takken in de oppervlakkige en diepe fibulaire zenuwen, samen leveren van de dorsiflexors van de voet en tenen (anterior tibialis, extensor digitorum longus en brevis en extensor halluces longus spieren) en de everters van de voet (peroneus spieren). De...

We hebben een methode voor zenuwletsel ontwikkeld om op betrouwbare wijze spierreïnnervatie, en dus regeneratie van neuromusculaire juncties bij muizen, te onderzoeken. Deze techniek omvat het beschadigen van de gemeenschappelijke fibulazenuw via een eenvoudige en zeer reproduceerbare operatie. Spierreïnnervatie wordt vervolgens beoordeeld door het geheel op te monteren van de extensor digitorum longus-spier.

De fibular Nerve Injury Methode: Een betrouwbare Assay kunnen identificeren en Test factoren die Repair neuromusculaire verbindingen

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Het algemene doel van deze methode voor perifeer zenuwletsel is om regenererende neuromusculaire juncties bij muizen betrouwbaar te onderzoeken. Deze methode helpt ons bij het identificeren van de moleculaire, cellulaire en functionele veranderingen die gepaard gaan met regenererende neuromusculaire juncties. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat de snelheid van regeneratie van de neuromusculaire junctie betrouwbaar vergeleken kan worden tussen experimentele groepen, grotendeels in afwezigheid van myogenicte veranderingen.De procedure zal worden gedemonstreerd door William Dalkin, een medicijnstudent in mijn laboratorium. Reinig vóór aanvang van de procedure de chirurgische plaats, de plank en de instrumenten met 80%ethanol, gevolgd door desinfectie met Povidon-jodium. Plaats vervolgens de muis op de chirurgische plank en bevestig de afwezigheid van een reactie op een knijptest in de teen.Lijn de ledematen in de fixaties uit, waarbij het doel-achterpoot in een anatomisch natuurlijke positie wordt geplaatst en de kniegewrichten licht gestrekt zijn zonder interne of externe rotatie. Verplaats het dier vervolgens onder een chirurgische microscoop en stel de plaat zo in

the-fibular-nerve-injury-method-reliable-assay-to-identify-test

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit rapport beschrijven we een methode om de muis heupzenuw te verpletteren. Deze methode maakt gebruik van direct beschikbaar hemostatische tang en gemakkelijk en reproduceerbaar maakt complete heupzenuw crush. Daarnaast beschrijven we een methode om de spieren hele mounts geschikt voor analyse van de zenuw regeneratie na heupzenuw verliefd te bereiden.

Reproduceerbare Mouse heupzenuw Crush en de daaropvolgende beoordeling van Regeneratie door Whole Mount Muscle Analyse

This video demonstrates a method to assess functional neuromuscular junctions. Using a bioreactor containing muscle tissue and motor neurons, along with fluorescent microscopy, the light-sensitive channels in the neurons are stimulated to generate electrical signals, causing muscle fiber contractions.

Assessing a Functional Neuromuscular Junction Via Simultaneous Optical Stimulation and Video Recording

Source: Dalkin, W., et al. The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a surgical procedure to induce fibular nerve injury in a mouse to study neuromuscular junction (NMJ) regeneration. The procedure involves exposing the fibular nerve, applying controlled pressure to induce injury, and ensuring the epineurium remains intact to support axonal regeneration. Over time, macrophages...

Inducing Fibular Nerve Injury in a Mouse to Study Neuromuscular Junction Regeneration

De neuromusculaire junctie (NMJ) wordt gewijzigd in een verscheidenheid aan omstandigheden die soms kunnen resulteren in synaptische falen. Dit rapport beschrijft op fluorescentiemicroscoop gebaseerde methoden om dergelijke structurele veranderingen te kwantificeren.

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

Een functionele evaluatie van de motorische eindplaat (NMJ) kan verschaffen essentiële informatie over de communicatie tussen spieren en zenuwen. Hier beschrijven we een protocol uitvoerig evalueren zowel de spier de NMJ functionaliteit met behulp van twee verschillende spier-zenuw preparaten, d.w.z. soleus-ischialgie en membraan-phrenic.

Meten van de motorische eindplaat functionaliteit

Axonale prikkelbaarheid technieken bieden een krachtig hulpmiddel om te onderzoeken pathofysiologie en biofysische wijzigingen die voorafgaan aan de onomkeerbare degeneratieve gebeurtenissen. Dit manuscript demonstreert het gebruik van deze technieken op het telefoonbotje van narcose ratten.

In Vivo Elektrofysiologische meting van de Rat telefoonbotje met axonale prikkelbaarheid testen

Gepresenteerd is een protocol om verschillende soorten mediane zenuw (MN) laesies te produceren en reparatie in de rat. Bovendien laat het protocol zien hoe het functionele herstel van de zenuw kan worden geëvalueerd met behulp van verschillende niet-invasieve gedragstests en fysiologische metingen.

Functionele en fysiologische methoden voor de evaluatie van mediane zenuwregeneratie in de rat

Geautomatiseerde loopanalyse is een haalbaar hulpmiddel om functioneel herstel te evalueren in knaagdiermodellen van perifere zenuwletsel en dwarslaesie. Hoewel het slechts één opstelling vereist om de motorische functie in verschillende experimentele modellen te beoordelen, is nauwgezette hard- en soft-ware aanpassing en training van de dieren zeer belangrijk.

Geautomatiseerde ganganalyse om functioneel herstel bij knaagdieren met perifere zenuw- of ruggenmergkvochtletsel te beoordelen

Evaluatie van motorisch herstel blijft de benchmark uitkomstmaat in experimentele perifere zenuwstudies. De isometrische tetanische krachtmeting van de tibialis voorste spier in de rat is een onschatbaar hulpmiddel om functionele resultaten na reconstructie van ischiaszenuwdefecten te beoordelen. De methoden en nuances worden in dit artikel beschreven.

Maximale isometrische tetanische krachtmeting van de Tibialis-voorste spier in de rat

Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

Leer een betrouwbare methode voor zenuwletsel bij muizen om neuromusculaire verbindingen te onderzoeken. Deze techniek maakt vergelijking van herinnerveringspercentages mogelijk zonder myogene veranderingen.

De fibular Nerve Injury Methode: Een betrouwbare Assay kunnen identificeren en Test factoren die Repair neuromusculaire verbindingen (Video) | JoVE Journal

De fibular Nerve Injury Methode: Een betrouwbare Assay kunnen identificeren en Test factoren die Repair neuromusculaire verbindingen

Meer video's verkennen