Generatie en identificatie van GM-CSF Afgeleide alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen van de muis beenmerg

Het algemene doel van deze procedure is het genereren en onderscheiden van alveolaire-achtige macrofagen van dendritische cellen in in vitro muizenbeenmergcelculturen aangevuld met GM-CSF. Deze in vitro methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de functie van dendritische cellen of macrofagen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er voldoende cellen kunnen worden gegenereerd en dat er onderscheid kan worden gemaakt tussen dendritische cellen en alveolaire-achtige macrofagen.

De implicaties van deze techniek kunnen zich uitstrekken tot de therapie van pulmonale proteinose, aangezien het de verkrijging van alveolaire-achtige macrofagen vergemakkelijkt, die kunnen worden gebruikt om deze ziekte te behandelen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode oefening nodig hebben in het isoleren van de gereinigde botten en het spoelen van het beenmerg. Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig, omdat niet alle technieken gemakkelijk te begrijpen zijn enkel op basis van schriftelijke instructies.

Schakel 15 minuten voor aanvang van de dissectie een biologische veiligheidskast in om de lucht in de kast te zuiveren, de luchtstroom te stabiliseren en het oppervlak van de kast te reinigen met 70% ethanol. Wanneer de kast gereed is, wordt een muis in buikligging op één tot twee papieren handdoeken geplaatst en wordt het dier bespoten met 70% ethanol. Til vervolgens met de niet-dominante hand de huid rond het borstgebied op en maak met een schaar een incisie.

Pak beide uiteinden van de incisie vast en trek voorzichtig tot de twee uiteinden van de incisie bij de maag samenkomen. Plaats de muis vervolgens in rugligging en trek met één hand de onderste helft van de huid naar beneden tot de poten zijn blootgelegd. Houd de voet vast, snijd de achillespezen boven het enkelgewricht door en snijd de ligamenten die de spieren met de voet verbinden aan het onderste uiteinde van de tibia door, om de voet los te maken van de beenzuilen.

Houd het been omhoog en verwijder de spieren en ligamenten rond het kniegewricht aan het onderste uiteinde van het femur om de dijspieren van het onderbeen te scheiden. Trek de losgemaakte spieren met een pincet voorzichtig weg van de oppervlakken van de fibula en het femur. Zet vervolgens de schaar in open stand bij het heupgewricht, roteer het been en trek voorzichtig aan het femur om het beenbot van het heupgewricht te scheiden, terwijl u het been van het lichaam lossnijdt.

Houd nu het pootje bij het heupuiteinde vast met een steriele pincet en gebruik een andere pincet om de voet bij het enkeluiteinde te verwijderen. Houd vervolgens het distale uiteinde van het femur met één pincet en het proximale uiteinde van de tibia en fibula met een andere pincet vast, en buig de tibia en fibula voorzichtig in de tegenovergestelde richting van het kniegewricht om het onderbeen te scheiden van het femur en de patella. Gebruik de pincet om de resterende ligamenten, spieren en de fibula van de botten van het onderbeen te verwijderen en plaats de gereinigde tibia op een omgekeerd Petrischaaldeksel dat één tot twee milliliters HBSS/FCS bevat.

Houd het onderste uiteinde van het femur met één set pincetten en de patella met een andere vast, buig de knie en het omliggende weefsel in de tegenovergestelde richting om het gewricht te verwijderen. Verwijder vervolgens al het resterende bindweefsel van het femur en plaats het bot op het omgekeerde Petri-schaaldeksel. Wanneer alle botten zijn geoogst, gebruik dan pincetten om eventueel resterend weefsel dat nog aan de botten vastzit te verwijderen en dompel de botten onder in 10 milliliters HBSS/FCS in de bodem van de Petri-schaal.

Houd de schaal gedeeltelijk afgeschermd met een steriel deksel en knip elk van de gereinigde botten met een schaar doormidden. Gebruik vervolgens een injectiespuit van één milliliter, uitgerust met een naald van 26,5 gauge, om één milliliter HBSS/FCS uit de schaal in het uiteinde van elk botstuk te spoelen totdat al het rode beenmerg is vrijgemaakt. Duw eventuele zichtbare klonters beenmerg meerdere keren door de spuit om een enkelcellige suspensie te vormen, gevolgd door grondig mengen met een pipet van 10 milliliter.

