Name: Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Leer hoe u retrogene muizen genereert via retrovirale transductie van beenmerg stamcellen om T-cel receptor functie in vivo te bestuderen. Deze methode elimineert founder effecten en reconstitueert het T-cel compartiment in ongeveer zeven weken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (5K22A1119151-01 en 1R56DK104903-01) naar MLB, Pilot / Haalbaarheid Programma van het Diabetes Research Center (P30-DK079638) bij BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, AAI werk in Immunology Fellowship naar MB, en The Robert en Janice McNair Foundation.

Ethiek Verklaring: Er wordt alles aan gedaan om dieren pijn of stress tot een minimum tijdens de bestraling en staartader injecties te noteren. Muizen worden gebruikt als bron van cellen in deze experimenten; welke er eigenlijk geen procedures of manipulaties behalve euthanasie. Muizen worden gedood door CO 2 inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie gedood bevestigen. Deze procedure is in overeenstemming met de aanbevelingen van het panel voor euthanasie van de American Veterinary Medical Association. 1. Bereid Retrovirale Construct <ol><li> Subkloon de T-celreceptor (TCR) alfa- en bèta-ketens, gescheiden door een linker 2A, in een MSCV gebaseerde retrovirale 11 vector (bijvoorbeeld pMIAII of pMIGII) 11. OPMERKING: De linker 2A maakt stoichiometrische en overeenstemmende expressie van de alfa- en bèta-ketens van TCR een enkel open leeskader. De vector omvat een cassette IRES fluorescent eiwit (GFP of ametrine) bevindt waarmeebijhouden getransduceerde cellen en transductie efficiëntie. Voor een gedetailleerd protocol zie Holst et al. 11 </li><li> Isoleer plasmide-DNA van commercieel verkregen plasma prep kit of een soortgelijk product. Gebruik een werkende concentratie van 1-2 ug gl -1. </li></ol> 2. Het genereren van retrovirale productiecellijnen <ol><li> Gebruik van een tweestapsproces voor de retrovirale producerende cellijnen. LET OP: Voor een gedetailleerd protocol, kijk dan op Holst et al. 11. <ol><li> Genereer retrovirus door kortstondige transfectie van 293T-cellen met drie plasmiden (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) en vector van interesse 11) en neem de retrovirale supernatans van de 293T cellen naar de GP + E86 ecotropische retrovirale producer cellijn transduceren. </li><li> Isoleer de top 40% van fluorescente expressie GP + E86 producerende cellen door FACS en propageren transdcuced-GP + E86 producerende cellen als een bron van het virus. LET OP: Het producerenhoge-titer producenten essentieel is voor efficiënte transductie van beenmergcellen. Voor een compleet protocol kunt u bekijken Holst et al. 11 </li></ol></li></ol> 3. retrovirus-gemedieerde Stem Cell Gene Transfer (Dag -5) <ol><li> Ontdooien en cultuur 0,5 -1,0 x 10 6 van elke GP + E86 producerende cellijn in compleet DMEM 10% (vol / vol) FBS om voldoende groei voor twee samenvloeiende 150 mm platen toestaan ​​by Day 0 van dit protocol. OPMERKING: Ontdooien 0,5-1,0 x 10 6 van elke GP + E86 producerende cellijn in een 10 cm plaat zal voor 30 - 50% confluentie op dag 5. Dit maakt ook 5 dagen kweken teneinde de GP + E86 vergroten producerende cellijnen tot twee samenvloeiende 150-mm platen op dag 0. <ol><li> Cultuur retrovirale producerende cellijn volledig weefselkweekmedium met 5% kalfserum feta en ciprofloxacine (10 ug / ml) om mycoplasma te voorkomen. LET OP: Stop gebruik van ciprofloxacine bij generating het virale supernatant voor beenmerg transductie. Vermijd over-groei van de producerende cellijn, omdat dit een negatieve invloed zal hebben beenmerg transductie efficiëntie. </li></ol></li></ol> 4. Injecteer Donor Muizen met 5-fluorouracil (5-FU) (Dag -3) <ol><li> Weeg de donor muizen (5-12 weken oud) de hoeveelheid 5-FU moeten worden onderzocht. Bij muizen jonger dan 5 weken resulteert in een lage opbrengst beenmerg. Om de expressie van een enkel TCR te garanderen, gebruik dan een T-cel deficiënte muizen stam zoals SCID, RAG of TCR alfa-deficiënte muizen beenmerg donoren. </li><li> Werken in weefselkweek kap verdunnen 5-FU voorraad met steriele PBS om een voldoende hoeveelheid 10 mg ml -1 werkoplossing van 5-FU 0,15 mg 5-FU leveren per gram lichaamsgewicht maken. </li><li> Met behulp van een 1 ml spuit met een 37 G naald, intraperitoneaal injecteren 0,15 mg 5-FU per gram lichaamsgewicht per donormuis. LET OP: Gebruik 1 donor muis per één ontvanger te starten en aan te passenhet aantal donormuizen volgens de celopbrengst. Een andere methode dan 5-FU behandeling voor de verrijking en isolatie van beenmerg progenitoren negatief winkelwagentje lineage positieve cellen zoals beschreven in Viret et al. </li></ol> 5. Bone Marrow Extraction Procedure (Dag 0) <ol><li> Verkrijgen van dissectie schaar en pincet voor bot- isolement. Bereid medium (HBSS aangevuld met 5% FCS (vol / vol)) aan botten in een 50 ml conische buis verzamelen. Houd 50 ml conische bevattende media op ijs. Euthanaseren muizen door