Name: Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Leer hoe je polyelectrolyte complexen fabriceert met heparine en protamine voor gecontroleerde afgifte van osteogene groeifactoren. Deze methode vermindert de BMP-2-dosis twintigvoudig voor spinale fusietoepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studies werden gefinancierd door National Medical Research Council Clinician Scientist - Individuele Onderzoekssubsidie (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 en NMRC EDG/0022/2008.

1. Bereiding alginaatoplossing <ol><li> Oplossen 200 mg natriumalginaat (onbestraalde) of 400 mg van 8 MRad bestraald natriumalginaat in 10 ml dubbel gedestilleerd water en schud gedurende 1 uur voor niet-uitgestraald alginaat en 15 min voor bestraalde alginaat. Bewaar de alginaatoplossing bij 4 ° C overnacht. Filter de alginaat-oplossing met een steriele 0,2 um spuitfilter voordat alginaat microbead fabricage. </li></ol> 2. Alginaat Microbead Fabrication <ol><li> Ontsmet de elektrostatische kraal generator en spuit pomp met 70% ethanol en leg ze in een klasse II bioveiligheidskast (figuur 1). </li><li> Plaats een glazen bak met een magnetische roerstaaf in de kraal generator. </li><li> Stel de arm elektrode van de kraal generator 9 cm boven de wastafel. </li><li> Sluit de elektrodekabel van de kraal generator om de kartelschroef 2 van de arm elektrode, en giet 80 ml ​​srcl 2 oplossing in debekken. </li><li> Laad 5 ml van 0,2 urn gefiltreerde alginaatoplossing in de injectiespuit en rubber buis. Nadat de rubberen buis de arm elektrode, zet de inspuitpomp 5 ml / uur gedurende 2 min aan de lucht te verdrijven De slang en leveren de alginaatoplossing tot aan de punt van de spuitmond. Schakel de injectiepomp. </li><li> Vervolgens schakelt de encapsulator en vervolgens de spuit pomp microbead generatie beginnen. Stel het alginaat debiet 5 ml / uur en de spanning op 5,8 kV op de encapsulator. Gooi de microkralen die tijdens de eerste twee minuten (of de eerste 0,5 ml alginaatoplossing uit de spuit gepompt), omdat deze de neiging microkralen onregelmatige grootte en vorm te zijn. </li><li> Verzamel latere microkralen in 0,2 M strontiumchlorideoplossing. Schakel zowel de spuitpomp en encapsulator (in die volgorde) na het pompen van de vooraf geplande hoeveelheid alginaatoplossing. Herhaal dit voor de volgende partijen microbead fabricage. Na voltooiing, draai vanf de spuitpomp, gevolgd door de encapsulator. </li><li> Bewaar de microkralen in 20 ml 0,2 M strontiumchlorideoplossing bij 4 ° C gedurende de nacht verknoping voltooien en stabilisering van de gel. </li></ol> 3. Grootte Meting van Alginate Microkralen <ol><li> Verzamel 0,5 ml alginaat microbolletjes met een plastic pipet en plaats het op een glasplaatje. Bekijk de microkralen onder een optische microscoop bij 10x vergroting. Neem tien beelden van de microbolletjes met een microscoop CCD camera. Sla de beelden met schaal bar (500 pm) in TIFF-formaat met een resolutie van 2.048 x 1.536. </li><li> Met de lengte gereedschappen ImageJ, meten van de grootte van de microbolletjes en schaalbalk (figuur 2). Reken de microkralen lengte van pixel naar micrometer. <ol><li> Klik op de line tools en trek een lijn over het midden van het alginaat kraal. </li><li> Klik op &quot;Analyseren&quot; op de menubalk en kies &quot;Measure&quot;. Een pop-up venster zal verschijnen. </li><li&gt; Herhaal de stappen 3.2.1-3.2.2 alle alginaat kralen binnen het beeld te meten. Meet de schaal bar op de afbeelding. </li><li> Zetten de diameter van de alginaat kraag naar de werkelijke lengte met de formule: lengte van alginaat kraal / lengte van schaalbalk x 500 urn. Bijvoorbeeld, 1.420 (diameter gemeten met behulp van ImageJ) / 2.657 (schaal bar lengte gemeten door ImageJ) * 500 micrometer = 267 micrometer. </li></ol></li><li> Beschouw de gemiddelde grootte van 100 microparels (gemiddelde ± standaarddeviatie) als vertegenwoordiger omvang van elke partij microkralen. </li></ol> 4. Sterilisatie <ol><li> Verzamel de microbolletjes met behulp van een 100 um nylon zeef en spoel de kralen met dubbel gedestilleerd water. </li><li> Met behulp van een spatel, dragen alle microkralen gemaakt van 0,1 ml alginaatoplossing in een 2 ml microcentrifugebuis en dek af met gaas uitdroogt. </li><li> Tenslotte Steriliseer de microkralen autoclaaf behulp vloeistofmodus (115 ° C, 15 min) of overeenkomstig mproducent