Name: Generatie en identificatie van GM-CSF Afgeleide alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen van de muis beenmerg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Leer alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen genereren uit muizenbeenmerg met GM-CSF-supplementatie. Deze methode onderscheidt celtypen via MHCII en hyaluronan-binding voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119.503) en het Natural Sciences and Engineering Council van Canada (NSERC). NSERC ook ondersteund zomer studentships te YD en AA YD wordt ondersteund door de Universiteit van British Columbia (UBC) met een 4-jaar Fellowship Award, wordt AA ondersteund door CIHR met een afgestudeerde student Master award (CGS-M). Wij danken Calvin Roskelley voor hulp bij de microscoop gebruikt om de beelden in figuur 2 te genereren. We hebben ook steun van de UBC Animal en flowcytometrie voorzieningen te erkennen.

De muizen werden gedood in overeenstemming met de Canadese Raad over Animal Care richtlijnen voor ethisch dierlijke onderzoek van procedures die door de University of British Columbia Animal Care Committee goedgekeurd. 1. Het verwerven van een enkele cel Bone Marrow Schorsing van Mouse bovenbeen en onderbeen <ol><li> Schakel een biologisch veiligheidskabinet (BSC) 15 minuten voor aanvang van de procedure kabinet lucht zuiveren en vervolgens schoon / spuitnevel BSC oppervlak met 70% ethanol zorgen voor luchtstroom stabilisatie. Houd alles zo steriel mogelijk te maken voor het geheel van het protocol. Knip niet de botten onder niet-steriele omstandigheden. </li><li> Bereid dissectie-instrumenten door het weken in 70% ethanol (1 paar dissectie schaar, 2 paar pincetten), Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing met 5% foetaal kalfsserum (HBSS-FCS), steriele petrischalen (100 mm x 15 mm), 1 ml injectiespuiten, naalden 26½, conische verzamelbuizen (15 ml of 50 ml) en papieren handdoekjes in de BSC. </li><li> Euthanaseren de muis met behulp vanprotocollen door onderzoek dier ethische commissie van de instelling goedgekeurd. Breng in de BSC, bovenop een of twee papieren handdoeken en spuit de muis met 70% ethanol. </li><li> In de BSC, opent een steriele petrischaal aseptisch aliquot 10 ml HBSS-FCS aan de basis en 1-2 ml aan het deksel. </li><li> Plaats de muis in de maag met de rug naar boven en heffen de huid rond de thoracale secties met vingers van de niet-dominante hand. Gebruik de schaar om een ​​incisie waar de huid wordt opgetild maken. </li><li> Vasthouden aan beide uiteinden van de snede, een uiteinde met elke hand en trek elkaar de huid rond de muis van achter naar de maag, verder trekken tot twee uiteinden van de incisie bijeen op de maag. </li><li> Flip de muis buik naar boven, en met één hand trek de onderste helft van de huid naar beneden in de richting van het been, houd het terugtrekken van de huid totdat de benen worden blootgesteld. </li><li> Houd de voet van de muis en snijd de achillespees boven het enkelgewricht ende ligamenten verbinden de spieren aan voet aan de onderzijde van de tibia met een schaar. Dit lost de voet van de botten. </li><li> Terwijl het been van de voet, snijd de spieren en ligamenten met een schaar rondom het kniegewricht aan de onderkant van de femur de dijspieren scheiden van het onderbeen. Gebruik een tang om voorzichtig te trekken losgemaakt spieren weg van de fibular en dijbeen oppervlakken. Zorg ervoor dat u de dijbeenslagader verbreken om zware bloeden te voorkomen. </li><li> Met een hand vast te houden aan de voet, druk geopend schaar aan de bovenkant van het dijbeen in het heupgewricht, draait het been en trek voorzichtig aan het dijbeen te scheiden van het heupgewricht tijdens het gebruik van de schaar om de final cut te bevrijden het been uit het lichaam. </li><li> Vanaf dit punt, alleen houdt het weefsel met een steriel pincet. Houd vast aan het been aan de ene kant en trek de voet op de andere. NB: Dit moet veel kracht vereisen, zoals het aansluiten van ligamenten in stap worden gesneden1,9. Als alternatief, snijd het scheenbeen net boven de enkel, waar het bot is gefuseerd. </li><li> Houd het been door het distale uiteinde van het femur met een set pincet en proximale einde van de tibia en fibula met een andere, buig het scheenbeen en kuitbeen in de tegenovergestelde richting van het kniegewricht te scheiden van het femur en patella. </li><li> Gebruik een tang de resterende banden en spieren nog aan het onderbeen botten naar beneden te trekken. Hier, verwijder de fibula met bindweefsel met tang is te klein om te worden gespoeld beenmergcellen. Plaats de gereinigde tibia op het omgekeerde deksel petrischaal. </li><li> Houd het onderste uiteinde van het femur met een set pincet en de patella met een andere, buig de patella en de omringende weefsels in de tegengestelde richting van de verbinding voor verwijdering. Reinig