Name: Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Leer een flow-adhesieassay voor T-celadhesie onder schuifspanning met CHO-ICAM-cellen en confocale microscopie. Deze methode kwantificeert integrine-activering zoals LFA1 voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De Rheumatology Research Foundation en de Hirschil Trust ondersteunden dit werk.

1. Plating de CHO-cellen ICAM Opmerking: Het doel van deze stap is de CHO-cellen overnacht ICAM plaat in de stromingskamers groei met als doel het genereren van een confluente monolaag. <ol><li> Onderhouden CHO-ICAM-cellen in 10 cm weefselkweek behandelde kweekschalen in 10 ml RPMI medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (CHO-ICAM compleet kweekmedium) bij 37 ° C met 5% CO 2. </li><li> Om cellen te verzamelen, voeg 1 ml 0,5% trypsine-EDTA en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min onder zacht schudden. Neutraliseer de trypsine met 4 ml medium. </li><li> Tel de CHO-ICAM-cellen met behulp van een hemacytometer en bereken 0,75 x 10 5 cellen per kamer. Opmerking: In dit experiment: 2,25 x 10 5 cellen nodig is om 3 kamers zaad. </li><li> Centrifugeer 0,75 x 10 5 CHO-cellen ICAM per kamer gedurende 5 min bij 500 xg, kamertemperatuur en resuspendeer de celpellet in 30 gl per kamer van CHO-ICAM Volledige cultuur media. Let op: In dit experiment wordt 90 ul nodig zijn om 3 kamers zaad. </li><li> Voeg langzaam de cellen in een reservoir van de stroom kamer. Laat de cellen te regelen voor 5 min in 37 ° C incubator met 5% CO2. </li><li> Voeg 200 ul van complete cultuur media over de twee reservoirs van elke kamer. Alternate toevoegingen tussen de twee bewegingen van de cellen te voorkomen als het systeem in evenwicht. </li><li> Incubeer de cellen overnacht in een 37 ° C incubator met 5% CO2. </li></ol> 2. Bereiding van de T-cellen Opmerking: Deze test kan worden uitgevoerd met primaire humane T-cellen of T-cellijn. Een protocol op T-cel-isolatie van bloed is eerder beschreven. 10 Bij gebruik van primaire menselijke T-cellen te gebruiken vers geïsoleerde cellen voor het beste resultaat. Bij gebruik van een T-cellijn, volgt de cultuurprotocol door de bron van de cellen. Om de cellen op een fluorescerende Micr detecterenpe de T-cellen gelabeld met carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE). <ol><li> Tel de T-cellen met behulp van een hemacytometer en bereken 2 x 10 6 cellen per kamer. Opmerking: In dit experiment wordt 6 x 10 6 cellen nodig voor 3 kamers. </li><li> Centrifugeer 2 x 10 6 cellen per T kamer gedurende 5 min bij 500 xg, kamertemperatuur en resuspendeer de cellen in 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1% glucose en 2% FBS. </li><li> Voeg CFSE bij 1: 1000 verdunning (voorraad gemaakt tot 5 mm). Bedek tegen licht en incubeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur </li><li> Spin bij 500 xg gedurende 5 min, RT. </li><li> Resuspendeer celpellet met 240 ul per staat (zie hoofdstuk 4 &quot;Note&quot;) RPMI media ontbreekt serum. In dit experiment, resuspendeer de celpellet in 720 ui RPMI vlakte. Verdeel de cellen in lege 1,5 ml buisjes gelabeld voor elke kamer, 240 ul per buis. Houd cellen in een 37 ° C verwarmen blok tot gebruik. </li></ol> 3. Het opzetten van the Input / Output Hosing en -spuitpomp <ol><li> Verwarm de microscoop live-imaging kamer tot 37 ° C. </li><li> Bereid de ingang schoonspuiten: <ol><li> Vul een 500 ml glazen fles met water en maak 2 gaten in het deksel. Label de gaten &quot;in&quot; en &quot;out.&quot; Deze zal fungeren als een verwarmen van water bad voor de input media. </li><li> De ingangsstroomkabels schoonspuiten door de gaten in het deksel en in het waterbad. Zorg ervoor dat de zijde van het schoonspuiten die aansluit op de spuit komt door de &quot;in&quot; gat en de kant die zal aansluiten op de ingang reservoir komt door de &quot;out&quot; gat. </li><li> Spoel de input schoonspuiten met 60 ml water om alle lucht uit het systeem te verwijderen. </li><li> Prime de ingang afspuiten met RPMI medium zonder serum verwarmd tot 37 ° C. Vul een 60 ml spuit en duwen door de media tot het schoonspuiten is volledig gegronde en het ontbreekt aan eventuele luchtbellen. Opmerking: Afhankelijk van de length slang gebruikt het volume dat nodig is om prime zal variëren. <ol><li> Bereken de hoeveelheid media die nodig zijn voor het experiment van de stroomsnelheid (hier 0,3 ml / min) te vermenigvuldigen met het aantal minuten (5 min) van het aantal kamers in het experiment (hier 3); in dit experiment gebruikt 4,5 ml media. Let op: Wij raden met 5 ml extra volume (hier in totaal 9,5 ml) die nog in de spuit na priming. </li></ol></li><li> Plaats het gehele ingangsinstelling in de levende beeldvorming behuizing van de microscoop 37 ° C te houden. Voer het schoonspuiten en spuit uit de behuizing en plaats de injectiespuit in de injectiepomp. </li></ol></li><li> Bereid de uitgang schoonspuiten: <ol><li> Een gat in het deksel van de fles 250 ml te gebruiken als