behoudt de specificaties. Voeg 1,5 liter gedestilleerd water naar de kamer om kralen uit uitdroging te voorkomen. </li></ol> 5. Protamine en Heparine Coating <ol><li> Binnen de BSL-2 kap Incubeer de steriele microkralen met 1 ml 2 mg / ml protamine oplossing (gesteriliseerd onder toepassing van een 0,2 urn spuitfilter) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Na incubatie van de microbolletjes gedurende 1 uur (Stap 5.1), het verzamelen van 150 ul van de protamine oplossing voor de micro bicinchoninezuur (microBCA) (deel 6). </li><li> Was de protamine beklede microkralen tweemaal met dubbel gedestilleerd water. Spin down met een tafelmodel centrifuge bij 200 xg gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, zuig het water met een injectiespuit. </li><li> Incubeer protamine gecoate microkorrels met 1 ml 0,5 mg / ml heparine-oplossing (gesteriliseerd onder toepassing van een 0,2 urn spuitfilter) gedurende 30 min tot polyelektrolytcomplex maken (PEC). </li><li> Na incuberen van de beklede microkralen protamine fof 30 min (stap 5.4), het verzamelen van 400 ul van de heparine-oplossing voor heparine inhoud (deel 7) te bepalen. </li><li> Na incubatie, wassen de ongebonden heparine uit de PEC door tweemaal wassen met dubbel gedestilleerd water. </li></ol> 6. Protamine Content <ol><li> Voer de microBCA-test volgens de instructies van de fabrikant. Kort samengevat, voeg 150 ul oplossing protamine (verzameld voor en na incubatie met microkorrels) in een plaat met 96 putjes. Voeg 150 ul microBCA werkende oplossing. </li><li> Gebruik albumine-oplossing (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 en 200 ug / ml) als ijkstandaarden. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 60 minuten bij 60 ° C. Meet de absorptie met een spectrofotometer bij 562 nm. </li><li> Gebruik de standaardcurve protamine de concentratie van elk onbekend monster volgens instructies van de fabrikant bepaald. </li><li> Bepaal het protamine inhoud van de microbolletjes door de totale hoeveelheid in het protaminebekledingsoplossing (vóór incubatie met microkorrels) vanaf de hoeveelheid protamine achterblijft in de bekledingsoplossing (na incubatie met microkorrels). </li></ol> 7. Heparine Content <ol><li> Bereid de 10 ml werkoplossing door het oplossen van 4 mg toluidine blauw en 20 mg natriumchloride in 0,01 N zoutzuur. </li><li> Voeg 400 gl monster (uit stap 5.5) aan de werkoplossing in een verhouding van 2: 3 en vortex gedurende 30 seconden. </li><li> Voeg 600 ul van n-hexaan (equivalent volume aan de werkzame reactie- oplossing) en vortex het mengsel om de toluidineblauw heparine complex te extraheren. </li><li> Verzamelbak 200 pl van de waterige fase met een injectiespuit na fasescheiding. </li><li> Meet de hoeveelheid un-geëxtraheerde toluidineblauw in de waterige fase met behulp van een spectrofotometer bij 631 nm. </li><li> Bereid heparine standaardoplossingen van 0-20 ug / ml. </li><li> Plot van de 631 nm lezing van elke heparine standaard versus heparine-concentratie in ug / ml. Gebruik de standaardcurve heparine concentratie van elk monster te bepalen. </li></ol> 8. Confocale Afbeelding van laag-voor-laag structuur <ol><li> Fabriceren protamine, heparine en NELL-1 / BMP-2 fluorescerende analoog CF-405 protamine (blauw), CF 594 heparine (rood) en FITC gelabeld NELL-1 / FITC gelabeld (groen) BMP-2 + héparine + protamine volgens de fabrikant technische fiche. </li><li> Coat 100 g microkralen met 300 gl fluorescerende analoog (bekledingswerkwijze zoals beschreven in 5,3-5,6) CF-405 protamine (blauw) (2 mg / ml, 1 uur incubatie), CF 594 heparine (rood) (0,5 mg / ml, 30 min) en FITC gelabeld NELL-1 / FITC gelabeld (groen) BMP-2 (1,5 mg / ml, gedurende de nacht). Was de microkralen tweemaal met gedestilleerd water om het ongebonden fluorescerende protamine, heparine en NELL-1 / BMP-2 te elimineren. </li><li> Observeer de laag-voor-laag structuur (figuur 3) met behulp van een confocale microscoop bij 10X vergroting. 