vervolgens de resterende bindweefsel van het dijbeen; trekken ze weg met een pincet en plaats het op het omgekeerde petrischaal deksel. Gooi de patella. </li><li> Herhaal 1.7- 1,13 voor de andere kant indien nodig. Breng de botten 1,6 ml microcentrifuge buisjes met 1 ml steriele HBSS-FCS transport indien nodig. </li><li> Plaats botten op het omgekeerde deksel petrischaal met 1-2 ml HBSS-FCS, een tang om resterende weefsel nog aan de tibia en femur reinigen, breng de botten van de voet petrischaal met 10 ml HBSS- FCS. Als alternatief, het reinigen van de botten en verwijder bevestigd spierweefsel met behulp van een 70% ethanol doorweekt weefsel. </li><li> Snijd elk van de botten in de helft met een schaar. Gedeeltelijk af te schermen van de petrischaal met een steriele deksel tijdens het snijden om te zorgen voor de botten blijven in de schotel. Als alternatief, snijd het einde van elk bot te spoelen mogelijk te maken in de volgende stap. </li><li> Bevestig de 26½ G naald op de 1 ml spuit, en stelt 1 ml HBSS-FCS van de petrischaal. Steek de punt van de naald in het uiteinde van een beenstuk en spoel de beenmergcellen (zachte rode weefsel in de botten). Steek de naald in de kopvan het bot en het open einde, totdat de rode beenmerg wordt verwijderd. Let op de botten zo wit van kleur. </li><li> Passen zichtbare klonten beenmerg door de spuit een paar keer om een ​​enkele celsuspensie te vormen. </li><li> Gooi de gespoelde botten. Gebruik een 10 ml pipet de celsuspensie goed mengen en overbrengen naar de verzamelbuis. Spoel de petrischaal eenmaal met 5 ml HBSS-FCS om achtergebleven cellen te verzamelen in de schotel. Plaats cellen op ijs. Opmerking: Het beenmerg celsuspensie nog steeds levensvatbaar indien bewaard 2-3 uur bij 4 ° C. </li></ol> 2. Plating en het kweken van beenmergcellen (BMCS) <ol><li> Bereid de volgende reagentia en benodigdheden. <ol><li> Bereid rode bloedcel (RBC) lysis buffer door 0,84% ammoniumchloride in een uiteindelijke oplossing van 2 mM Tris pH 7,2, vervolgens steriliseren door filtreren door een 0,2 micron filter. </li><li> Bereid BMC media door het toevoegen van 10% FCS, 20 mM HEPES, 1 x niet-essentiële aminozuren, 55 &amp; #181, M 2-mercaptoethanol, 50 U / ml penicilline en streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine aan RPMI medium 1640. </li><li> Verkrijgen commercieel verkrijgbaar recombinant GM-CSF of GM-CSF gebruikt supernatant van Ag8.653 myeloma cellen getransfecteerd met de GM-CSF-gen 20. Bepaal de concentratie van GM-CSF in het supernatant met ELISA en voeg het equivalent van 20 ng / ml aan de BMC media. </li></ol></li><li> Spin down het beenmerg cellen op 314 xg gedurende 5 minuten. De pellet is rood, door RBCs. In de BSC, zuig het supernatant met behulp van een steriele glazen Pasteur pipet gehecht aan zuigen Vacuum, los de pellet door te tikken, voeg dan 10 ml RBC lysis buffer. Vortex om de cellen opnieuw te suspenderen en incuberen in RBC lysis buffer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> Voeg 10 ml HBSS-FCS draai vervolgens cellen bij 314 xg gedurende 5 minuten en zuig de supernatant. Let op de celpellet als witte kleur. Resuspendeer cellen in gewenste volume BMC media. </li><li> Tel de resuspended-cellen met een hemocytometer na kleuren dode cellen met 0,4% trypan blauw. OPMERKING: Indien beenmerg van één been (één tibia en femur) wordt gebruikt, hersuspenderen in 5 ml BMC media, neem 10 gl celsuspensie en verdun met 70 gl 0,4% trypan blauw, meng en breng 10 pl de 1/8 cel verdunning van de hemocytometer kamer. Tel de levensvatbare cellen in vier kwadranten: het gemiddelde van de vier kwadranten tellingen x verdunningsfactor x 10 4 = aantal cellen per ml. Een femur en tibia van het ene been het algemeen op ongeveer 2-4 x 10 7 cellen na RBC lysis. </li><li> Schat het aantal schotels 10 ml van beenmerg culturen nodig voor stroomafwaartse experimenten op basis van het totale aantal cellen nodig voor experimenten aan het eind van de kweek. OPMERKING: Elk gerecht moet 2 x 10 6 beenmergcellen bij de eerste seeding en rendementen 5-10 x 10 6 cellen op dag 7. <ol><li> Aliquot het totaal aantal cellen voor uitplaten in een nieuwe buis, het afsluiten bij 314 xg gedurende 5 minuten, zuig de supernatant en resuspendeer cellen op 4 x 10 6 cellen / ml in BMC media. </li></ol></li><li> Bereid een nieuwe steriele 100 mm x 15 mm petrischaal met 9,5 ml van BMC media met 200 ng van GM-CSF (recombinant of van GM-CSF bevattende supernatant). Voeg 500 ul van de 4 x 10 6 cellen / ml beenmergcellen naar het midden van de petrischaal voor de uiteindelijke concentratie van 2 x 10 5 cellen / ml in 10 ml. NB: Het is belangrijk om een steriele petrischaal geen weefselkweek schotel gebruiken. Ook bij het toevoegen van de cellen, zorgen cellen geconcentreerd blijven in het midden en het minimaliseren van verstoring van het serviesgoed zaaien en