CO 2 inhalatie, gevolgd door breken van de nek tot de dood te bevestigen. Knijp poot om ervoor te zorgen er geen reflexen worden gedetecteerd. </li><li> Steriliseer de operatieplaats en chirurgische instrumenten met ethanol of methanol. Verwijder het dijbeen, het scheenbeen, opperarmbeen en bekken zorgvuldig door eerst snijden en onder de bekkengordel. Bezuinigen langs het dijbeen aan het scheenbeen. Verwijder al het omringende weefsel met een schaar en een tang om schoon botten te krijgen. Houdenbeenderen gehydrateerd in HBSS + 5% (vol / vol) FBS. </li><li> Scheid de botten door te snijden in de gewrichten, zorg ervoor te snijden beide uiteinden af ​​aan iedere bot. Plaats een 25-gauge naald bevestigd aan een 10 ml spuit met HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Oefen druk uit en spoel alle beenmerg door een 70-um zeef rust in een 50 ml conische. </li><li> Van tijd tot tijd, duw het beenmerg door het 70-um filter met behulp van de zuiger van een 1 ml of 3 ml spuit. Spoel de zeef met HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Zodoende wordt een enkele celsuspensie die vrij is van botfragmenten en weefsel. Houd cellen steriel door het uitvoeren van de procedure in een steriele kap. </li><li> Centrifugeer beenmergcellen bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li></ol> 6. Bone Marrow Cultuur (Dag 0) <ol><li> Giet of aspireren media en resuspendeer celpellet in 1 ml ammoniumchloride gebaseerd rode bloedcellen lysisbuffer (of RBC lysisbuffer equivalent) per 50 ml conische buis. Na 1 minuut incuberen bij kamertemperatuurtemperatuur, doof de rode cel lysis buffer door toevoeging van 10 ml volledig DMEM 20% (vol / vol) FBS. </li><li> Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Decanteren of aspireren supernatant en resuspendeer beenmerg in 5 ml compleet DMEM 20% (vol / vol) FBS. Tel de cellen met een Neubauer telkamer. LET OP: General opbrengst moet ongeveer 5-10 x 10 6 cellen per muis; echter kan de opbrengst variëren tussen verschillende muizenstammen. </li><li> Plaat beenmergcellen bij een dichtheid van 4 x 10 7 cellen per 150 mm plaat in 30 ml volledig DMEM 20% (vol / vol) FBS aangevuld met IL-3 (20 g -1 ml), IL-6 (50 g -1 ml) en SCF (50 g ml-1). LET OP: Maak gebruik van vers ontdooide-porties verdeeld cytokines. Niet cytokines die zijn ingevroren en ontdooid meerdere keren en bewaard bij 4 ° C gedurende meer dan 2 weken gebruiken. </li><li> Incubeer beenmerg overnacht (ongeveer 24 uur) bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol><ol><li> Plaat 3 x 10 6 retrovirale producerende cellen per 150 mm plaat in 18 ml compleet DMEM 20% (vol / vol) FBS. </li><li> Incubeer retrovirale productiecellen bij 37 ° C overnacht. Anticipeer op één 150-mm platen voor 15 miljoen beenmergcellen (ongeveer 2-3 donor muizen). </li></ol> 8. retrovirale Supernatant (dag 1) <ol><li> De volgende dag (ongeveer 24 uur later), de oogst van de retrovirale supernatans van de producent platen (opgericht in stap 7) door het opstellen van de retrovirale supernatant rechtstreeks af van de 150-mm plaat met een 10-ml spuit en filter met behulp van een 0,45 -μm spuitfilter. </li><li> Vervang de verwijderde retrovirale supernatant met 18 ml vers compleet DMEM 20% (vol / vol) FBS. </li><li> Vul het gefiltreerde supernatant retrovirale met IL-3 (20 g -1 ml), IL-6 (50 g ml-1), MSCF (50 g ml-1) en hexadimethrinebromide (polybreen) (6 &amp;# 956; g ml-1). OPMERKING: hexadimethrinebromide moet vers elke 2 maanden aan een daling van de efficiëntie van retrovirale transductie voorkomen. </li></ol> 9. Bone Marrow Harvest (dag 1) <ol><li> Na het voltooien van stap 8,3, de oogst van de beenmergcellen uit stap 6.4 en breng het medium dat niet-hechtende cellen in steriele 50 ml buizen. </li><li> Was de platen krachtig met 10 ml PBS en verzamelen in de 50 ml conische uit stap 9.1. Indien nodig, herhaal het wassen stap. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 10 min bij 4 ° C, giet het supernatant, resuspendeer cellen in een klein volume (1-3 ml) compleet DMEM 20% (vol / vol) FBS en tellen. Anticiperen 50-75% herstel van dag 0 Resuspendeer beenmerg bij 1 x 10 6 cellen per 1 ml van het retrovirale supernatans dat cytokines en hexadimethrinebromide. </li></ol> 10. Bone Marrow Transductie (dag 1) <ol><li> Plate de retrovirale supernatant / bot marrow mengsel met een volume van 3 ml per putje in een zes-well weefselkweekplaat. Wikkel de platen in plastic folie om gasuitwisseling tijdens het centrifugeren in stap 10.2 minimaliseren. </li><li> Draai de verpakte zes-well platen bij 1000 xg gedurende 60 minuten werd een 37 ° C. </li><li> Na de spin is voltooid, verwijdert u de plastic verpakking en plaats de platen in een 37 ° C CO 2 incubator voor 24 uur. </li></ol> 11. Retrovirale Supernatant en Transductie (dag 2) <ol><li> Na 24 uur, het verzamelen van verse virale supernatant van het virale producer cellijn. Filter de retrovirale supernatant met behulp van een 10 ml spuit en een 0,45 urn spuitfilter. Vul het