7 </li></ol> 9. BMP-2en NELL-1 Opname and Release <ol><li> Belasting 13,3 pl 1,5 mg / ml BMP-2 of NELL-1 oplossing 100 ug PEC. Incubeer PEC bij 4 ° C onder 30 rpm schudden gedurende 10 uur. </li><li> Dompel de microkralen in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C onder constant schudden (30 rpm). </li><li> Verzamel 1 ml van de supernatant en vervangen door 1 ml PBS na 1, 3, 6, 10 en 14 dagen. </li><li> Evalueer de opname en laat efficiëntie van BMP-2 met de ELISA werkwijze volgens protocol van de fabrikant. Evalueer de opname en laat efficiëntie Nell-1 met de carboxybenzoyl- chinoline-2-carboxaldehyde (CBQCA) proteïne assay werkwijze volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Bepaal cumulatieve afgifte op tijdstip (t): Cumulatieve afgifte op tijdstip (t) = Laat op tijdstip (t) + Vorige afgifte op tijdstip (t-1). </li><li> Plot cumulatieve afgifte van BMP-2 en NELL-1 tegen de tijd. </li></ol> 10. In vitro bioactiviteitvan NELL-1 Opmerking: De bioactiviteit Nell-1 afgegeven uit PEC werd beoordeeld door het meten van het vermogen om de expressie van alkalische fosfatase (ALP) bij konijnen beenmergstamcellen (rBMSC) verhogen. <ol><li> Zaad 20.000 rBMSCs per putje in een 24-wells plaat en laat ze groeien één dag met 1 ml Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na 24 uur werd het medium vervangen door 1 ml van een osteogeen medium (DMEM aangevuld met 10% FBS, 2% penicilline streptomycine, 50 ug / ml ascorbinezuur, 10 mmol / l beta-glycerofosfaat en 10 -8 mol / L dexamethason ) gedurende 7 dagen bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Plaats 300 ug PEC-NELL-1 (uit stap 8.2) en PEC binnen celkweek inserts (TC insert) om het PEC gescheiden van de cellen (dit vermijdt de uitspoeling van PEC microbolletjes tijdens de osteogene medium verandering) te houden. Plaats TC te voegen in de 24 goed platen 14 dagen. </li><li> Eens in de drie dagen, zuig 1 ml van het osteogene medium door het plaatsen van een naald buiten de TC insert, en te vervangen door 1 ml vers osteogene medium. </li><li> Na 7 en 14 dagen incubatie bepaald ALP activiteit met een ALP assay kit volgens het protocol van de kit fabrikant. <ol><li> Lyseren cellen met assay buffer die 0,1% Triton X-100 bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Schraap gehandeld cellen met behulp van een cel schraper. Incubeer celsuspensie bij 4 ° C onder roeren gedurende ten minste 60 min. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 2500 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Verzamel de bovenstaande vloeistof voor de bepaling ALP. </li><li> Voeg 50 ul van serieel verdunde alkalische fosfatase standaardoplossing 200-0 ng / ml aan de putjes van een plaat met 96. De uiteindelijke hoeveelheid alkaline fosfatase norm 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 en 0 ng / putje. </li><li> Voeg de supernatant van stap 10.5.2 (50 pl / putje) en verdun met verdunning bUffer. </li><li> Voeg 50 ul van p-nitrofenylfosfaat (pNPP) substraatoplossing in elk putje. Meng de reagentia door voorzichtig schudden van de plaat gedurende 30 sec. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten in het donker. Meet de absorptie bij 405 nm door plaatlezer. </li><li> Bereken ALP-activiteit met behulp van de ijklijn. </li></ol></li><li> Bepaal eiwitgehalte met de microBCA eiwit assay kit volgens de instructies van de fabrikant. Normaliseren van de ALP-activiteit door te delen ALP activiteit door het eiwitgehalte. </li></ol> 11. levensvatbaarheid van de cellen <ol><li> Incubeer 200 mg PEC-NELL-1 met 1 ml DMEM + 10% FBS bij 37 ° C gedurende 24 uur door 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay. </li><li> Zaad 2000 rBMSCs per putje (in 100 ui DMEM met 10% FBS) in een plaat met 96 putjes en incubeer gedurende 1 dag bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Vervang DMEM + 10% FBS met 100 pl PEC-NELL-1 / PEC extract en incubeerbij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Na 1 dag en 3 dagen incubatie, voeg 10 ul van 5 mg / ml MTT-oplossing en na incuberen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 4 uur in het donker. </li><li> Voeg 100 ul DMSO oplossing in elk putje om formazan kristallen op te lossen. </li><li> Bepaal de absorptie bij 570 nm met een microplaat reader. </li><li> Bereken het relatieve groeipercentage: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54202/54202eq1.jpg" /></li></ol> 12. Verpakking in Steiger en BMP-2 &amp; NELL-1 Loading <ol><li> Verpak de PEC in de poriën van een bioresorbeerbare medische kwaliteit polycaprolacton - tri-calciumfosfaat (MPCL-TCP) steiger met behulp van een gesteriliseerde spatel in een BSL-2 kamer. </li><li> Voeg 1,5 mg / ml oplossing van BMP-2 of NELL-1 op de MPCL-TCP scaffold vol PEC en incubeer overnacht bij 4 ° C. </li></ol>