tijdens verandering van medium. Incubeer cellen bij 37 ° C en 5% CO2. Dit is dag 0 in de cultuur. </li><li> Op dag 3, voeg 10 ml van verse media met BMC 200 ng GM-CSF elk gerecht cellen. Zorg ervoor dat verstoring o minimaliserenf de cellen in suspensie geconcentreerd. Totale volume van celcultuur nu 20 ml. </li><li> Observeer cellen onder de lichtmicroscoop bij 100X vergroting. Let op talrijke niet-hechtende cellen (rond) en een paar hechtende cellen (flat). Cellen in groepen van drie of vier lijkt op bladeren van een bloem te zien, wat aangeeft proliferatie. </li><li> Op dag 6 uitvoeren van een half media verandering. Verwijder voorzichtig 10 ml van de media in een steriele 50 ml conische buis, spin down bij 314 xg gedurende 5 minuten, aspireren en gooi de supernatant. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 10 ml vers BMC media met 20 ng / ml GM-CSF, zacht vortex en toevoegen oorspronkelijke celkweek schotel voor een totaal volume van 20 ml. Acht cellen onder de microscoop. OPMERKING: Dag 7 cultuur moet op 70% of meer in confluentie met hechtende platte cellen en dichte wolken ronde niet-hechtende cellen. </li></ol> 3. Het verzamelen en voorbereiden van BMDC en BMDMs voor flowcytometrie <ol> &lt;li&gt; Houd alle buffers bij 4 ° C. </li><li> Oogst de cellen van dag 7 tot dag 10. Om de cellen eerste overdracht 10 ml van de kweek supernatant van een 50 ml conische verzamelbuis oogsten, dan kantelt de schaal verticaal ongeveer 30 ° en was de schaal door pipetteren de resterende 10 ml cultuur vanaf de bovenkant van de schaal. Herhaal dit wassen 5 keer, elke keer draaien van de schotel met een derde. </li><li> Draagt ​​de resterende 10 ml van cellen naar dezelfde verzamelbuis en gooi de plaat en de hechtende cellen. NB: De wasbeurten zal niet hechtende en losjes hechtende cellen te verwijderen; de platte hechtende cellen zijn bestand tegen de wassingen. Typisch tussen 5-10 x 10 6 niet-hechtende cellen worden verwacht van een plaat op dag 7 en 2-5 x 10 6 cellen op dag 10, maar Lutz et al. meldde 10 x 10 6 cellen op dag 10. De hechtende cellen zijn normaal gesproken niet genomen. Indien deze cellen moeten worden vergeleken met de niet-hechtende cellenZe kunnen als volgt worden verwijderd. Voeg 5 ml 0,7 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4 om de schaal nadat de niet-hechtende cellen verwijderd, incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten, pipet op en neer om de hechtende cellen te verwijderen en te verzamelen in een afzonderlijke buis. </li><li> Spin down van de verzamelde cellen op 314 xg gedurende 5 minuten en zuig het supernatant. Hersuspenderen in 5 ml steriele BMC medium bij 4 ° C, wervel voorzichtig te mengen en te tellen met behulp van trypan blauw en hemocytometer. LET OP: Elk gerecht zal opleveren 5 - 10 x 10 6 niet-hechtende cellen van een dag 7 cultuur. Van nu af aan, voeren alle stappen bij 4 ° C. </li><li> Voor flowcytometrische analyse overdracht 2 x 10 5 cellen per monster in 5 ml polystyreen rondbodem buizen wordt 300 pl FACS buffer bij 4 ° C (1x fosfaat gebufferde zoutoplossing, 2 mM EDTA en 2% runderserumalbumine) in elk monster. </li><li> Spin cellen neer op 314 xg gedurende 5 minuten en zuig het supernatant. Let op een zichtbare witte, ondoorzichtige pellet aan debodem van de buis. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 gl ongelabeld Fc receptor Ab Fc-receptor binding (Met 1/10 supernatant van 2.4G2 producerende myeloma cellijn) en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Voeg vervolgens 300 gl FACS buffer aan elk monster voorzichtig vortex, dan draaien de cellen neer op 314 xg gedurende 5 minuten en zuig de supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 gl CD11c-PeCy7 bij 0,2 ug / ml, Gr1-Pacific Blue bij 0,25 ug / ml, MHCII-APC bij 0,05 ug / ml en FL-HA bij ongeveer 2 ug / ml macrofagen en DC identificeren. LET OP: FL-HA werd bereid in huis met behulp van fluoresceïne en de haan kam hyaluronzuur natriumzout zoals eerder beschreven 21. </li><li> Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C binding aan het celoppervlak te laten. Voeg 300 gl FACS buffer aan elk monster voorzichtig vortex, dan draaien de cellen neer op 314 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en zuig de supernatant. OPMERKING: als biotinylated antilichamen worden gebruikt in de 3.8, herhaal 3,8-9 met fluorescerende streptavidine. </li><li> Was de cellen met een 300 gl FACS buffer, vortex voorzichtig te mengen en spin down de cellen bij 314 g gedurende 5 min. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 200 ui FACS-buffer bevattende 0,1-0,2 ug per ml propidiumjodide of DAPI om levensvatbare cellen te labelen. De cellen zijn nu klaar voor flowcytometrische analyse 22. OPMERKING: zie resultaten en Figuur 3 voor de details van de bevolking en de manier waarop de cellen werden afgesloten. </li></ol>

