Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Het algemene doel van deze assay is om de effecten van specifieke behandelingen op cellulaire adhesie onder omstandigheden van schuifspanning te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van immuuncelsignalering, zoals welke factoren integrine-activatie mediëren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat individuele adhesiemolecuul-integrineparen bestudeerd kunnen worden in een eenvoudig te reproduceren flowsysteem.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de activatie van LFA1, kan deze ook worden toegepast bij de studie van andere integrines. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode difficulties ervaren, omdat de technische opstelling nauwkeurig moet worden uitgevoerd. Om de CHO-ICAM-cellen te oogsten, wordt de cultuur gedurende één minuut bij kamertemperatuur behandeld met 0,5%trypsin EDTA onder zacht schudden.

Wanneer de cellen beginnen los te laten, neutraliseert u de trypsine met vier milliliter vers medium en telt u het aantal gedissocieerde cellen. Verdun de cellen tot een concentratie van 0,75 × 10⁵ cellen per kamer en centrifugeer ze. Resuspendeer het pellet vervolgens in 30 µL per flowkamer in compleet CHO-ICAM kweekmedium en zaai langzaam aliquots van 30 µL cellen per reservoir van de flowkamer.

Laat de cellen vijf minuten bezinken in een incubator op 37 °C met 5% koolstofdioxide. Voeg vervolgens 200 µL compleet kweekmedium toe aan beide reservoirs van elke kamer en plaats de plaat voor een nachtelijke kweek terug in de incubator. Tel na het oogsten van de T-cellen de cellen en verdun de celsuspensie tot een concentratie van 2 × 10⁶ cellen per kamer.

Centrifuge vervolgens de cellen en resuspendeer het pellet in één milliliter PBS, aangevuld met 1% glucose per 2 × 10⁶ T-cellen. Label daarna de T-cellen in een 1:1000 verdunning van CFSE, beschermd tegen licht, gedurende acht minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer aan het einde van de incubatie de cellen en resuspendeer het pellet in 240 µL serumvrij RPMI-medium per kamer.

Verdeel de cellen vervolgens over één 1,5 milliliter buisje per kamer en bewaar de buisjes in een warmteblok van 37 degrees Celsius tot het laden. Verwarm vóór de beeldvorming de live-imagingkamer van de microscoop tot 37 degrees Celsius en vul een glazen fles van 500 milliliter met water. Maak twee gaten in het deksel, gelabeld als 'in' en 'out', en leid de slang van de spuit die de input verbindt door het 'in'-gat, en de slang die het inputreservoir verbindt door het 'out'-gat.

Gebruik een spuit van 60 milliliter om de toevoerslang door te spoelen met 60 milliliters water, gevolgd door 60 milliliters serumvrij medium van 37 degrees Celsius om alle lucht uit het systeem te verwijderen. Wanneer de slang is geprimed, wordt de gehele toevoeropstelling in de live-imagingkamer van de microscoop geplaatst om het systeem op 37 degrees Celsius te houden. Leid de slang en de spuit buiten de kamer en plaats de spuit in de spuitpomp.

Maak vervolgens een gat in de dop van een fles van 250 milliliter die als afvalcontainer dient en leid de uitlaatslang door het gat in de fles. Draai daarna de dop van de afvalfles losjes vast en plaats de gehele uitlaatopstelling in de live-imagingkamer. Plaats nu het flowchamber-preparaat op de objecttafel van de microscoop en gebruik het 20X objectief om het brandvlak in te stellen op de CHO ICAM monolaag.

Begin vervolgens met de ongestimuleerde controle door drie volumes van 70 µL uit het uitlaatreservoir van de eerste kamer te verwijderen, en voeg drie volumes van 70 µL CFSE-gelabelde T-cellen toe aan het inlaatreservoir. Terwijl de T-cellen van de inlaat naar de uitlaat bewegen, worden vijf willekeurige velden met CFSE-positieve T-cellen in elke kamer gefotografeerd om de celcounts vóór de flow te verkrijgen. Bevestig daarna gelijktijdig de inlaat- en uitlaatslangen aan de reservoirs van de flowkamer, waarbij nauwkeurig wordt toegezien dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd, en start de shear stress flow bij 0,3 mL per minuut, terwijl de CFSE-gekleurde T-cellen visueel blijven worden gevolgd.

Zodra er beweging van de T-cellen wordt waargenomen, start u een timer voor vijf minuten en beëindigt u de flow aan het einde van deze periode van vijf minuten. Maak vervolgens afbeeldingen van vijf velden met CFSE-positieve cellen in elke kamer, waarbij de velden willekeurig worden gekozen om de celgetallen na de flow te bepalen. Voor PMA-stimulatie stimuleert u één buis T-cellen met PMA om als positieve controle te dienen, direct voordat de T-cellen in de tweede flowkamer worden geladen voor beeldvorming, zoals zojuist is gedemonstreerd.

Voor stimulatie met SDF-1 alpha verwijdert u eerst drie aliquots van 70 µL medium uit het uitlaatreservoir van de derde kamer, en voegt u vervolgens 70 µL SDF-1 alpha toe aan het inlaatreservoir. Verwijder na vijf minuten drie aliquots van 70 µL uit het uitlaatreservoir en voeg de resterende buis met T-cellen toe voor beeldvorming, zoals zojuist gedemonstreerd. In deze representatieve afbeeldingen is een vergelijkbaar aantal T-cellen waarneembaar vóór de flow onder de verschillende stimulatiecondities.

Na vijf minuten continue schuifspanning neemt het aantal adherente T-cellen toe onder de stimulatiecondities met PMA en SDF-1 alpha, terwijl een klein aantal ongestimuleerde T-cellen geadhereerd blijft. SDF-1 alpha-activering van T-cellen induceert bijvoorbeeld een bijna tweevoudige toename in T-celadhesie vergeleken met de ongestimuleerde controlecellen. Bovendien, wanneer het adhesiepercentage van primaire humane CD3-positieve T-cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van SDF-1 alpha wordt berekend, adhereert 15% van de ongestimuleerde T-cellen onder schuifspanning, vergeleken met 50% van de T-cellen onder SDF-1 alpha-activeringscondities.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze redelijkerwijs worden uitgebreid naar zes experimentele kamers in één assay. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er alleen met de confluente ICAM-monolaag wordt gewerkt. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals celvormanalyse, worden uitgevoerd op de vastgelegde beelden om aanvullende vragen te beantwoorden.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u celadhesie onder shear stress-omstandigheden kunt kwantificeren. Bedankt voor het bekijken van deze video en veel succes met uw experimenten.