<ol><li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NELL-1+based+demineralized+bone+graft+promotes+rat+spine+fusion+as+compared+to+commercially+available+BMP-2+product%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Sci%22%5BJournal%5D)">NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product.</a> Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).</li>
<li>Anderson, C. L., Whitaker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification+associated+with+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+%28infuse%29+in+posterolateral+lumbar+spine+fusion%3A+a+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report.</a> Spine. 37, 502-506 (2012).</li>
<li>Glassman, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhBMP-2+versus+iliac+crest+bone+graft+for+lumbar+spine+fusion%3A+a+randomized%2C+controlled+trial+in+patients+over+sixty+years+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age.</a> Spine. 33, 2843-2849 (2008).</li>
<li>Tannoury, C. A., An, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+with+the+use+of+bone+morphogenetic+protein+2+%28BMP-2%29+in+spine+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery.</a> Spine J. 14, 552-559 (2014).</li>
<li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery%3A+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li>
<li>Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+performance+of+a+polycaprolactone-based+scaffold+used+as+fusion+cage+device+in+a+large+animal+model+of+spinal+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery.</a> Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).</li>
<li>Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioactivity+of+rhBMP-2+delivered+with+novel+polyelectrolyte+complexation+shells+assembled+on+an+alginate+microbead+core+template%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template.</a> J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+Complex+Carrier+Enhances+Therapeutic+Efficiency+and+Safety+Profile+of+Bone+Morphogenetic+Protein-2+in+Porcine+Lumbar+Interbody+Fusion+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model.</a> Spine. 40, 964-973 (2015).</li>
<li>Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+rhBMP-2+into+self-assembled+polyelectrolyte+complexes+promotes+anatomic+localization+of+new+bone+in+a+porcine+model+of+spinal+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery.</a> Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).</li>
<li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Protamine-Based+Polyelectrolyte+Carrier+Enhances+Low-Dose+rhBMP-2+in+Posterolateral+Spinal+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion.</a> Spine. 40, 613-621 (2015).</li>
<li>Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-tricalcium+phosphate+particles+as+a+controlled+release+carrier+of+osteogenic+proteins+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).</li>
<li>Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Poly-L-Ornithine-coated+alginate+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules.</a> Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).</li>
<li>Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+entrapping+conditions+to+improve+the+release+of+BMP-2+from+PELA+carriers+by+response+surface+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology.</a> Biomed Mater. 10, 015002(2015).</li>
</ol>