<ol><li>Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF%29+and+macrophage+CSF-dependent+macrophage+phenotypes+display+differences+in+cytokine+profiles+and+transcription+factor+activities%3A+implications+for+CSF+blockade+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation.</a> J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).</li>
<li>Lari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+lineage+phenotypes+and+osteoclastogenesis--complexity+in+the+control+by+GM-CSF+and%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and.</a> Bone. 40 (2), 323-336 (2007).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand-generated+murine+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cells+differ+in+their+capacity+to+prime+naive+CD8+T+cells+and+to+generate+memory+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo.</a> J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+culture+method+starting+with+early+growth+factors+permits+enhanced+production+of+functional+dendritic+cells+from+murine+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes.</a> J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).</li>
<li>Brasel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+synergizes+with+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+granulocyte+colony-stimulating+factor+to+mobilize+hematopoietic+progenitor+cells+into+the+peripheral+blood+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice.</a> Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).</li>
<li>Segura, E., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+dendritic+cells+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory dendritic cells in mice and humans.</a> Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).</li>
<li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).</li>
<li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li>
<li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+innate+immune+receptor+Dectin-1+upon+formation+of+a+%27phagocytic+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse.</a> Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).</li>
<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+of+cellular+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation.</a> Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).</li>
<li>Vander Lugt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+programming+of+dendritic+cells+for+enhanced+MHC+class+II+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation.</a> Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).</li>
<li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+regulates+alveolar+macrophage+differentiation+and+innate+immunity+in+the+lung+through+PU.1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1.</a> Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+Macrophage-CSF+Dependent+Macrophage+Responses+by+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models.</a> J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li>
<li>Poon, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+Binding+Identifies+a+Functionally+Distinct+Alveolar+Macrophage-like+Population+in+Bone+Marrow-Derived+Dendritic+Cell+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures.</a> J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).</li>
<li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c%28%2B%29MHCII%28%2B%29+Macrophages+and+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).</li>
<li>Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cells+solicit+their+own+help+from+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">cells solicit their own help from T cells.</a> J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).</li>
<li>de Belder, A. N., Wik, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+properties+of+fluorescein-labelled+hyaluronate%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate.</a> Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).</li>
<li>Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+CC+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).</li>
<li>Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+ligand+activation+of+murine+bone+marrow-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells.</a> Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).</li>
<li>Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-Activated+Dendritic+Cells%3A+%27Exhausted%27+or+Alert+and+Waiting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting.</a> J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).</li>
<li>Contreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Leishmania+mexicana+Infection+on+Dendritic+Cell+Signaling+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).</li>
<li>Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Mucosal+Dendritic+Cells+from+Bone+Marrow+Reveals+a+Critical+Role+of+Retinoic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid.</a> J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).</li>
<li>Grauer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+maturation+states+of+rat+bone+marrow-derived+dendritic+cells+using+an+improved+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique.</a> Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li>
<li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële belangensconflicten.