Breng de cellen over naar een opvangbuis en spoel de Petrischaal eenmaal met vijf milliliters HBSS/FCS om alle resterende cellen te verzamelen. Voeg vervolgens het spoelmiddel samen in de opvangbuis en plaats de cellen op ijs. Om een beenmergcelcultuur op te zetten, centreert u de verzamelde cellen en aspireert u het supernatant met een steriele glazen Pasteurpipet die is aangesloten op een vacuümafzuiging.

Maak het pellet dat rijk is aan rode bloedcellen los door te tikken. Voeg vervolgens 10 milliliters RBC-lysebuffer toe en resuspendeer de cellen door te vortexen. Na een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur wordt de lyse gestopt met 10 milliliters HBSS/FCS en worden de cellen gecentrifugeerd, waarna het pellet wordt geresuspendeerd in beenmergcelmedium.

Tel het aantal levensvatbare cellen via Trypan Blue-exclusie en breng de benodigde cellen over naar een nieuwe buis met beenmergcelmedium. Pelleteer de cellen vervolgens door middel van centrifugatie en resuspendeer de pellet in beenmergcelmedium met 20 nanograms per milliliter GM-CSF tot een verdunning van vier miljoen cellen per milliliter. Voeg vervolgens 9,5 milliliters beenmergcelmedium, aangevuld met 20 nanograms per milliliter GM-CSF, toe aan één steriele bacteriële petrischaal per cultuur en voeg 500 microliters cellen toe aan het centrum van elke schaal.

Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2. Voeg op dag drie aan elke cultuur 10 mL vers beenmergmedium toe, aangevuld met 20 ng/mL GM-CSF, waarbij u voorzichtig bent om verstoringen van de cellen te minimaliseren. Draag op dag zes voorzichtig 10 mL van het supernatant van de celcultuur over naar een steriele conische buis van 50 mL.

Centrifugeer de cellen en resuspendeer het pellet in 10 milliliters vers beenmergcelmedium, dat 20 nanograms per milliliter GM-CSF bevat. Vortex vervolgens voorzichtig de celsuspensie en breng de cellen terug naar de kweekschaal. Op dag één zijn de beenmergcellen klein en schaars, maar tegen dag drie zijn de cellen in aantal en grootte toegenomen en zijn sommige cellen begonnen te adhereren.

Tegen dag zes zijn er meer cellen aanwezig en worden zowel adherente als niet-adherente fracties waargenomen. De cultuur kan van dag zeven tot 10 worden geoogst en worden gesegmenteerd op grootte en levende cellen, waarbij een hoger percentage CD11c-positieve cellen wordt verkregen uit culturen van dag 10. Op dag zeven is de verzamelde niet-adherente fractie sterk verrijkt met cellen met een dendritische morfologie.

De CD11c-positieve, GR1-negatieve populaties, geoogst op dag zeven en 10, kunnen worden onderverdeeld in drie hoofdpopulaties: macrofagen, onrijpe dendritische cellen en rijpe dendritische cellen, op basis van MHCII-expressie en FL-HA-binding. Opvallend is dat MerTK, hoewel beschouwd als een macrofaagmarker, een sterke expressie vertoont in zowel de macrofaag- als de onrijpe dendritische celpopulaties die op dag zeven en 10 zijn geoogst, terwijl een laag expressieniveau wordt waargenomen bij rijpe dendritische cellen.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gedurende de gehele winning van beenmerg en de celkweek steriele technieken toe te passen. Na deze procedure kunnen de cellen worden gesorteerd om celpopulaties afzonderlijk te bestuderen, of ze kunnen worden gestimuleerd met inflammatoire agentia en vervolgens worden geanalyseerd op hun cytokinenproductie via intracellulaire kleuring en flowcytometrie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe beenmergcellen worden geïsoleerd en in GM-CSF worden gekweekt om zowel dendritische cellen als alveolaire-achtige macrofagen te genereren.