We hebben geen belangenconflict.

Dit protocol geeft een werkwijze voor de bereiding van PEC door laag voor laag zelfassemblage. De laag-voor-laag structuur gevisualiseerd met behulp van fluorescente analogen van protamine, heparine, BMP-2 en NELL-1 en confocale microscopie. Opname en release tests tonen aan dat heparine op PEC medieert osteogene groeifactor opname en afgifte. De opname efficiëntie van de PEC methode is: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. De PEC drager een betere modulatie Nell-1 (20%) afgifte met een zuiver oppervlakteadsorptie d...

De incidentie van pseudoartrose gerapporteerd wel 10 tot 45% degeneratieve spinale fusie en herziening spinale chirurgie 1 te zijn. De snelheid van pseudarthrose tijdens wervelkolomfusie en andere reconstructieve operaties bot, osteogene groeifactoren zoals BMP-2, Nell-1 1 en bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) zijn ingevoerd om de novo osteogenese goede kan komen. Hiervan BMP-2 is een populaire keuze voor spinale fusie-2. Hoewel de potentie van BMP-2 bij het ​​induceren en nieuwe botvorming vergemakkelijken is goed ingeburgerd 3; klinisch significante complicaties zoals heterotope botvorming, seroom en hematoomvorming, ontstekingsreactie, radiculitis, wervellichaam osteolyse en retrograde ejaculatie blijven punten van zorg vanwege de suprafysiologische gebruikshoeveelheid 4,5. Daarom verlagen van de dosis van BMP-2 blijft een relevante strategie in tenverleidt om bijwerkingen te minimaliseren. Daarnaast worden efficiënte carrier-systemen die nodig is om de eerste burst release van BMP-2 waargenomen in de hedendaagse collageenspons draagsystemen te onderdrukken en de verdere langdurige en gelokaliseerde aflevering van deze potente cytokine verbeteren. De laag voor laag zelfassemblage van afwisselend kationische en anionische polyelektrolyten kunnen worden gebruikt als een afstembare methode opbouwen polyelektrolyt complexen op het oppervlak van scaffold matrices of implanteerbare materialen 6. In dit verband heeft heparine (bekend om de hoogste negatieve ladingsdichtheid van biologische agentia) zijn erkend gretig binden met verschillende groeifactoren via elektrostatische en heparine bindende domeinen. Inderdaad, heparine aangetoond dat de halfwaardetijd te verlengen en aldus potentiëren de bioactiviteit van verschillende groeifactoren. Op basis hiervan onze groep aangepast een laag voor laag zelfassemblage protocol bij een heparine gebaseerde polyelektrolytcomplex (PEC) die fabriceren<html> ladingen en behoudt de biologische activiteiten van osteogene groeifactoren tijdens immobilisatie 7,8. Het alginaat microbead kern werd vervaardigd door het verknopen α-L-guluronate (G) residuen van alginaat met tweewaardig kation calcium of strontium ionen. Het alginaat kern is een biologisch afbreekbare matrix scaffold; die na de implantatie, is het geresorbeerd in de fusie bed ruimte bieden voor bony ingroei. Poly-L-lysine (PLL) of protamine wordt gebruikt als de kationische laag naar interlace met zowel de steiger matrix (in dit geval het alginaat microkorrel dragerdeeljes) en de negatief geladen heparine; terwijl de anionische heparine laagfuncties te stabiliseren en te lokaliseren geladen groeifactoren. De drielaags PEC is aangetoond groeifactor laadvermogen in een varkensmodel 9 verhogen. Recent zijn PEC dragers is aangetoond dat de effectieve dosis van BMP-2 succesvol met tenminste 20-voudig 10 ratten, varkens modellen van spinale fusie-8. ntent &quot;&gt; Hier melden wij de methoden voor het vervaardigen van PEC voor een betere groeifactor levering in spinale fusie en de andere reconstructieve chirurgie bot met behulp van BMP-2 als een model osteogene groeifactor.