In dit manuscript, bieden we een werkwijze voor het GM-CSF macrofagen en DCs uit een enkele muis beenmerg cultuur die is aangepast van Lutz et al. 6. MHCII expressie en FL-HA binding maakt onderscheid tussen onrijpe DCs en macrofagen in deze cultuur (zie figuur 3C), die voorheen moeilijk is geweest. Dit, samen met een ander verslag Helft et al. 19, illustratie heterogeniteit in GM-CSF geïnduceerde BMDC culturen die voorheen gedacht alleen DCs zijn. Helft et al...

Verscheidene in vitro kweekmethoden zijn beschreven beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs) en beenmerg afgeleide DCs (BMDCs) via een of een combinatie van groeifactoren genereren. BMDMs kunnen worden gegenereerd door het kweken van beenmergcellen behulp van macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) of GM-CSF 1,2. Voor BMDCs de toevoeging van FLT3 ligand aan het beenmerg kweek leidt tot niet-hechtende klassieke en plasmacytoïde DCs (CD11c high / MHCII hoog en CD 11 c lo, B220 + respectievelijk) na 9 dagen in kweek 3,4. Daarentegen vereist de niet-hechtende cellen gegenereerd na 7 tot 10 dagen in kweek met GM-CSF alleen 5,6, GM-CSF en IL-4 7 of GM-CSF en FLT3 ligand 8,9 genereren BMDCs meer gelijkenis vertonen inflammatoire DCs (CD 11 c hoog, MHCII hoog CD11b +) 10. Hoewel deze in vitro kweken worden gebruikt voor het maken of macrofagenDCs, het is onduidelijk of elke kweek ontstaat pure populaties. Hoewel bijvoorbeeld hechtende cellen in de GM-CSF kweken worden beschreven macrofagen 5, de niet-hechtende cellen van dezelfde cultuur gebruikt als DCs 6,11-13, met de veronderstelling dat ze homogeen zijn en alle waargenomen variabiliteit is door verschillende ontwikkelingsstadia 14,15. Verder hebben studies GM-CSF blijkt een essentiële groeifactor voor alveolaire macrofaag ontwikkeling in vivo 16,17, en kan worden gebruikt in vitro alveolaire macrofagen-achtige 16,17,18 genereren. Anders dan hechting, de procedures voor het genereren van macrofagen en DC&#39;s van GM-CSF behandelde beenmerg culturen vergelijkbaar suggereren heterogeniteit kunnen bestaan ​​in GM-CSF beenmergkweken. Dit lijkt inderdaad het geval twee papers rapporteren de aanwezigheid van BMDMs in de niet-hechtende fractie van BMDC culturen. In een paper, ze Identificaed een populatie van cellen CD 11 c + CD11b +, MHCII midden, MerTK + en CD115 +, die een gen expressie signatuur die het meest leek op alveolaire macrofagen en had een verminderd vermogen om T-cellen 19 activeren expressie. De tweede papier gebruikt MHCII en FL-HA een alveolaire macrofaag-achtige bevolking te identificeren (CD 11 c +, MHCII mid / laag, FL-HA hoog) die verschilt van onvolwassen was (CD 11 c +, MHCII medio, FL-HA laag) en volwassen DCs (CD 11 c +, MHCII hoog), zowel fenotypisch en functioneel 18. Deze papieren beide illustreren dat GM-CSF BMDC culturen zijn heterogeen, met zowel macrofagen en DC populatie aangeeft dat zorg moet worden genomen bij het interpreteren van gegevens uit BMDC culturen. Dit protocol beschrijft hoe beenmerg, cultuur beenmergcellen in GM-CSF te isoleren en identificeren van de alveolaire macrofaag-achtigebevolking van de onrijpe en rijpe DCs in het beenmerg cultuur door middel van flowcytometrie met behulp van FL-HA-bindend en MHCII expressie. Deze procedure is gebaseerd op de vastgestelde procedure van Lutz c.s. 6 en kan genereren 5 -. 10 x 10 6 niet-hechtende cellen op dag 7 van 10 ml kweek. De cultuur is bruikbaar vanaf dagen 7-10 en levert een heterogene populatie van macrofagen, onrijpe en rijpe DCs, evenals een aantal voorlopers op dag 7. Dit is een eenvoudige werkwijze om te groeien en te isoleren in vitro alveolaire-achtige macrofagen in grote hoeveelheden.