output afval. </li><li> Voer het uitgangsbuizen door het gat en in de fles. Losjes zet de deksel niet helemaal sluiten. </li><li> Leg de output setup in de live-imaging omheining van het microscope. </li></ol></li><li> Bereken het debiet (ml / min) moet de gewenste schuifspanning (dyn / cm 2) genereren. Schuifspanning varieert in verschillende vasculaire compartimenten, neem dan ook rekening gehouden met de algemene model met inbegrip van celtypen te onderzoeken en behandelingen bij de besluitvorming over een shear stress-niveau. Let op: Deze experimenten worden uitgevoerd bij 0,4 dyn / cm2 om nauw samen te bootsen een kleine ader setting. <ol><li> Neem de kamer afmetingen rekening gehouden bij de berekening van shear stress. Gebruik de volgende formule (verstrekt door de fabrikant 11) voor de stroom kamers hier gebruikt (zie tabel of Materials): T = η * 176,1 * ø waarbij T = shear stress, η = dynamische viscositeit, ø = debiet. Opmerking: De dynamische viscositeit van RPMI medium bij 37 ° C is 0,007. </li></ol></li></ol> 4. Laden van de Flow Chambers en stimulatie van de cellen Let op: Om hechting te leiden,T-cellen worden gestimuleerd. In het volgende experiment wordt de ongestimuleerde cellen ofwel blijven of worden gestimuleerd met SDF-1α 12 of forbolmyristaatacetaat (PMA; positieve controle) 13. Voor een juiste weergave van chemokine T-cel, zijn CHO-ICAM-cellen gepreïncubeerd met SDF-1α (serieel gevolgd door wassen), waardoor de presentatie op het celoppervlak. PMA is een forbolester die structureel vergelijkbaar met de tweede boodschapper diacylglycerol (DAG); hier wordt gebruikt als een positieve controle. T-cellen worden direct behandeld met PMA vóór het laden in de stromingskamer. <ol><li> Plaats de stroom kamer dia op de microscoop en zet de focal plane op de CHO-ICAM monolaag met behulp van de 20X objectief. </li><li> Houd CFSE-gekleurde T-cellen voor alle andere voorwaarden in de 37 ° C verwarmen blok. Bereid de CHO-ICAM of T-cellen vóór de test voor deze voorwaarde als volgt: <ol><li> Voor de niet gestimuleerde toestand (kamer 1), houdt één buis / stroom chamber onbehandeld, als negatieve controle voor stimulatie dienen. </li><li> PMA stimulatie (kamer 2) stimuleren een buis van T-cellen met PMA (10 ng / ml) als positieve controle te dienen; behandel onmiddellijk vóór het laden in de stroom kamer. </li><li> Voor SDF-1α stimulatie, (kamer 3) stimuleren de derde stromingskamer met SDF-1α (100 ng / ml) door 70 gl per keer 3 keer uit het bovenste reservoir (output reservoir) en vervolgens toevoegen van 70 gl SDF -1α (100 ng / ml) in het onderste reservoir (input reservoir). Incubeer gedurende 5 min. </li></ol></li><li> Verwijder en gooi 70 ul op een moment 3 keer van de uitgang reservoir van één kamer. </li><li> Voeg 70 ul van voorbehandeld (indien van toepassing) T celsuspensie in de ingang reservoir 3 maal. Wacht 5 minuten om de cellen om van de inlaat van de kamer ( &quot;In&quot;), en de proximale uitlaat ( &quot;Out&quot;) van de kamer bereiken. </li><li> Gedurende deze tijd, afbeelding 5velden CFSE-gekleurde T-cellen. Kies velden die gedurende het midden van de kamer (figuur 1) worden gedispergeerd. Gebruik de volgende excitatie / emissie voorwaarden: excitatie laser golflengte: 488 nm; emissie collectie filter: 500 - 540 nm. Deze beelden zullen dienen als de pre-flow-cel-tellingen. </li><li> Bevestig de input en output buizen tegelijkertijd de stromingskamer reservoirs. Opmerking: Bevestigen van de buis gelijktijdig is cruciaal om geen luchtbellen te introduceren in de kamer en bewaard bleef evenwicht binnen de kamer. </li><li> Begin stroom bij 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm 2), terwijl het visualiseren van de CFSE-gekleurde T-cellen. Als er stroming, vooral met de eerste kamer, er vaak verloren gaat tussen de stroom en observeren T cel rollen dus beginnen timing 5 min bij aanvang van T-cel beweging. </li><li> Beëindigen flow na 5 min, en het beeld 5 velden in de CFSE kanaal. Kies velden willekeurig verspreid throughout het centrum van de stromingskamer (figuur 1). Deze beelden zullen dienen als de post-stroom cel telt. </li></ol> 5. Het bepalen van de Percentage van de hechtende cellen Noot: Bepaling van het aantal cellen in de verkregen beelden objectief gebeurt met geautomatiseerde software. Voor onze studies gebruikten we de software Volocity (versie 6.2.1), maar ook andere software zoals ImageJ (Version 1.48V) zijn eveneens toepasbaar. <ol><li> Bepaal het aantal cellen per veld pre-flow voor elke conditie. Het gemiddelde van de 5 velden is het &quot;pre-stromingsgemiddelde celtelling.&quot; 7 </li><li> Bepaal het aantal cellen per veld post-flow voor elke conditie. Het gemiddelde van de 5 velden is het &quot;post-stromingsgemiddelde celtelling.&quot; 7 </li><li> Bereken het percentage hechtende cellen met de volgende formule: percentage hechtende cellen = (na stromingsgemiddelde celtelling) / (pre-stromingsgemiddelde celtelling) x 100%. </li></ol>