<table><tbody><tr><td>Life Science Acrodisc 25&nbsp;mm Syring Filter with 0.2&nbsp;&micro;m Supor Membrane</td><td>PALL&nbsp;</td><td>PN4612</td><td>Steriele protamine, heparine oplossing door ultrafiltratie</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Cell Star&nbsp;</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate Nuclon Delta Surface</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td>Meet de cytotoxiciteit van PEC-NELL-1</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0600/17</td><td>Precipiteert CF-405 Gelabelde protamine</td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>DAL 1025</td><td>Meet de cytotoxiciteit van PEC-BMP-2</td></tr><tr><td>Alkaline Fosfatase Assay (ALP) assay kit</td><td>Anaspec</td><td>AS-72146</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride</td><td>Merck</td><td>Art 1145</td><td>Stop reagens in FITC-labeling</td></tr><tr><td>Watervrij Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Oplosmiddel voor fluorescerende isothiocyanate I</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Los formazan op&nbsp;</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Hirayama</td><td>HU-110</td><td>Steriliseer alginaatkralen door stoom</td></tr><tr><td>Beta-glycerofosfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit)&nbsp;</td><td>Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA</td><td>7510800</td><td>Osteogene Groeifactor, dialyse is nodig om het stabilisator component dat interfereert met FITC koppeling te verwijderen</td></tr><tr><td>Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-6222</td><td>Om NELL-1 proteïne te kwantificeren</td></tr><tr><td>Cell Strainer (100&nbsp;&micro;m)</td><td>BD Science</td><td>352360</td><td>PEC houden voor ALP assay</td></tr><tr><td>Cell Scraper 290&nbsp;mm Breedte van blad 20&nbsp;mm</td><td>SPL Life Science</td><td>90030</td><td>De cel loskoppelen van 24 well plate</td></tr><tr><td>CF 405S, Succinimidyl Ester</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600013</td><td>Blauwe fluorescerende kleurstof voor protamine labelen</td></tr><tr><td>CF 594, Hydrazide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600031</td><td>Diep rood fluorescerende kleurstof voor heparine labelen</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td>Confocale Microscoop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Onderdeel van osteogene groeimedium</td></tr><tr><td>Dextran Desalting Columns</td><td>Pierce (Thermo Scientific)&nbsp;</td><td>43230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12320</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 Quantikine ELISA Kit</td><td>R&amp;D System</td><td>DBP200</td><td>Bepaal BMP-2 release</td></tr><tr><td>Fetaal Rund Serum FBS</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceïne Isothiocyanaat, Isomeer I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td>Groene fluorescerende kleurstof voor NELL-1 en BMP-2 labelen</td></tr><tr><td>ThinCert Cell Cultuur Inserts, Voor 24 Well plates, Steriele</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>662630</td><td>Voorkomt PEC was uit wanneer osteogene medium wordt gewijzigd</td></tr><tr><td>Havard Appartus Spuitpomp (11 plus)</td><td>Havard Apparatus</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexaan (>99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Bindt met osteogene groeifactor met heparine binding domein</td></tr><tr><td>Zoutzuur (37%)</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Zeer corrosief</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Binder</td><td>C8150</td><td></td></tr><tr><td>MicroBCA Protein Assay kit</td><td>Thermoscientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>Voor ALP en microBCA assays</td></tr><tr><td>Nisco cell encapsulator</td><td>Nisco Engineering Inc</td><td>Encapsulation unit VAR V1</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente Microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>mPCL-TCP Scaffold (Pore grootte is 1.3&nbsp;mm)</td><td>Osteopore</td><td>PCL-TCP 0/90</td><td>PEC houden voor in vivo studie</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine 10.000 eenheid/ml, 100&nbsp;ml</td><td>Hyclone Cell Cultuur</td><td>SV30010</td><td>Antibioticum</td></tr><tr><td>10x Fosfaat Buffered Saline (PBS)</td><td>Vivantis</td><td>PB0344-1L</td><td>10x Oplossing, Ultra Pure Grade</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine MW 15.000-30.000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2568</td><td>Polykation</td></tr><tr><td>Protamine Sulfaat zout, van Zalm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4020</td><td>Polykation</td></tr><tr><td>Schakelaar</td><td>Labnet</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>Snakeskin Dialyse Buizen 3.500 MWCO 22&nbsp;mm x 35 voet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68035</td><td>Verwijder ongereageerde FITC door dialyse</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Qrec</td><td>S5158</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Bicarbonaat</td><td>US Biological</td><td>S4000</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Natrium Carbonaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Strontium Chloride Hexahydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>255521</td><td>Crosslinker voor alginaat</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>3dia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml spuit</td><td>Terumo</td><td>140425R</td><td>De diameter van de spuit beïnvloed de stroomsnelheid</td></tr><tr><td>75 cm2 Cell Cultuur Flessen Canted Neck</td><td>Corning</td><td>730720</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blauw</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52040</td><td>Heparine assay</td></tr><tr><td>Trypsine 1x</td><td>Hyclone Cell Cultuur</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Natrium alginate</td><td>Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)</td><td>Pronova UPMVG</td><td>Kern materiaal van microbeads</td></tr></tbody></table>

polyelectrolyte complex voor heparine binding domain osteogeen growth factor delivery

