Isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen / stromale cellen afkomstig van menselijke placenta Tissue

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren en vermeerderen van mesenchymale stamstromale cellen afgeleid van menselijk placentaweefsel. Hoi, ik ben Mike Doran. Ik ben groepsleider aan de Queensland University of Technology bij het Translational Research Institute in Brisbane, Australië.

Hallo, mijn naam is Rebecca Pelekanos en ik ben onderzoeker bij het University of Queensland Center for Clinical Research. Vandaag demonstreer ik de procedure voor de isolatie van MSC's. De placenta wordt normaal gesproken na de geboorte weggegooid.

Omdat het weefsel een gewicht van vijf tot 700 gram heeft, biedt het een uniek grote bron van allogene mesenchymale stamcellen. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn aan de isolatie van placentaire MSC's problemen ondervinden omdat ze onbekend zijn met de anatomie van de placenta, onbekend zijn met de manier waarop het weefsel moet worden verwerkt en niet weten welk type cellen, maternaal of foetaal, hun uiteindelijke MSC-cultuur zullen bevolken. Om onderzoekers te ondersteunen, bespreken we deze belangrijke details in deze video.

De eerste stap in deze procedure is het bekendmaken met de anatomie van de placenta. De tweede stap in deze procedure is het handmatig dissecteren van 10 gram weefsel uit respectievelijk de decidua, de chorionvlokken of de chorionplaat, met behulp van een schaar. De eerste twee stappen worden hier nogmaals schematisch samengevat.

In stap drie worden de decidua, chorionvlokken of de weefsels van de chorionplaat verder fijngehakt met een schaar. In stap vier worden de cellen uit de kleine weefselstukjes vrijgemaakt via een digestie van één tot twee uur in dispase en collagenase I. In stap vijf worden de cellen van het fibreuze weefsel gescheiden door ze door een celzeef te wassen. De cellen worden vervolgens verzameld, resuspendeerd in kweekmedium en in kweekflessen geplaatst.

Mesenchymale stromale cellen, MSC's, zullen worden geselecteerd op basis van hun neiging tot plasticadherentie en hun vermogen om te overleven en te prolifereren in het celkweekmedium. Ten slotte kunnen de geëxpandeerde MSC's in de resultatensectie worden gekarakteriseerd en bewaard worden voor gebruik in toekomstige experimenten. De placenta is een tijdelijk orgaan dat de uitwisseling van voedingsstoffen en afvalstoffen tussen de foetus en de moeder tijdens de zwangerschap mogelijk maakt.

De placenta kan eenvoudig aseptisch worden verzameld na een keizersnee en de veilige geboorte van de baby. De placenta bestaat hoofdzakelijk uit vasculatuur en membranen van foetale oorsprong. Het bevat echter ook enkele maternale cellen.

De placenta is verbonden met de uterus via zowel maternale, uit de uterus afgeleide deciduale cellen als foetale, invaderende trofoblasten. Het is gewoonlijk niet mogelijk om met het blote oog de precieze interface tussen het maternale en foetale weefsel te onderscheiden. De foetale zijde van de placenta is echter eenvoudig te identificeren als de zijde waar de navelstreng zich bevindt.

Wanneer de baby is geboren, blijft er slechts een dunne laag deciduaal weefsel verbonden met de placenta. Door de fysieke oriëntatie van de placenta is het mogelijk om de drie weefsels te lokaliseren die we vandaag zullen oogsten. Het eerste weefsel dat geoogst zal worden, is het maternale decidua.

De groene markering wijst naar het deciduaal weefsel dat op het oppervlak achterblijft nadat de placenta is losgelaten van de baarmoederwand. Het tweede weefsel dat uit het binnenste van de placenta zal worden geoogst, zijn de foetale chorionvlokken. Deze worden in de diagrammen aangegeven door de blauwe cirkels.

Het derde weefsel dat wordt geoogst, is de foetale choriaonplaat. Dit weefsel is op de diagrammen aangegeven met de rode markeringen. Oké, laten we beginnen.

Plaats de placenta in de biologische veiligheidskabinet. Vouw de foetale membranen open en oriënteer uzelf op de delen van de placenta. De foetale zijde met de aanhechting van de navelstreng, de chorioamniotische vliezen, of de vruchtzak.

Het foetale oppervlak van de placenta vertoont duidelijke grote bloedvaten in de chorio-plaat, met daarboven het amnioonmembraan, dat overigens eenvoudig mechanisch kan worden gescheiden. De maternale zijde bevindt zich tegenover de foetale zijde en vertoont duidelijke cotylen of lobben. Zorg ervoor dat het maternale oppervlak naar boven is gericht.

Snijd stukjes van 0,5 cm dikte uit de maternale zijde van de placenta of decidua. Plaats tijdens de dissecties de weefselstukjes in een petrischaal met Hank's Balanced Salt Solution, of HBSS, om de weefsels vochtig te houden. Agiteer de weefsels in de schalen met HBSS om een deel van het bloed te verwijderen.

Breng voldoende weefsel over om de buis tot de markering van 10 milliliter van een 50 milliliter buis te vullen, ongeveer 10 gram. Let op: in deze fase kan er meer weefsel worden geïsoleerd als er aan het einde van de procedure meer cellen nodig zijn. Zorg ervoor dat het foetale oppervlak naar boven is gericht.

Verwijder het amnioonmembraan mechanisch van het foetale oppervlak van de placenta, waarbij de chorioonplaat intact blijft. Snijd de chorioonplaat in stroken tot ongeveer een halve centimeter diep in het onderliggende villusweefsel. Dissekeer vervolgens chorioonvillusweefsel tot ongeveer één centimeter diep in de placenta vanaf de plek waar de chorioonplaat is verwijderd.