gefiltreerde supernatant retrovirale met IL-3 (20 g -1 ml), IL-6 (50 g -1 ml) en SCF (50 g ml-1) en hexadimethrinebromide (6 g ml-1). </li><li> Vervolgens, verwijder voorzichtig met een pipet of zuigen boven 2 ml medium uit elk putje van zes-well plaat met beenmergcellen. OPMERKING: Werk voorzichtig niet het beenmerg, die gewoonlijk geconcentreerd in het midden van de put te zuigen. Als alternatief kan de verwijderde bovenstaande vloeistof naar beneden worden gecentrifugeerd om eventuele verloren beenmergcellen te herstellen. </li><li> Aan elk putje in het beenmerg 6-well plaat 3 ml verse virale supernatant die cytokines en hexadimethrinebromide. Wikkel de platen in plastic, en herhaal de spin transductie bij 1000 xg gedurende 60 minuten werd een 37 ° C. Uitpakken van de platen en incubeer cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende de nacht (ongeveer 24 uur). </li></ol> 12. Toevoeging van Fresh gesupplementeerd DMEM (dag 3) <ol><li> Na 24 uur, verwijder de bovenste 2 ml medium uit elk putje van zes-well plaat met beenmergcellen, zoals in stap 11,2. Vervang het verwijderde medium met vers DMEM 20% (vol / vol) FBS aangevuld met eindconcentraties van IL-3 (20 g -1 ml), IL-6 (50 g -1 ml) en SCF (50 g ml-1) . </li><li> Incubate beenmergplaten bij 37 ° C CO 2 incubator gedurende nog eens 24 uur. </li></ol> 13. Harvest getransduceerde Bone Marrow (dag 4) <ol><li> Na 24 uur, verzamel de beenmergcellen van de zes-well platen. Was de plaatjes krachtig met PBS om alle niet-hechtende cellen te verwijderen. <ol><li> Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 10 min bij 4 ° C en giet het supernatant. </li><li> Resuspendeer het beenmerg in een klein volume (1 ml) PBS + 0,5% (vol / vol) door warmte geïnactiveerd FBS. Houd cellen op ijs. </li></ol></li><li> Neem een ​​10-ul monster van elk beenmerg toestand en de telling van de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Uitgaande 1-2 donor per ontvanger, zal de opbrengst voldoende om ten minste 4 x 10 6 cellen per ontvangende muis transfereren. Resuspendeer het beenmerg in een voldoende volume PBS + 0,5% (vol / vol) door warmte geïnactiveerd FBS injecteren 200-300 pl per muis. <ol><li> Injecteer ten minste 2 x 10 6 cellen met een transductie efficiëntievan 25% (kan injecteren tot 8 x10 6 cellen) per muis intraveneus. LET OP: We routinematig injecteren vijf ontvangende muizen per twee 6-well platen van beenmergcellen. Indien het rendement aanzienlijk lager zou meer donormuizen worden gebruikt als het voldoende beenmerg nummer is te vinden. Om optimaal herstel werd bereikt, ten minste 5 x 10 5 getransduceerd (TL positief) worden geïnjecteerd in elke ontvanger. </li></ol></li><li> Met een micro pipet, neem een 10-ul monster van elk beenmerg conditie en analyseren transductie efficiency door middel van flowcytometrie op basis van de expressie van de fluorescente merker (Figuur 1A) 11. OPMERKING: algemeen, het percentage positieve fluorescerende cellen tussen 25% en 70%, afhankelijk van het construct en retrovirale titer. Het aantal getransduceerde beenmergcellen moet los een sub-dodelijk bestralen muis kunnen variëren naargelang de transductie efficiëntie. Hoe lager de transduction doelmatigheid het meest beenmergcellen vereist en, hoe groter het beenmerg transductie efficiëntie, het lagere aantal cellen nodig voor reconstitutie. Transductierendement dan 25% is niet optimaal en kan leiden tot onvoldoende reconstitutie en overleving. Om een ​​optimale beenmergherstel en transductie efficiëntie, gebruik van vers bereide weefselkweekmedia en cytokinen. Wanneer expressie van een nieuw gebruik van de TCR retrogenic systeem, de selectie van die TCR in vivo is onbekend. Afhankelijk van elke individuele TCR affiniteit zal TCR selectie in de thymus en perifere T-cel expressie 17 variëren. </li></ol> 14. Mouse Bestraling, Bone Marrow Injection en Zorg <ol><li> Bestralen muizen de dag voor beenmerg injectie (dezelfde dag als Stap 13). Gebruik de volgende doses: C57BL / 6 muizen (en ander wild type stammen), 900 rad; RAG1 - / - muizen, 500 rad; scid muizen, 300 rad). <ol><li> Plaats ontvangende muizen op amoxicilline (50 mg / kg / dag) of een ander antibioticum waterbehandeling vóór de bestraling en blijven antibiotica voor de eerste twee weken na beenmergtransplantatie injectie. OPMERKING: optimale stralingsdosis mogelijk moet empirisch worden bepaald. </li></ol></li><li> Voor injectie, laadt u de cellen van stap 13.1 in een 1-ml spuit met behulp van stompe naalden direct vóór de injectie, verander dan de naald 27-gauge voor injectie, te verdrijven eventuele lucht om luchtembolie te voorkomen. Warmte muizen onder een warmtelamp en injecteer 0,2 ml per muis beenmerg intraveneus. NB: Laat cellen zitten in de spuit voor langere tijd of de cellen zal vestigen. </li><li> Controleer de muizen wekelijkse zodat ze gezond blijven. </li><li> Na 5-6 weken, ontlucht de muizen reconstitutie controleren op basis van GFP + / + ametrine en TCR co-expressie (Figuur 1B) 11. </li></ol>