<ol><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li>
<li>Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li>
<li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-triggered+leukocyte+arrest%3A+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+and+its+effector+RIAM+are+required+for+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking.</a> Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).</li>
<li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+adhesion+of+CD4%2B+T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li>
<li>Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+adhesion+assay+for+the+study+of+integrin+activation+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+11%22">Application Note 11</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf">http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf</a> (2014).</li>
<li>van Gijsel-Bonnello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantethine+Alters+Lipid+Composition+and+Cholesterol+Content+of+Membrane+Rafts%2C+With+Down-Regulation+of+CXCL12-Induced+T+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration.</a> J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).</li>
<li>Tozeren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+adhesion+of+phorbol+12-myristate-13-acetate-stimulated+T+lymphocytes+to+planar+membranes+containing+intercellular+adhesion+molecule-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1.</a> Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).</li>
<li>Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+mechanisms+regulating+chemokine+activity+and+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability.</a> Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).</li>
<li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+binding+assay+for+studying+chemokine+interactions+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells.</a> J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li>
<li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1%3A+getting+a+grip+on+leukocyte+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion.</a> J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om goed te analyseren T celadhesie, de stimulans voor opname in de studie moet worden overwogen bij het ​​kiezen van een in vitro werkwijze. Hoewel er verschillende assays om signalen leidt tot LFA-1 activering en ICAM-1 bindende bestuderen alle methoden zijn niet uitwisselbaar. Een statische hechting assay 10 is het meest geschikt voor T-cel-APC interacties te bestuderen; Als alternatief kan de shear stress methode die hier beschreven is ideaal om T-cel-epitheliale cel interacties te modelleren. <em...

