Name: Dijbeen Window Chamber Model voor In Vivo Cell Tracking in het Muizen Bone Marrow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Leer het dijbeen window chamber model voor in vivo celtracking in muizenbotmerg. Deze methode maakt langdurige beeldvorming van neutrofielen mogelijk met intravitaal multiphoton microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de Advanced Optical Microscopy Facility (www.aomf.ca) van de Universiteit Health Network bedanken voor de hulp bij microscopie, en de heer Jason Ellis van het Princess Margaret Cancer Center Machine Shop voor het vervaardigen van de WC en de imaging podium. We willen ook graag bedanken Dr. Iris Kulbatski voor manuscript bewerken.

LET OP: Alle dierlijke werk werd uitgevoerd in het kader van het protocol # 2615 door de Universiteit Health Network Institutional Animal Care en gebruik Comite uitgevoerd. 1. Chirurgische Voorbereiding van de muis <ol><li> Voor de ingreep steriliseren alle chirurgische instrumenten en het raam kamer (WC) autoclaaf. Vul het drinkwater bij 50 mg / kg lichaamsgewicht van amoxicilline 2 dagen voor de operatie. Injecteer de muis met 0,1 mg / kg lichaamsgewicht intraperitoneaal buprenorfine 4 uur voorafgaand aan de operatie. </li><li> Verdoven de athymische naakt muis door intraperitoneale injectie van 350-400 pi zoutoplossing die 80 mg / kg ketamine en 13 mg / kg xylazine (Let op: Dit werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care Committee, en er is geen ervaring met nadelige gevolgen heeft gehad ). Bevestig de juiste verdoving door het testen voor voetreflex. Blijven observeren voor ademhalingspatroon, slijmvliezen kleur en voetreflex tijdens de procedure. </li><li> Voer de chirurgische procedures onder een bioveiligheid kast om steriele omstandigheden tijdens de operatie te handhaven. Plaats de muis in een elektrisch verwarmingselement bedekt met een chirurgische doek om lichaamstemperatuur te handhaven tijdens de operatie. Voer alle chirurgische procedures onder de stereomicroscoop. </li><li> Toepassing oogzalf om de ogen vochtig te houden tijdens de operatie. Herhaal dit indien nodig tijdens de chirurgische ingreep. Steriliseer het werkgebied van de muis schoon met 7,5% povidonjood, 70% isopropylalcohol en 10% povidonjood na elkaar, en twee keer herhaal deze procedure. </li><li> Maak een 10 mm longitudinale incisie in de huid met behulp van scalpel met een mes (# 15), het naderen van het dijbeen van de zijkant. Expose het dijbeen tussen de flexor en extensor spieren door stompe dissectie behulp van een tang en hemostats spieren functionaliteit te verzekeren. </li><li> Plaats de U-vormige balk onder het bot, en installeer de wc (figuur 1). Zet de bar met het raam met behulp van twee bouten en draai de moeren vooreekhoorntjesbrood. Vult de ruimte tussen het bot en de WC met tandheelkundig cement. </li><li> Afslijpen het corticale bot in een 6 x 2 mm 2 gebied met een micro-boor optische toegang tot de mergholte krijgen. Opmerking: Inspecteer zorgvuldig dunner worden van het corticale bot onder de microscoop tijdens het uitvoeren van deze procedure. Laat een intact, bijna doorzichtige periostale laag van het bot. </li><li> Plaats de 8 mm dekglaasje op het raam, en zet de dekglaasje met een borgring op zijn plaats te houden. </li><li> Stel de spieren van de flexoren en extensoren terug naar hun oorspronkelijke locaties met behulp van een tang om hun functie te behouden na de operatie. Hecht de dermis met behulp van 5-0 hechtdraad en een naald houder. </li><li> Monitor de muis voor het herstel, totdat hij bij bewustzijn is en in staat is om vrij te bewegen. Zet het dier in een nieuwe kooi wanneer teruggewonnen. </li><li> Na herstel, uit te voeren beeld acquisitie op het dier op dezelfde dag of de volgende dagen (zie punt 2). Bewaken van de fysisccal staat van de muis per dag. Opmerking: Monitor fysieke omstandigheden, zoals gewicht dragen op lidmaat, hunching, snelle en oppervlakkige ademhaling, achterste ledematen zwelling, zelfverminking, cellulitis en ernstige dermatitis. </li><li> Geven intraperitoneale injectie van 0,1 mg / kg lichaamsgewicht van buprenorfine gedurende 3 dagen, en 1 mg / kg lichaamsgewicht van meloxicam gedurende 5 dagen na de operatie voor de behandeling van postoperatieve pijn en ontsteking. Ga door het verstrekken van de-amoxicilline aangevuld water gedurende 5 dagen. </li><li> Bij de experimentele eindpunt, euthanaseren het dier door CO 2 narcose, gevolgd door een secundaire methode (bijvoorbeeld, cervicale dislocatie). </li></ol> 2. Image Acquisition gebruik