<ol><li>Qi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+clonal+selection+in+the+human+T-cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).</li>
<li>Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+diversity%2C+completeness%2C+and+cross-reactivity+of+the+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire.</a> Frontiers in immunology. 4, 485(2013).</li>
<li>Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+in+T-cell-receptor+transgenic+mice+involves+deletion+of+nonmature+CD4%2B8%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes.</a> Nature. 333, 742-746 (1988).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).</li>
<li>Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+a+diabetogenic+T+cell+from+genesis+through+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis.</a> Cell. 74, 1089-1100 (1993).</li>
<li>Pauza, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+transgenic+response+to+an+endogenous+polymorphic+autoantigen+determines+susceptibility+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes.</a> Diabetes. 53, 978-988 (2004).</li>
<li>Jasinski, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+insulin+%28B%3A9-23%29+T-cell+receptor+mice+develop+autoimmune+diabetes+dependent+upon+RAG+genotype%2C+H-2g7+homozygosity%2C+and+insulin+2+gene+knockout%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout.</a> Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).</li>
<li>Kersh, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+transgenic+mice+in+which+usage+of+transgenic+alpha-+and+beta-chains+is+highly+dependent+on+the+level+of+selecting+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand.</a> Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+retrogenic+mice%3A+A+rapid%2C+flexible+alternative+to+TCR+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).</li>
<li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3, 191-197 (2006).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice%3A+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).</li>
<li>Donnelly, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+aphthovirus+2A%2F2B+polyprotein+%27cleavage%27+mechanism+indicates+not+a+proteolytic+reaction%2C+but+a+novel+translational+effect%3A+a+putative+ribosomal+%27skip%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'.</a> J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).</li>
<li>Atkins, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+for+%22StopGo%22%3A+reprogramming+translation+to+augment+codon+meaning+of+GGN+by+promoting+unconventional+termination+%28Stop%29+after+addition+of+glycine+and+then+allowing+continued+translation+%28Go%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go).</a> RNA. 13, 803-810 (2007).</li>
<li>Doronina, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+release+of+nascent+chains+from+ribosomes+at+a+sense+codon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon.</a> Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).</li>
<li>Bettini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+affinity+and+tolerance+mechanisms+converge+to+shape+T+cell+diabetogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential.</a> Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).</li>
<li>Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+improved+humanized+mouse+models+for+human+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases.</a> J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).</li>
<li>Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mouse+models+to+study+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Endocrinol+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">Humanized mouse models to study human diseases.</a> Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).</li>
<li>Chaplin, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+interleukin-12+as+a+self-processing+2A+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide.</a> J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).</li>
<li>Collison, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73(2011).</li>
<li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In het protocol, we detail een aantal kritische stappen om te zorgen voor een optimale beenmerg gezondheid, transductie efficiëntie en reconstructie. Eerste belangrijke stap is de productie en het juiste onderhoud van de GP + E86 virus producerende cellen. Gebruik vroege passage producerende cellijnen en handhaven op 80% confluentie of lager voor gebruik. Bij het maken van verse GP + E86 virale productiecellen, zorgen voor de 293T cellen zijn vroege passage en groeien in cultuur voor 24 - 48 uur. Plating teveel GP + E86...