T lymfocyt adhesie medieert een aantal verschillende werkwijzen in een gezond immuunsysteem, 3 cruciale rol spelen in T celtransport en antigeenpresentatie. Of tijdens immune surveillance of een actieve immuunreactie beide brede rollen voor hechting kritisch. 4 Fysiologische signalering gebeurtenissen van T-cel-endotheelcelinteracties verschillen van T-cel-antigeen-presenterende cel (APC) interacties en vereisen daarom verschillende methodes studie om het best begrijpen de signalering cascades betrokken. De firma hechting van een T-cel naar een wand van het bloedvat tijdens lymfocyten extravasatie vereist een snelle en dynamische integrine activering. De nauwe interactie tussen een actieve toestand integrine en adhesiemoleculen aan het endotheel leidt tot hechting bestand tegen de bloedstroom, waardoor T-cellen te kruipen langs het oppervlak, op zoek naar een gebied permissief celpassage. 5 het doorzoeken van een T-cel bi -directionally alonga bloedvatwand is aangewezen op gepolariseerd hechting en is uitdrukkelijk kleefstof vooreinde van de T-cel. 6 Belangrijker, stevige adhesie en transmigratie bestand moeten zijn tegen de afschuifkracht opgewekt door circulerende bloedstroom. Bij het ontwerpen van experimenten om lymfocyt adhesie studeren, moet aandacht worden besteed aan de specifieke stimulus van belang. Terwijl integrine activering een gemeenschappelijke en essentieel onderdeel van alle vormen van T-cel adhesie, de stromen van activering waarschijnlijk unieke stroomafwaarts van individuele receptoren en co-receptoren zijn. Evenzo, en integrine adhesiemoleculen paren functioneren in gespecialiseerde micro-omgevingen en specifieke subpopulaties. Zo kunnen deze paren heel verschillend geregeld. De hier gepresenteerde model is ideaal voor de studie van signalering cascades leidt aan integrine activering plaatsvindt onder schuifspanning omstandigheden. 7 Deze interacties kunnen niet adequaat worden opgevat in een statische lijm,betreffende systeem door het effect van deze krachten bleek direct bij hebben op T-cel gedrag. 8 Hoewel hier voorgesteld met T-cellen en CHO (Chinese Hamster Ovarium) cellen om humaan ICAM-1 (CHO-ICAM-cellen) tot expressie kan het systeem eenvoudig worden aangepast verschillende leukocyt populaties of adhesiemoleculen te bestuderen. Deze analyse verschaft een werkwijze om T-cel hechting en integrine activering kwantificeren volgens afschuifspanning, die een model voor de stevige adhesie fase van extravasatie van leukocyten. Door het gebruik van CHO-cellen ICAM de affiniteit van LFA-1 voor zijn ligand in levende cellen in real time kan worden onderzocht in reactie op verschillende stimuli plaats. Deze techniek vereist gemakkelijk te verkrijgen, in de handel verkrijgbare micro-stromingskamers in combinatie met een spuitpomp, veel eenvoudiger de nodige bloedstroom en schuifspanning modelleren apparatuur in vergelijking met andere modellen. 9 Een ander groot voordeel van deze test is dat specifieke signaleringcascades en de resulterende activatie status van afzonderlijke integrinen kan netjes worden bestudeerd door het gebruik van gemanipuleerde CHO-cellen die humane adhesiemoleculen plaats. Bovendien is de combinatie van kwantitatieve gegevens beeldvorming van levende cellen is een belangrijk voordeel van deze methode. Overall, terwijl een aantal assays statische T celadhesie beschreven die mooi model T-cel-interacties APC, deze modellen zijn onvoldoende vastleggen van het dynamische proces van T-cel-epitheliale adhesie. Daarom, bij het kiezen van een adhesietest de stimulus opnieuw dienen te worden beschouwd.