<table><tbody><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD&nbsp;</td><td>LSR-II</td><td></td></tr><tr><td>Automated Inverted Microscope&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>DMI4000 B</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>ST-40R</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 1/2 Gauge Needle</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube&nbsp;</td><td>Corning</td><td>357070</td><td>*Falcon brand</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes (1.5 ml)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polystyrene round bottomed tubes</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tools</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>*Various&nbsp;</td><td>*Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer&nbsp;</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>*Falcon brand</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride</td><td>BDH</td><td>BDH0208-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651-5MG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-1KG</td><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630-080</td><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540-100G</td><td></td></tr><tr><td>LPS Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>BDH</td><td>BDH0268-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>BDH</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03-A</td><td></td></tr><tr><td>Rooster Comb Sodium Hyaluronate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H5388-1G</td><td>*Used to make fluoresceinated hyaluronan</td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21870-076</td><td>No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37&nbsp;&#176;C before using.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>5271-10&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma</td><td>50876-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5290-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Clone: 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-CD11c PeCy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0114-82</td><td>Clone: N418</td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 efluor450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Clone: RB6-8C5</td></tr><tr><td>Anti-MHCII APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5321-82</td><td>Clone: M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Biotinylated Anti-MerTK</td><td>Abcam</td><td>BAF591</td><td>Goat polyclonal IgG</td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie en identificatie van gm-csf afgeleide alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen van de muis beenmerg

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrofagen en dendritische cellen (DCs) zijn aangeboren immuuncellen gevonden in weefsels en lymfoïde organen die een belangrijke rol bij de afweer tegen ziekteverwekkers spelen. Ze zijn echter moeilijk te isoleren voldoende aantallen te bestuderen in detail hebben dan ook in vitro modellen ontwikkeld. In vitro kweken van beenmerg afgeleide macrofagen en dendritische cellen zijn duurzaam en waardevolle werkwijzen voor immunologische studies. Hier wordt een werkwijze voor het kweken en identificeren van zowel DCs en macrofagen uit een kweek van primaire beenmergcellen van de muis met het cytokine granulocyt macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF) beschreven. Dit protocol is gebaseerd op de vastgestelde procedure ontwikkeld door Lutz et al. in 1999 voor het beenmerg afgeleide DCs. De cultuur is heterogeen en MHCII en fluoresceïne hyaluronan (HA-FL) worden gebruikt om macrofagen van onrijpe en rijpe DCs onderscheiden. Deze GM-CSF afgeleid macrofagen provide een geschikte bron van in vitro afgeleide macrofagen die lijken alveolaire macrofagen zowel fenotype en functie.

Een stroomdiagram overzicht van de belangrijkste stappen van deze werkwijze wordt getoond in figuur 1. De dichtheid en de morfologie van het beenmerg kweek op verschillende tijdstippen van kweek worden getoond in Figuur 2. Op dag 1 zijn de cellen klein en dun maar dag 3, er meer cellen, wat groter en een paar begonnen te houden. Overdag 6 is er een duidelijke hechtende en niet-hechtende fractie (Figuur 2A). De kweek kan worden verzameld ...

Beendermergcellen gekweekt met granulocyte macrophage colony stimulerende factor (GM-CSF) genereren een heterogene cultuur die macrofagen en dendritische cellen (DC's) bevat. Deze methode benadrukt het gebruik van MHCII en hyaluronan (HA) binding om macrofagen te onderscheiden van de DC's in de GM-CSF cultuur. Macrofagen in deze cultuur hebben veel overeenkomsten met alveolaire macrofagen.

Generatie en identificatie van GM-CSF Afgeleide alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen van de muis beenmerg