T-cel receptor (TCR) repertoire van mensen en muizen wordt geschat op 1 x 10 8 en 2 x 10 6 unieke TCR&#39;s respectievelijk 1,2. Deze veelzijdigheid maakt T-cellen om een ​​breed scala aan antigen epitopen afgeleid van zelf-peptiden alsook van pathogenen door de major histocompatibility complex (MHC) op antigeenpresenterende cellen (APC&#39;s) herkennen. De subtiele verschillen in de interactie van het TCR&#39;s met unieke peptide-MHC complexen bepalen of een T-cel apoptose, anergie, activatie, differentiatie, cytokine productie of cytotoxiciteit zal ondergaan. Vanwege de grote TCR repertoire, analyse hoe een specifieke TCR zal reageren op een bepaald antigeen vereist het gebruik van één TCR systemen. Verschillende TCR transgene muizen werden gegenereerd om de functie van een TCR bestuderen in een in vivo model 3-9. Er zijn echter restricties transgene muizen oa TCRkosten, de tijdsduur om een transgene muis en de zogenaamde stichterseffect willekeurige transgene insertie in kiemlijn DNA 10 genereren. Daarom hebben relatief weinig TCR transgene muizen gegenereerd voor een bepaald antigeen en de functionele implicaties van hoge en lage affiniteit TCR voor dezelfde epitoop zelden aangepakt. De noodzaak van een snelle aanpak scherm pakken en meerdere TCR bestuderen of een mengsel daarvan, hebben retrogenic ( &quot;retro&quot; uit retrovirus en &quot;gene&quot; uit transgene) muizen werden gebruikt als alternatief voor TcR transgene muizen 11-13. 2A peptide consensus motief binnen enkele virussen bestaan ​​uit een 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, waarbij klieving optreedt tussen de glycine van de 2A en de proline van de 2B van cis-werkende hydrolase activiteit, wat resulteert in ribosomaal overslaan tijdens de vertaling 10,14-16. Voor een gedetailleerd diagram dat de cleavage van de verschillende peptiden 2A (F2A, E2A, T2A en P2A) zie referenties 10 - 12. Op deze wijze 2 cistrons (TCR TCR alfa en bèta) kunnen worden gekoppeld waardoor stoichiometrische kopie in een enkele vector. Met behulp van deze aanpak zijn we in staat om uit te drukken en meerdere antigeenspecifieke TCRs direct vergelijken in vivo.

```html
<table><tbody><tr><td>DMEM, hoge glucose + glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Dulbecco's Modificatie van Eagle's Medium met 4,5 g/L glucose, L-glutamine &amp; natriumpyruvaat</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene</td><td>Lonza</td><td>17-161F</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &#181;m spuitfilter</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268-10G</td><td>Steriele Gefilterd in dH2O</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAJ61970-06</td><td></td></tr><tr><td>5-fluorouracil (5-FU)</td><td>VWR</td><td>AAA13456-06</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM niet-essentiële aminozuren</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M oplossing</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>150 mm weefselkweekschalen</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweek-behandelde 6-welplateau</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>70 &#181;m nylon celstrainers</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-3</td><td>Invitrogen</td><td>PMC0033</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-6</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;PHC0063</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Stamcel Factor</td><td>Invitrogen</td><td>PMC2113L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-D13-CM</td><td></td></tr><tr><td>HANKS Buffer</td><td>Corning Cellgro</td><td>21020147</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml spuit</td><td>BD</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 BD Precision Glide naald</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1/2 BD Precision Glide naald</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>
```