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Tijdens reconstructieve bot chirurgie, zijn suprafysiologische hoeveelheden groeifactoren empirisch geladen op steigers voor een succesvolle fusie bot te promoten. Grote doses van zeer krachtige biologische agentia dienen door groeifactor instabiliteit als gevolg van de snelle enzymatische afbraak en carrier inefficiënte lokaliseren voldoende hoeveelheden groeifactor bij implantatie sites. Derhalve strategieën die de stabiliteit van groeifactoren verlengen zoals BMP-2 / NELL-1 en controle het vrijkomen kon eigenlijk hun lagere effectieve dosis en derhalve voor hogere doseringen minder nodig tijdens toekomstige botregeneratie operaties. Dit zal bijwerkingen en groeifactor verlagen. Zelf geassembleerde PEC&#39;s zijn vervaardigd om een betere controle van de BMP-2 / NELL-1 levering bieden via heparine bindend en verdere potentiëren groeifactor bioactiviteit door het versterken van in vivo stabiliteit. Hier illustreren we de eenvoud van PEC fabricage die helpt bij het delivery van diverse groeifactoren in bot reconstructieve chirurgie.

In onze carrier, protamine werd gekozen als vervanger van poly-L-lysine omdat het vergelijkbare chemische eigenschappen en het FDA als tegengif van heparine. Optische microscoop resultaten toonden aan dat de niet-bestraalde microbolletjes waren bolvormig met een diameter van 267 ± 14 urn. (0,35 mm nozzle, stroomsnelheid van 5 ml / uur en 5,8 kV). De meerderheid van de bestraalde microkralen of druppelvorm. De diameter gemeten op de ronde deel van de bestraalde microbolletjes was 212 ± 30...

Zelf-geassembleerde polyelektrolyetcomplexen (PEC) gemaakt van heparine en protamine werden afgezet op alginaatkralen om osteogene groeifactoren vast te houden en de afgifte ervan te reguleren. Deze afgiftestrategie maakt een 20-voudige vermindering van de BMP-2 dosis mogelijk bij toepassingen voor spinale fusie. Dit artikel illustreert de voordelen en fabricage van PEC's.

Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Het algemene doel van deze procedure is het vervaardigen van een polyelektrolyt-complexatieschil. Een drager die in staat is om een breed scala aan groeifactoren met een heparine-bindend domein in te sluiten en de afgifte ervan te reguleren. Deze methode kan cruciale vragen in het veld van orthopedische weefseltechniek beantwoorden met betrekking tot de efficiënte insluiting en afgifte van specifieke groeifactoren.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat er vaak geen organische oplosmiddelen nodig zijn, waarvan bekend is dat ze de biologische activiteiten van groeifactoren beïnvloeden. Los 200 mg niet-bestraald natriumalginaat of 400 mg met acht Mrad bestraald natriumalginaat op in 10 mL dubbel gedestilleerd water.En schud gedurende één uur. Bewaar de alginaatoplossing gedurende de nacht bij vier graden celsius. Filtreer de alginaatoplossing met een steriel 0.2 micron spuitfilter vóór de fabricage van de alginaatmicrobeads.Desinfecteer de elektrostatische BE-generator en de spuitpomp met 70% ethanol en plaats ze in een biologische veiligheidskabinet klasse II. Plaats vervolgens een glazen bekerglas met een magnetische roerkolf in de BE-generator. Stel de armelektrode v

polyelectrolyte-complex-for-heparin-binding-domain-osteogenic-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In de volgende paragrafen beschrijven we procedures voor de bereiding van alginaat die voor toepassing in biomedische toepassingen. We specifiek illustreren een techniek voor het maken van meerdere lagen alginaat microsferen voor het tweeledige doel van de cel en eiwitten inkapseling als een potentiële behandeling voor diabetes type 1.

Genereren van alginaat Microspheres voor biomedische toepassingen

We beschrijven een werkwijze voor het bewerkstelligen van een efficiënte immobilisatie van BMP-2 op oppervlakken. Onze benadering is gebaseerd op de vorming van een zelf samengestelde monolaag op de covalente binding van BMP-2 via zijn vrije amine residuen bereiken. Deze methode is een nuttig hulpmiddel om signalering te studeren aan het celmembraan.