Plaats de weefsels in HBSS en meet ongeveer 10 milliliter van het weefsel, zoals eerder is gedaan. Breng de weefselstukjes, met minimale overdracht van vloeistof, over naar een petri dish van 10 centimeter en knip deze met een schaar in fijne stukjes van ongeveer één kubieke milliliter. Breng het fijngeknipte weefsel terug in de 50 mil buis.

Herhaal dit voor alle overige weefselmonsters. Voeg het vers bereide digestiemedium toe in ten minste een verhouding van één-op-één ten opzichte van het weefsel. Keer de buis meerdere keren om om te mengen.

Incubeer de weefsels in de buis met digestiemedium gedurende één tot twee uur bij 37 °C in een schudincubator. Wanneer de weefseldigestie-oplossing troebel is geworden en witte bloedvaten in de oplossing duidelijk zichtbaar zijn, voeg dan 15 mL HBSS toe om de enzymen in het digestiemedium te verdunnen. Centrifugeer de monsters kortstondig via een pulse-centrifugatie, waarbij de centrifuge slechts vijf seconden lang 340 g bereikt, en stop daarna.

Hierdoor wordt het grove debris gedwongen zich op de bodem van de buis te verzamelen. Plaats de monsters terug in de biologische veiligheidskast. Plaats een celzeef in een nieuwe buis van 50 milliliter.

Pipetteer het supernatant met de mononucleaire cellen in de zeef en vang het eluaat op in de nieuwe buis. Laat het placentawefselresidu achter in de eerste buis. Voeg 15 milliliters HBSS toe aan het placentaresidu, schud krachtig om meer cellen terug te winnen en centrifugeer het monster kort (pulse centrifugatie).

Pipetteer opnieuw het supernatant in de buis met de celzeef in de opvangbuis. Afhankelijk van de consistentie van het monster kan het geschikter zijn om het supernatant in de celzeef te gieten. Was de celzeef met 5 milliliters HBSS.

Gooi de buis met het placentatweefselresidu weg. Centrifugeer de supernatantmonsters gedurende vijf minuten bij 340 g om de cellen te pelletteren. De rode bloedcellen zijn zichtbaar als een laag onderaan de pellet, en de mononucleaire cellen, inclusief de MSC's, vormen de lichtere laag bovenop de rode bloedcellen.

Plaats de monsters terug in de biologische veiligheidskabinet. Decanteer voorzichtig het supernatant en gooi dit weg. Tik met een vinger enkele keren tegen de buis om de celpellet los te maken en resuspendeer de celpellet in 35 milliliters MSC-medium.

Overbreng de celsuspensie naar één T175-fles per 10 ml weefsel en kweek deze in een incubator bij 37 °C met 5% CO2. Vervang na de isolatie het kweekmedium na 48 uur. Voed de kweken één keer per week totdat ze confluent zijn.

Kulturen zouden na ongeveer 14 dagen confluent moeten zijn. Breid vervolgens de cellen uit en cryopreserveer deze, analyseer de MSC-kenmerken en gebruik ze in experimenten. Na 48 uur kweken zullen de MSC's aan het plastic van de weefkweek zijn gehecht, terwijl hematopoëtische en andere celpopulaties dat niet zullen zijn.

Op dit moment wordt het medium vervangen door 35 milliliters vers kweekmedium. Het uiterlijk van het kweeksupernatans kan aanzienlijk variëren tussen placenta-donoren. Voorbeeld één en twee illustreren deze variatie.

Deze twee isolaties werden gelijktijdig uitgevoerd, maar afkomstig van twee verschillende placenta's. Na het wassen zijn de culturen vrij van rode bloedcellen en weefselresten, zoals getoond in voorbeeld drie, en de daaropvolgende resultaten van de expansie zijn over het algemeen consistent. Na de mediumverversing na 48 uur zijn slechts enkele cellen aan de fles gehecht.

Zeven dagen na isolatie zijn fibroblastische MSC-kolonies zichtbaar, hoewel er ook non-MSC-cellen aanwezig zijn, als ronde of losjes gehechte cellen. 13 dagen na isolatie zijn de fibroblastische MSC-kolonies groot en is de MSC-monolaag vaak voldoende confluent en klaar voor passage. Vanaf de eerste passage ontwikkelt de MSC-monolaag bij confluentie een karakteristieke wervelachtige morfologie.

De placentaire MSC vertonen een klassiek MSC-markerprofiel bij analyse via flowcytometrie. De cellen zijn positief voor CD73, CD105 en CD90, en negatief voor de hematopoëtische markers CD45, CD34 en HLA-DR. De placentaire MSC ondergaan over het algemeen een robuuste osteogene differentiatie, maar een geringe adipogene differentiatie.

Veel publicaties gaan ervan uit dat cellen die uit het foetale chorion zijn geïsoleerd, na kweek foetale MSC opleveren. Echter, zoals wij eerder hebben gerapporteerd, raken alle culturen die volgens dit protocol uit het foetale chorion zijn verkregen snel verrijkt met maternale MSC, wat ook verwacht zou worden voor de maternale deciduale MSC-culturen. De hier getoonde gegevens kwantificeren de foetale en maternale celcompositie van de placentaire MSC-culturen die zijn geïsoleerd uit deciduaal weefsel, chorionvlokken en de chorionplaat.

Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u MSC's afkomstig van placentawevsel kunt isoleren en kweken. We hopen dat u deze methoden nuttig vindt voor uw onderzoek en klinische toepassingen waarbij gebruik wordt gemaakt van placenta-afgeleide MSC's.