retrovirale transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van t-cel receptor retrogenic muizen

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T-celreceptor (TCR) signalering is essentieel in de ontwikkeling en differentiatie van T-cellen in respectievelijk de thymus en het perifeer systeem. Het enorme scala aan TCR's maakt het bestuderen van een specifiek antigene respons moeilijk. Daarom werden TCR-transgene muizen gemaakt om positieve en negatieve selectie in de thymus te bestuderen, evenals perifere T-celactivatie, proliferatie en tolerantie. Er zijn echter relatief weinig TCR-transgene muizen gegenereerd die specifiek zijn voor een bepaald antigeen. Daarom ontbreken studies die TCR's met verschillende affiniteiten voor hetzelfde antigene peptide omvatten. De generatie van een nieuwe TCR-transgene lijn kan zes of meer maanden duren. Bovendien kunnen specifieke backcrosses nog eens zes maanden duren. Om een snellere generatie en screening van meerdere TCR's mogelijk te maken, werd een protocol voor retrovirale transductie van beenmerg vastgesteld met stoichiometrische expressie van de TCRα en TCRβ ketens en de generatie van retrogene muizen. Elke retrogene muis is in wezen een grondlegger, wat praktisch een grondleggereffect tenietdoet, terwijl de tijd om een TCR retrogene te genereren wordt verkort van zes maanden tot ongeveer zes weken. Hier presenteren we een snelle en flexibele alternatief voor TCR-transgene muizen dat op elke gekozen achtergrond kan worden uitgedrukt met elke specifieke TCR.

Beenmerg transductie efficiëntie wordt gecontroleerd bij stap 13.3 van het protocol voor het beenmerg in staartader iv wordt geïnjecteerd In de vertegenwoordiger beenmerg transductie figuur (Figuur 1A), ongeveer 10-ul van het geoogste beenmerg werd toegevoegd aan 100-ul PBS en geanalyseerd op expressie ametrine. Algemeen het percentage fluorescentie positieve cellen tussen 25% en 70%, afhankelijk van het construct en retrovirale titer. Na 6 weken beenmerg injectie worden...

We presenteren een snel en flexibel protocol voor een enkelvoudig T-celreceptor (TCR) retroviraal-gebaseerd in vivo expressiesysteem. Retrovirale vectoren worden gebruikt om beenmerg-progenitorchellen te transduceren om T-celontwikkeling en functie van een enkele TCR in vivo te bestuderen als een alternatief voor TCR-transgene muizen.