Covalente binding van BMP-2 op oppervlakken met een Zelf-geassembleerde monolaag Aanpak

Dit protocol combineert elektrospinnen en microsferen om weefselgeëngineerde scaffolds te ontwikkelen om neuronen te richten. Het zenuwgroeifactor werd ingekapseld in PLGA-microsferen en elektrogespunnen in hyaluronzuur (HA) vezelige scaffolds. De bioactiviteit van het eiwit werd getest door de scaffolds te zaaien met primaire kippendorsaalwortelganglia en 4-6 dagen te kweken.

Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers

Een stapsgewijs generiek proces voor het creëren van een botachtig sjabloon met geconstrueerde microkanalen wordt gepresenteerd. Hoge absorptie- en retentiecapaciteiten van het sjabloon worden aangetoond door capillaire actie via microkanalen.

Onderscheidend capillaire actie van Micro-kanalen in Bone-achtige sjablonen kunnen verbeteren Aanwerving van Cellen voor Herstel van de Grote Bony Defect

Scaffolds voor weefselengineering moeten het complexe biochemische en biofysische micro-omgeving van de cellulaire niche nabootsen. Hier laten we het gebruik van interfaciale polyelektrolytcomplexatievezels zien als een platform om samengestelde, meercomponenten polymeer scaffolds met aanhoudende biochemische afgifte te creëren.

Composiet Steigers van Interfacial Polyelectrolyte vezels voor stoffelijk Controlled Release van biomoleculen

Deze video toont een protocol voor het verrijken van thymische epitheliale cellen (TEC's) met dichtheidsgradiënt voor FACS-isolatie. Het laat ook het gebruik van EAK16-II/EAKIIH6-peptiden zien om de TEC-aggregatievorming te bevorderen. De micro-omgevingen van EAK16-II/EAKIIH6-hydrogel bieden de 3-D configuratie die nodig is om de overleving en functie van de TEC's te handhaven.

Het bevorderen van 3-D Aggregation van FACS Gezuiverd thymus epitheelcellen met EAK 16-II / EAKIIH6 Self-assembleren Hydrogel

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren bloedvat vorming in vivo en in real-time in 3D steigers door multiphoton microscopie. Angiogenese in genetisch gemodificeerde steigers werd bestudeerd in een lymfkliertest calvarial kritische bot defect model. Meer nieuwe bloedvaten werden ontdekt in de behandelde groep dan in besturingselementen.

Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

Biomaterialen doped met bot morfogenetische eiwit 2 (BMP2) zijn gebruikt als een nieuwe therapeutische strategie om non-adhesie botbreuken genezen. Om te overwinnen bijwerkingen als gevolg van een oncontroleerbare release van de factor, stellen wij voor een nieuwe strategie aan site-direct immobiliseren de factor, waardoor materialen met verbeterde mogelijkheden voor osteogenic.

Plaats-geleide immobilisatie van bot morfogenetische proteïne 2 op vaste oppervlakken door klik chemie

Een in vitro model van de vasculaire niche van het beenmerg wordt vastgesteld door mesenchymale en endotheelcellen te zaaien op pre-cast 3D PEG-hydrogels. De endotheelnetwerken, ECM-componenten en ALP-activiteit van de niches variëren afhankelijk van de gebruikte groeifactor. Het platform kan worden gebruikt voor geavanceerde kankermodellen.

Eenvoudige oprichting van een gevasculariseerde osteogene beenmergniche met behulp van pre-cast poly (ethyleenglycol) (PEG) hydrogels in een beeldvormende microplaat

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

Dit protocol beschrijft de synthese, hemoglobine-inkapseling en oppervlakte-PEGylatie van hiërarchisch poreuze UiO-66-nanodeeltjes die ontworpen zijn voor zuurstofafgifte. De procedure combineert defectengineering met rekbevorderde biorthogonale conjugatie om zeer doorlatende en fysiologisch stabiele dragers te genereren die geschikt zijn voor biomedische toepassingen.

Synthese, hemoglobine-inkapseling en biorthogonale PEGylatie in hiërarchisch poreuze uiO-66-nanodeeltjes voor zuurstofafgiftetoepassingen

Leer hoe je polyelectrolyte complexen fabriceert met heparine en protamine voor gecontroleerde afgifte van osteogene groeifactoren. Deze methode vermindert de BMP-2-dosis twintigvoudig voor spinale fusietoepassingen.

Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery

Meer video's verkennen