<table><tbody><tr><td>T cell samples (cell line or primary)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Perifere menselijke T-cellen</td></tr><tr><td>CHO-ICAM-1 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-2093</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide VI 0.4 ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>500 ml glazen fles</td><td>Fisher</td><td>FB800500</td><td></td></tr><tr><td>250 ml glazen fles</td><td>Fisher</td><td>FB800250</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen slang 0,8 mm</td><td>ibidi</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscoop met incubatorkamer</td><td>Ziess</td><td>700</td><td>Elke brede veld fluorescerende microscoop</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>60 ml spuit</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>eBioscience</td><td>65-0850</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alpha;</td><td>R&amp;D</td><td>350-NS-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>12-702F/12</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Versie 6.2.1</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Versie 1.48V</td><td></td></tr><tr><td>In weefsel gekweekte kweekschotels</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%) Fenol Rood</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated FBS</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Fisher</td><td>BP295950</td><td></td></tr></tbody></table>

assay van adhesie under shear stress voor de studie van t-lymfocyten-adhesie molecule interacties

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T-cel adhesie is een kritische component van functie bijdraagt ​​aan de verschillende processen van cellulaire rekrutering op plaatsen van ontsteking en interactie met antigeen presenterende cellen (APC) bij de vorming van immunologische synapsen. Deze twee contexten van T cel adhesie verschil is dat T-cel-interacties APC kan statisch worden beschouwd, terwijl T-cel-interacties bloedvat worden geconfronteerd met de schuifspanning die door circulatie zelf. T-cel-interacties APC worden geclassificeerd als statisch, dat de twee mobiele partners statisch ten opzichte van elkaar. Meestal deze interactie plaatsvindt binnen de lymfeklieren. Als een T-cel interageert met de wand van het bloedvat, de cellen te arresteren en moet de gegenereerde shear stress te weerstaan. 1,2 Deze verschillen onderstrepen de noodzaak om beter te begrijpen statische hechting en hechting onder stroom voorwaarden als twee afzonderlijke wettelijke processen. De regulering van T-cel-adhesie kunnen de meeste bondig worden omschreven als controlling de affiniteitstoestand integrine moleculen tot expressie gebracht op het celoppervlak, en daardoor de interactie van integrinen met het adhesiemolecuul liganden op het oppervlak van de interagerende cellen reguleren. Onze huidige kennis van de regulatie van integrine affiniteit staten komt uit vaak simplistisch in vitro modelsystemen. De bepaling van adhesie middels stroming hier beschreven omstandigheden maakt de visualisatie en kwantificatie van T-cel-epitheliale cel interacties in real time volgen van een stimulus. Een hechting onder stroom test kan worden toegepast op studies van hechting signalering in T-cellen na behandeling met remmende of stimulerende stoffen. Bovendien kan deze test worden uitgebreid buiten T-cel signalering naar elke lijm leukocyten bevolking en eventuele integrine-adhesie molecuul pair.

Representatieve resultaten worden weergegeven van de stroom adhesietest behulp Jurkat en primaire humane CD3 + T-cellen, zoals aangegeven, gestimuleerd met SDF-1α. De negatieve controles in elke getoonde experimenten ongestimuleerde cellen. Een drempel basale procent adhesie van ongestimuleerde cellen tussen 5 - 10%; base hechting met name boven deze range duidt op een problematische experiment en stelt het begin populatie van T-cellen werden niet-specifiek pre-geactiveerde in...

Deze stroom adhesietest een eenvoudige, high impact model van T-cel-epitheliale cel interacties. Een spuitpomp gebruikt om afschuifspanning te genereren en confocale microscopie neemt beelden voor kwantificering. Het doel van deze studies is om effectief te kwantificeren T-cel adhesie met behulp van stroom omstandigheden.