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren en onderscheiden van alveolaire-achtige macrofagen van dendritische cellen in in vitro muizenbeenmergcelculturen aangevuld met GM-CSF. Deze in vitro methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de functie van dendritische cellen of macrofagen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er voldoende cellen kunnen worden gegenereerd en dat er onderscheid kan worden gemaakt tussen dendritische cellen en alveolaire-achtige macrofagen.De implicaties van deze techniek kunnen zich uitstrekken tot de therapie van pulmonale proteinose, aangezien het de verkrijging van alveolaire-achtige macrofagen vergemakkelijkt, die kunnen worden gebruikt om deze ziekte te behandelen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode oefening nodig hebben in het isoleren van de gereinigde botten en het spoelen van het beenmerg. Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig, omdat niet alle technieken gemakkelijk te begrijpen zijn enkel op basis van schriftelijke instructies.Schakel 15 minuten voor aanvang van de dissectie een biologische veiligheidskast in om de lucht in de kast te zuiveren, de luchtstroom te stabiliseren en het oppervlak van de kast te reinigen met 70% ethanol. Wanneer de kast gereed is, wordt een muis in buikligging op één tot twee papieren handdoeken geplaatst en wordt het dier bespoten met 70% ethanol. Til vervolgens met de niet-dominante hand de huid rond het borstgebied op en maak met een schaar een incisie.Pak beide uiteinden van de incisie vast en trek voorzichtig tot de twee uiteinden van de incisie bij de maag samenkomen. Plaats de muis vervolgens in rugligging en trek met één hand de onderste helft van de huid naar beneden tot de poten zijn blootgelegd. Houd de voet vast, snijd de achillespezen boven het enkelgewricht door en snijd de ligamenten die de spieren met de voet verbinden aan het onderste uiteinde van de tibia door, om de voet los te maken van de beenzuilen.Houd het been omhoog en verwijder de spieren en ligamenten rond het kniegewricht aan het onderste uiteinde van het femur om de dijspieren van het onderbeen te scheiden. Trek de losgemaakte spieren met een pincet voorzichtig weg van de oppervlakken van de fibula en het femur. Zet vervolgens de schaar in open stand bij het heupgewricht, roteer het been en trek voorzichtig aan het femur om het beenbot van het heupgewricht te scheiden, terwijl u het been van het lichaam lossnijdt.Houd nu het pootje bij het heupuiteinde vast met een steriele pincet en gebruik een andere pincet om de voet bij het enkeluiteinde te verwijderen. Houd vervolgens het distale uiteinde van het femur met één pincet en het proximale uiteinde van de tibia en fibula met een andere pincet vast, en buig de tibia en fibula voorzichtig in de tegenovergestelde richting van het kniegewricht om het onderbeen te scheiden van het femur en de patella. Gebruik de pincet om de resterende ligamenten, spieren en de fibula van de botten van het onderbeen te verwijderen en plaats de gereinigde tibia op een omgekeerd Petrischaaldeksel dat één tot twee milliliters HBSS/FCS bevat.Houd het onderste uiteinde van het femur met één set pincetten en de patella met een andere vast, buig de knie en het omliggende weefsel in de tegenovergestelde richting om het gewricht te verwijderen. Verwijder vervolgens al het resterende bindweefsel van het femur en plaats het bot op het omgekeerde Petri-schaaldeksel. Wanneer alle botten zijn geoogst, gebruik dan pincetten om eventueel resterend weefsel dat nog aan de botten vastzit te verwijderen en dompel de botten onder in 10 milliliters HBSS/FCS in de bodem van de Petri-schaal.Houd de schaal gedeeltelijk afgeschermd met een steriel deksel en knip elk van de gereinigde botten met een schaar doormidden. Gebruik vervolgens een injectiespuit van één milliliter, uitgerust met een naald van 26,5 gauge, om één milliliter HBSS/FCS uit de schaal in het uiteinde van elk botstuk te spoelen totdat al het rode beenmerg is vrijgemaakt. Duw eventuele zichtbare klonters beenmerg meerdere keren door de spuit om een enkelcellige suspensie te vormen, gevolgd door grondig mengen met een pipet van 10 milliliter.Breng de cellen over naar een opvangbuis en spoel de Petrischaal eenmaal met vijf milliliters HBSS/FCS om alle resterende cellen te verzamelen. Voeg vervolgens het spoelmiddel samen in de opvangbuis en plaats de cellen op ijs. Om een beenmergcelcultuur op te zetten, centreert u de verzamelde cellen en aspireert u het supernatant met een steriele glazen Pasteurpipet die is aangesloten op een vacuümafzuiging.Maak het pellet dat rijk is aan rode bloedcellen los door te tikken. Voeg vervolgens 10 milliliters RBC-lysebuffer toe en resuspendeer de cellen door te vortexen. Na een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur wordt de lyse gestopt met 10 milliliters HBSS/FCS en worden de cellen gecentrifugeerd, waarna het pellet wordt geresuspendeerd in beenmergcelmedium.Tel het aantal levensvatbare cellen via Trypan Blue-exclusie en breng de benodigde cellen over naar een nieuwe buis met beenmergcelmedium. Pelleteer de cellen vervolgens door middel van centrifugatie en resuspendeer de pellet in beenmergcelmedium met 20 nanograms per milliliter GM-CSF tot een verdunning van vier miljoen cellen per milliliter. Voeg vervolgens 9,5 milliliters beenmergcelmedium, aangevuld met 20 nanograms per milliliter GM-CSF, toe aan één steriele bacteriële petrischaal per cultuur en voeg 500 microliters cellen toe aan het centrum van elke schaal.Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2. Voeg op dag drie aan elke cultuur 10 mL vers beenmergmedium toe, aangevuld met 20 ng/mL GM-CSF, waarbij u voorzichtig bent om verstoringen van de cellen te minimaliseren. Draag op dag zes voorzichtig 10 mL van het supernatant van de celcultuur over naar een steriele conische buis van 50 mL.Centrifugeer de cellen en resuspendeer het pellet in 10 milliliters vers beenmergcelmedium, dat 20 nanograms per milliliter GM-CSF bevat. Vortex vervolgens voorzichtig de celsuspensie en breng de cellen terug naar de kweekschaal. Op dag één zijn de beenmergcellen klein en schaars, maar tegen dag drie zijn de cellen in aantal en grootte toegenomen en zijn sommige cellen begonnen te adhereren.Tegen dag zes zijn er meer cellen aanwezig en worden zowel adherente als niet-adherente fracties waargenomen. De cultuur kan van dag zeven tot 10 worden geoogst en worden gesegmenteerd op grootte en levende cellen, waarbij een hoger percentage CD11c-positieve cellen wordt verkregen uit culturen van dag 10. Op dag zeven is de verzamelde niet-adherente fractie sterk verrijkt met cellen met een dendritische morfologie.De CD11c-positieve, GR1-negatieve populaties, geoogst op dag zeven en 10, kunnen worden onderverdeeld in drie hoofdpopulaties: macrofagen, onrijpe dendritische cellen en rijpe dendritische cellen, op basis van MHCII-expressie en FL-HA-binding. Opvallend is dat MerTK, hoewel beschouwd als een macrofaagmarker, een sterke expressie vertoont in zowel de macrofaag- als de onrijpe dendritische celpopulaties die op dag zeven en 10 zijn geoogst, terwijl een laag expressieniveau wordt waargenomen bij rijpe dendritische cellen.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gedurende de gehele winning van beenmerg en de celkweek steriele technieken toe te passen. Na deze procedure kunnen de cellen worden gesorteerd om celpopulaties afzonderlijk te bestuderen, of ze kunnen worden gestimuleerd met inflammatoire agentia en vervolgens worden geanalyseerd op hun cytokinenproductie via intracellulaire kleuring en flowcytometrie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe beenmergcellen worden geïsoleerd en in GM-CSF worden gekweekt om zowel dendritische cellen als alveolaire-achtige macrofagen te genereren.

