Generatie en identificatie van GM-CSF Afgeleide alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen van de muis beenmerg

Het algemene doel van deze procedure is om alveolair-achtige macrofagen te genereren en te onderscheiden van dendritische cellen in in vitro muis beenmergcellenculturen aangevuld met GM-CSF. Deze in vitro-methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de functie van dendritische cellen of macrofagen. Het grote voordeel van de techniek is dat het voldoende celaantal kan genereren en het kan onderscheid maken tussen dendritische cellen en alveolair-achtige macrofagen.

De implicaties van deze techniek kunnen zich uitstrekken tot de therapie van pulmonaire proteïnose omdat het de verwerving van alveolair-achtige macrofagen vergemakkelijkt, die kunnen worden gebruikt om deze ziekte te behandelen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode, oefening nodig hebben met het isoleren van de gereinigde botten en het doorspoelen van het beenmerg. Visuele demonstratie van deze methode is nuttig omdat niet alle technieken die worden gebruikt, gemakkelijk te begrijpen zijn door alleen schriftelijke instructies.

15 minuten voordat u begint met de dissectie, zet u een biologisch veiligheidskabinet aan om de kabinetlucht te zuiveren en om de luchtstroom te stabiliseren, en maak het oppervlak van het kabinet schoon met 70%ethanol. Wanneer het kabinet klaar is, plaatst u een muis op een tot twee papieren handdoeken in buikligging en spuit het dier met 70%ethanol. Vervolgens, met de niet-dominante hand, til de huid rond het thoracale gebied op en gebruikt u een schaar om een incisie te maken.

Pak beide uiteinden van de incisie vast, trek voorzichtig totdat de twee uiteinden van de incisie bij de maag samenkomen. Plaats vervolgens de muis in rugligging en gebruik een hand om de onderste helft van de huid naar beneden te trekken totdat de poten zichtbaar zijn. Houd de voet vast, snij de achillespezen boven het enkelgewricht en de ligamenten die de spieren met de voet verbinden aan het onderste uiteinde van het scheenbeen om de voet los te maken van de beenderen van het been.

Houd het been omhoog, verwijder de spieren en ligamenten rond het kniegewricht aan het onderste uiteinde van het dijbeen om de dijspieren los te maken van het onderbeen. Gebruik pincetten om de losgemaakte spieren voorzichtig van de fibula- en dijbeenoppervlakken te trekken. Druk vervolgens de schaar in de open positie bij het heupgewricht, draai het been en trek voorzichtig aan het dijbeen om het beenbot los te maken van het heupgewricht terwijl het been los wordt gesneden van het lichaam.

Nu het been bij het heupuiteinde met een steriele pincet vasthoudt, gebruikt u een andere pincet om de voet van het enkeluiteinde te verwijderen. Houd vervolgens het distale uiteinde van het dijbeen met één pincet en het proximale uiteinde van het scheenbeen en kuitbeen met een ander, buig voorzichtig het scheenbeen en kuitbeen in de tegenovergestelde richting van het kniegewricht om het onderbeen los te maken van het dijbeen en de knieschijf. Gebruik de pincetten om de resterende ligamenten, spieren en kuitbeen van de onderbeenbotten te verwijderen en plaats het schoongemaakte scheenbeen op een omgekeerd petrischaaldeksel, dat een tot twee milliliters HBSS/FCS bevat.

Houd het onderste uiteinde van het dijbeen vast met een set pincetten en het knieschijfje met een andere, buig het kniegewricht en de omliggende weefsels in de tegenovergestelde richting om het gewricht te verwijderen. Vervolgens verwijdert u eventueel resterend bindweefsel van het dijbeen en plaatst u het bot op het omgekeerde petrischaaldeksel. Wanneer alle botten zijn geoogst, gebruikt u pincetten om eventueel nog resterend weefsel dat aan de botten is gehecht te verwijderen en dompelt u de botten in 10 milliliters HBSS/FCS in de basis van de petrischaal.

Houd de schaal gedeeltelijk beschermd met een steriele deksel, snijd elk van de gereinigde botten met een schaar doormidden. Gebruik vervolgens een eenmilliliterspuit, uitgerust met een 26,5-gauge naald om één milliliter HBSS/FCS van de schaal in het uiteinde van elk botgedeelte te spoelen totdat al het rode beenmerg is bevrijd. Breng eventuele zichtbare klonten beenmerg meerdere keren door de spuit om een enkele celsuspensie te vormen, gevolgd door grondig mengen met een 10 milliliter pipette.

Breng de cellen over naar een opvangbuis en spoel de petrischaal eenmaal af met vijf milliliters HBSS/FCS om eventuele resterende cellen te verzamelen. Breng vervolgens de spoeling samen in de opvangbuis en plaats de cellen op ijs. Om een beenmergcellencultuur op te zetten, centrifugeert u de verzamelde cellen en zuigt u het supernatant af met een steriele glazen Pasteurpipet die is bevestigd aan vacuümzuiging.

Maak het roodbloedcelrijke pellet los met kloppen. Voeg vervolgens 10 milliliters RBC-lysebuffer toe en resuspendeer de cellen met vortexen. Na een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur, stopt u de lyse met 10 milliliters HBSS/FCS en centrifugeert u de cellen, waarbij u het pellet hersuspendeert in beenmergcellenmedium.

Tel het aantal levensvatbare cellen door Trypan Blue-uitsluiting en breng de benodigde cellen over in een nieuwe buis met beenmergcellenmedium. Verzamel vervolgens de cellen door centrifugatie en resuspendeer het pellet in een verdunning van vier miljoen cellen per milliliter in beenmergcellenmedium met 20 nanogram per milliliter GM-CSF. Voeg vervolgens 9,5 milliliters beenmergcellenmedium toe dat is aangevuld met 20 nanogram per milliliter GM-CSF aan één steriele bacteriële petrischaal per cultuur en voeg 500 microliters cellen toe aan het midden van elke schaal.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2. Op dag drie, voeg 10 milliliters vers beenmergmedium toe dat is aangevuld met 20 nanogram per milliliter GM-CSF aan elke cultuur, waarbij u zorgt voor minimale verstoringen van de cellen. Op dag zes, breng voorzichtig 10 milliliters celcultuursupernatant over naar een steriele 50 milliliter conische buis.