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Het algemene doel van deze assay is om de effecten van specifieke behandelingen op cellulaire adhesie onder omstandigheden van schuifspanning te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van immuuncelsignalering, zoals welke factoren integrine-activatie mediëren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat individuele adhesiemolecuul-integrineparen bestudeerd kunnen worden in een eenvoudig te reproduceren flowsysteem.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de activatie van LFA1, kan deze ook worden toegepast bij de studie van andere integrines. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode difficulties ervaren, omdat de technische opstelling nauwkeurig moet worden uitgevoerd. Om de CHO-ICAM-cellen te oogsten, wordt de cultuur gedurende één minuut bij kamertemperatuur behandeld met 0,5%trypsin EDTA onder zacht schudden.Wanneer de cellen beginnen los te laten, neutraliseert u de trypsine met vier milliliter vers medium en telt u het aantal gedissocieerde cellen. Verdun de cellen tot een concentratie van 0,75 × 10⁵ cellen per kamer en centrifugeer ze. Resuspendeer het pellet vervolgens in 30 µL per flowkamer in co

assay-adhesion-under-shear-stress-for-study-t-lymphocyte-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Tijdens het infectieproces, een belangrijke stap is de hechting van pathogenen met gastheercellen. In de meeste gevallen deze hechting stap gebeurt in de aanwezigheid van mechanische spanning opgewekt door stromende vloeistof. Beschrijven we een techniek die schuifspanning introduceert als een belangrijke parameter in de studie van bacteriële hechting.

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

Leukocyten rekrutering naar de lever plaatsvindt binnen de gespecialiseerde kanalen van de lever sinusoïden die worden omzoomd door unieke lever sinusoïdale endotheelcellen. Fasecontrastmicroscopie van werving leukocyten over humane lever sinusvormige endotheel onder omstandigheden van fysiologische shear stress kan de ontrafeling van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit proces te vergemakkelijken.

Een Flow adhesieanalyse om te studeren leukocyten rekrutering van humane lever Sinusvormige endotheel onder omstandigheden van Afschuifspanning

Statische adhesietest is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om het model van interacties tussen T-lymfocyten en andere celtypes. Interacties worden gegenereerd door het injecteren gelabelde T-cellen in putjes bekleed met adhesiemoleculen, terwijl een plaatlezer wordt gebruikt om het aantal hechtende cellen te kwantificeren na seriële wasbeurten.

Statische Adhesie Assay voor de Studie van Integrine Activering in T-lymfocyten

We rapporteren een in vitro methode die de kwantificering van het werkelijke aantal adhesieve cellen binnen een endotheelcelmonolaag mogelijk maakt.

Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen<em&gt; In Vitro</em

Celoppervlak verklevingen staan ​​centraal in mechanotransductie, omdat ze mechanische spanning verzenden en inleiding van de signaalwegen die betrokken zijn in het weefsel homeostase en ontwikkeling. Hier presenteren we een protocol voor het ontleden van de biochemische routes die worden geactiveerd in reactie op de spanning, onder toepassing van ligand beklede magnetische microkralen en krachtuitoefening adhesie receptoren.

Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

Dynamische wrijvingscoëfficiënt van immune cellen aan de vaatwand is een voorwaarde voor gut homing. Hier presenteren we een protocol voor een functionele in vitro assay voor de analyse van de impact van anti-integrine antilichamen, chemokines of andere factoren op de dynamische cel adhesie van menselijke cellen, met addressin beklede haarvaten.

Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

We beschrijven een in-oplossing methode om uniforme shear toe te passen op bloedplaatjes oppervlak receptoren met behulp van Cone-plate viscosimeter. Deze methode kan ook breder worden gebruikt om shear toe te passen op andere cel types en cel-fragmenten en hoeft niet te richten op een specifieke ligand-receptor paar.

Een uniform shear assay voor menselijke bloedplaatjes en cel oppervlakte receptoren via Cone-plate viscosimeter

Deze methode is nuttig voor het kwantificeren van de vroege dynamiek van cellulaire adhesie en het verspreiden van verankerings afhankelijke cellen op het fibronectin. Bovendien kan deze test worden gebruikt om de effecten van veranderde redox homeostase op celspreiding en/of celadhesie-gerelateerde intracellulaire signalering trajecten te onderzoeken.

Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Leer een flow-adhesieassay voor T-celadhesie onder schuifspanning met CHO-ICAM-cellen en confocale microscopie. Deze methode kwantificeert integrine-activering zoals LFA1 voor immunologisch onderzoek.

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Meer video's verkennen