generation-identification-gm-csf-derived-alveolar-like-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto's tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Antigeen presentatie in secundaire lymfoïde organen door de dendritische cellen is cruciaal voor de opening van het T-cel gemedieerde adaptieve immuunrespons. Hier laten we zien de cultuur van beenmerg afgeleide dendritische cellen van muizen, activering, en de etikettering voor 2-photon imaging.

Generatie van beenmerg afgeleide Murine dendritische cellen voor gebruik in twee-foton Imaging

This video describes a protocol for the generation of dendritic cells--key antigen-presenting cells that activate T cells--from the bone marrow of an adult mouse.

Bone Marrow-Derived Dendritic Cells Generation: A Method to Generate Dendritic Cells from Mouse Bone Marrow

Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk...

Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen

Macrofagen zijn lang erkend als een kritische component van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De recente explosie van kennis met betrekking tot evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van de interactie tussen macrofagen en microben heeft wetenschappelijke aandacht vernieuwd macrofagen. Dit artikel beschrijft een methode om macrofagen te onderscheiden van muizen beenmerg.

Bone Marrow-afgeleide macrofagen Productie

Hier bieden we een methode voor het vaststellen en isoleren van grote aantallen van GM-CSF gedreven myeloïde cellen met hoge snelheid cel sorteren. Vijf verschillende populaties (gemeenschappelijk myeloïde voorlopercellen, granulocyt/macrofaag progenitoren monocyten, monocyt-afgeleide macrofagen en monocyt-afgeleide DCs) kunnen worden geïdentificeerd op basis van Ly6C en CD115 expressie.

Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

In dit artikel geven wij dat een gedetailleerd protocol voor de expressie van fluorescerende fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen. De methode is gebaseerd op de transductie van het beenmerg progenitoren met retrovirale constructies gevolgd door differentiatie in macrofagen en dendritische cellen in vitro.

Expressie van fluorescerende Fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen.

Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

Dit protocol beschrijft een niet-enzymatische en eenvoudige methode voor het isoleren van 7-9 dagen oude neonatale beenmergcellen van muizen en het genereren van gedifferentieerde macrofagen met behulp van een supernatans van L929-cellen als bron van granulocytkoloniestimulerende factor (M-CSF). De van beenmerg afgeleide macrofagen werden verder geanalyseerd op oppervlakteantigenen F4/80, CD206, CD11b en functionele competentie.

Neonatale beenmergisolatie bij muizen en bereiding van van beenmerg afgeleide macrofagen

Leer alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen genereren uit muizenbeenmerg met GM-CSF-supplementatie. Deze methode onderscheidt celtypen via MHCII en hyaluronan-binding voor immunologisch onderzoek.

Generatie en identificatie van GM-CSF Afgeleide alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen van de muis beenmerg

Meer video's verkennen