Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery

Het algemene doel van deze procedure is om een polyelektrolytcomplexatieschaal te fabriceren. Een drager die een breed scala aan groeifactoren met een heparinebindingsdomein kan vasthouden en de afgifte ervan reguleren. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden in het gebied van orthopedische weefselengineering voor efficiënte vasthouding en afgifte van specifieke groeifactoren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er geen gebruik hoeft te worden gemaakt van organisch materiaal. Dat is bekend om de bio acties van groeifactoren te beïnvloeden. Los 200 milligram niet-geirradieerd natriumalginaat of 400 milligram acht megarad geirradieerd natriumalginaat op in 10 milliliter dubbel gedestilleerd water.

En schud gedurende een uur. Bewaar de alginaatoplossing een nacht op vier graden Celsius. Filter de alginaatoplossing met een steriele 0,2 micron spuitfilter voordat de alginate microbead wordt gemaakt.

Desinfecteer de elektrostatische BE generator en spuitpomp met 70% ethanol en plaats ze in een klasse twee biologische veiligheidskast. Plaats vervolgens een glazen bak met een magnetische roerbaar in de BE generator. Stel de armelektrode van de BE generator negen centimeter boven de bak.

Verbind de elektrodekabel van de BE generator met de neuroschroef twee van de armelektrode. En giet 80 milliliter strontiumchlorideoplossing in de bak. Laad vervolgens vijf milliliter 0,2 micron gefilterde alginaatoplossing in de spuit in rubberen buis.

Na het aansluiten van de rubberen buis op de armelektrode, zet de spuitpomp aan op vijf milliliter per uur. Gedurende twee minuten. Om de lucht in de buis te verdrijven en de alginaatoplossing naar de punt van de spuit te brengen.

Zet vervolgens de spuitpomp uit. Om de microbeadgeneratie te beginnen, stel de encapsulator in op 5,8 kilovolt. Gevolgd door de spuitpomp op een alginaatstroom van vijf milliliter per uur.

Gooi de microbeads weg die tijdens de eerste twee minuten zijn gegenereerd, omdat deze microbeads vaak onregelmatig van grootte en vorm zijn. Verzamel daaropvolgende microbeads in de 0,2 molar strontiumchlorideoplossing. Zet de spuitpomp uit gevolgd door de encapsulator.

Na het pompen van het vooraf geplande volume alginaatoplossing. Herhaal dit voor volgende batch microbead fabricage. Bewaar de microbeads in 20 milliliter 0,2 molar strontiumchlorideoplossing bij vier graden Celsius overnacht om de crosslinking te voltooien en de gel te stabiliseren.

Verzamel 0,5 milliliter alginate microbeads met een plastic pipet. En plaats het op een glazen plaat. Bekijk de microbeads onder een optisch microscoop met 10x vergroting.

Maak tien foto's van de microbeads met een microscoop CCD camera. Sla de afbeeldingen op met een 500 micron schaalbalk in TIFF formaat met een resolutie van 2048 bij 1536. Gebruik de lengtetools in Image J om de grootte van de microbeads te meten.

En de schaalbalk. Converteer vervolgens de lengte van de microbead van pixels naar micrometer. Klik op de lijntools en teken een lijn over het midden van de alginatebead.

Klik op analyse in de menubalk en selecteer meten. Er verschijnt een pop-upvenster. Herhaal deze stappen om alle alginaatbeads in de afbeelding te meten.

Meet de schaalbalk op de afbeelding. Verzamel de microbeads met de 100 micron nylon zeef. En was de beadjes met dubbel gedestilleerd water.

Gebruik een spatel om alle microbeads gemaakt van 0,1 milliliter van de alginaatoplossing over te brengen in een twee milliliter microcentrifugebuis en bedek ze met gaas om uitdroging te voorkomen. Steriliseer tenslotte de microbeads door autocleaving te gebruiken in de vloeibare modus of in overeenstemming met de specificaties van de fabrikant. Voeg 1,5 liter gedestilleerd water toe aan de kamer om uitdroging van de beadjes te voorkomen.

Binnen de BSL2 kap, incubeer de steriele microbeads met één milliliter gesteriliseerde twee milligram per milliliter protamine-oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de met protamine gecoate microbeads twee keer met dubbel gedestilleerd water. Draai vervolgens neer, met behulp van een tafelcentrifuge bij 200 keer G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.

Na centrifugatie, zuig het water af met behulp van een spuit. Incubeer de met protamine gecoate microbeads met één milliliter gesteriliseerde 0,5 milligram per milliliter heparine-oplossing gedurende 30 minuten. Dit creëert een polyelektrolytcomplexatieschaal met een grote affiniteit voor heparinebindingsgroeifactoren.

Na incubatie, zuig het heparine weg met behulp van een spuit. En was het niet-gebonden heparine van de polyelektrolytcomplexen door twee keer met dubbel gedestilleerd water te wassen. Laad 13,3 microliters van 1,5 milligram per milliliter botmorfogenetisch eiwit 2 of NELL-achtig molecuul 1 oplossing op 100 microgram van het polyelektrolytcomplex.

Incubeer het polyelektrolytcomplex bij vier graden Celsius onder 30 RPM, schudden gedurende 10 uur. Dompel vervolgens de microbeads onder in één milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing, of PBS, bij 37 graden Celsius met constant schudden. Verzamel één milliliter van de supernatant en vervang het met één milliliter PBS na één, drie, zes, 10 en 14 dagen.

Evalueer de opname en afgifte-efficiëntie van NELL-achtig molecuul een met behulp van de CBQCA-eiwitanalysemethode volgens het protocol van de fabrikant. Of voer ELISA uit. De bioactiviteit van NELL-achtig molecuul een vrijgegeven uit het polyelektrolytcomplex wordt beoordeeld door zijn vermogen te meten om de expressie van alkalische fosfatase in konijnenbeenmergstamcellen te verhogen.

Zaai 20.000 konijnenbeenmergstamcellen per putje in een 24-putjesplaat. En laat ze een dag groeien met één milliliter dulbecco's gemodificeerd arendsmedium plus 10% foetaal runderserum bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Na 24 uur, vervang het medium met één milliliter van een osteogeen medium gedurende zeven dagen bij 37 graden Celsius.

En 5% CO2. Plaats 300