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Het doel van deze procedure is het genereren van retrogene muizen om de in vivo functie van meerdere t-celreceptoren te bepalen. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een retroviraal construct dat de alfa- en bètaketens van de t-celreceptor codeert, gekoppeld door een 2A-peptideconsensusmotief. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie; door meerdere TCR's te screenen die specifiek zijn voor diverse antigenen, kan hun in vivo functie worden vastgesteld.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zodra het retrovirale construct is voltooid, het T-celcompartiment van de retrogene muizen na ongeveer zeven weken zal zijn gereconstitueerd. Bovendien is elke retrogene muis in essentie een founder, waardoor het founder-effect wordt geëlimineerd door meerdere muizen te analyseren. Dr. Maria Bettini zal dit deel van de procedure demonstreren.Bereid de extractie van het beenmerg voor door steriele dissectieschaar en pincetten in het operatieve gebied te plaatsen en dissectiemedium in een conische buis van 50 milliliter op ijs te koelen. Na het euthanaseren van de muis en het bevestigen van de dood door cervicale dislocat

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze techniek laat een efficiënte manier om replicatie-defecte retrovirale aandelen dat codeert voor een menselijk oncogen voor te bereiden, en vervolgens gebruikt voor de inductie van myeloproliferatieve ziekte in de muis model.

De productie van replicatie-defecte Retrovirus door transiënte transfectie van 293T-cellen

We zien hier dat epigenetische herprogrammering via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) kan worden gebruikt als een instrument om muismodellen te genereren met een vooraf bepaalde T-cel receptor (TCR) specifieke kenmerken. Deze transnuclear muizen drukken de overeenkomstige TCR uit hun endogene locus onder de controle van de endogene promotor.

Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

Een efficiënt systeem van de structuur en functie analyse van een gen in...

Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen

Het genereren en karakteriseren van tumorspecifieke T-cellen met gehumaniseerde muizen wordt hier beschreven. Human thymusweefsel en genetisch gemodificeerde humane hematopoietische stamcellen worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen. Dit resulteert in de bereiding van een op menselijke immuunsysteem waardoor in vivo onderzoek van anti-tumor immuunrespons.

Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

Het manipuleren van temporele genexpressie in differentiërende embryonale stamcellen (ESCs) kan worden bereikt met behulp van induceerbare gensystemen. De generatie van deze cellijnen is echter kostbaar en tijdrovend. Dit protocol bereikt snelle expressie van een transgen in differentiërende ES-afgeleide cellen en daaropvolgende analyse van downstream hematopoëtische differentiatie.

Retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellijnen Afgeleid embryoiden lichaamscellen voor Analyse van hematopoietische differentiatie

Dit manuscript geeft een beschrijving van de methodologie die wordt gebruikt om muizenmodellen voor transductie-transplantatie te vestigen. Er wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van technische fouten die moeten worden vermeden bij het uitvoeren van beenmergtransplantaties. Er moet een duidelijk begrip worden verkregen van het belang van hoog viraal titer, transfectie/transductie en bestraling.

Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve aandoening

De huidige protocol combineert eencellige gekoppeld menselijke TCR alpha en beta keten sequencing met gestroomlijnd generatie van retrovirale vectoren compatibel met in vitro en in vivo TCR expressie.

Gestroomlijnd eencellige TCR isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor In Vitro en In Vivo expressie van menselijke TCRs

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Hier beschrijven we een methode voor retrovirale overexpressie en adoptieoverdracht van murine B-1a cellen om in vivo B-1a celmigratie en lokalisatie te onderzoeken. Dit protocol kan worden uitgebreid voor diverse downstream functionele tests, waaronder kwantificering van donor B-1a cellokalisatie of analyse van donorcel-afgeleide gedesinteveneerde factoren na adoptieve overdracht.

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

We presenteren een protocol voor retrovirale transductie van gids-RNA in primaire T-cellen van Cas9 transgene muizen, en bieden een efficiënt alternatief voor genbewerking bij het bestuderen van Th17-differentiatie.

Retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in vitro

Leer hoe u retrogene muizen genereert via retrovirale transductie van beenmerg stamcellen om T-cel receptor functie in vivo te bestuderen. Deze methode elimineert founder effecten en reconstitueert het T-cel compartiment in ongeveer zeven weken.

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

Meer video's verkennen