van Gecombineerd Multi-foton en confocale microscopie <ol><li> Voorafgaand aan beeldvorming verdoven de muis door intraperitoneale injectie van een 350-400 pi zoutoplossing die 80 mg / kg ketamine en 13 mg / kg xylazine. U kunt ook gebruik maken van inhaleerbare verdoving, indien beschikbaar.Solliciteer oogzalf. </li><li> Injecteer het mengsel van intravasculaire kleurstoffen voor etikettering vasculatuur (0,65 mg 2 MDa fluoresceïne (FITC) -dextran) en neutrofielen (4 ug Allophycocyanine (APC) -anti-antilichaam Ly6G). </li><li> Gebruik een rechtopstaande gecombineerd multifotonmicroscopie en confocale microscoop uitgerust met een multi-foton laser bereik 705-980 nm twee-foton excitatie, en enkel foton lasers die golflengten voorziet van blauw naar rood. </li><li> Stel een op maat gemaakte imaging podium op de microscoop (Figuur 1B). Zet de muis op het podium door het klemmen van de twee uiteinden van de WC met alligator clips. Let op: Kritische onderdelen van het podium zijn: twee krokodillenklemmen naar het toilet te houden, en een verwarmingselement tot fysiologische temperatuur (37 ° C) van de muis te behouden tijdens de beeldvorming. </li><li> Zet de twee-foton laser en de confocale systeem, en de lancering van het beeld acquisitie software door te klikken op &quot;Start System&quot;. Een venster met 4 tabbladen (Locate,Acquisitie, verwerking en Maintain) zal openen. </li><li> Stel de imaging-kanalen. Klik op &quot;Smart Setup&quot; onder het tabblad Verwerving en kies de kleurstoffen die gebruikt zal worden voor de beeldvorming: FITC (488 nm excitatie, 493-588 nm emissie) en APC (633 nm excitatie en 638-743 nm emissie). Kies &quot;Best Signal&quot; en klik op &quot;Apply&quot;. </li><li> Voeg de tweede harmonische generatie (SHG) beeldacquisitie kanaal handmatig. Zet de twee-foton laser onder het venster &quot;Laser&quot; in het tabblad Verwerving. Onder het raam Channels, klik op het &quot;+&quot; teken om een ​​nummer toe te voegen. </li><li> Stel de SHG spoor. Verander de golflengte van 840 nm onder Channels venster met behulp van de pijltjes omhoog en omlaag, en kies het detectiebereik tot 415-425 nm onder &quot;lichtpad&quot; venster met behulp van de schuifbalk zijn. </li><li> Klik op &quot;Oculars Online&quot; onder het tabblad Locate. Klik FITC onder het filter plaatsen voor FITC naar de regio van belang te bekijken en de scherpstelling handmatig aanpassen door te draaien thij knop zich aan de zijkant van de microscoop. Wanneer de regio van belang ligt, klikt u op &quot;Oculairs Offline&quot; onder het tabblad Locate. </li><li> Klik op het tabblad Verwerving. Selecteer FITC spoor onder Channels venster en klik op &quot;Live&quot; om een ​​voorbeeld van het beeld van FITC-dextran met 5X doelstelling. Pas de scherpstelling, indien nodig, en klik op &quot;Stop&quot; het tabblad Acquisitie naar de voorvertoning te stoppen. </li><li> Handmatig wenden tot 20x water doelstelling door het verplaatsen van een wiel boven de lenzen. Bekijk de afbeelding weer voor FITC-dextran met behulp van de 20X objectief, en pas Master Gain en Pinhole onder het raam Kanalen om een ​​optimale signaal en contrast te bereiken. Herhaal dit voor andere kanalen door het selecteren van APC en SHG tracks onder het raam Channels. </li><li> Kies de imaging parameters. Klik op &quot;Acquisition Mode&quot; om het venster te openen. Stel de framemaat te zijn 1024 x 1024 pixels, en middeling van 4X naar beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen. </li><li> Het verwerven van een 2D-snapshot. Selecteer alle kanalen onder Kanalen winnendow en klik op &quot;Snap&quot; onder het tabblad Verwerving. De kwaliteit van het beeld en beeldparameters eventueel vervangen. </li><li> 2D-afbeelding time-lapse te verwerven. <ol><li> Afvinken &quot;Time Series&quot; in het tabblad Overname om het venster Time Series openen. Typ 0 in het kader van de intervallen en 40 voor het totale aantal scans 40 beelden continu te nemen zonder tijdsinterval. Let op: 40 scans genereert ongeveer 5 minuten lang-serie met een scansnelheid van 7,5 sec / frame en het beeldformaat van 600 pm x 600 pm. Stel het interval en het aantal scans, afhankelijk van de microscoop, beeldacquisitie instellingen en de framesnelheid van de camera. Een vaste intervaltijd (&gt; 0 sec) kunnen worden gebruikt voor time-lapse beelden verkregen op verschillende tijdstippen te vergelijken. Een langere beeldvorming duur time-lapse kan, afhankelijk van de verwachte gemiddelde snelheid van neutrofielen (of andere cellen van belang) in de experimentele conditie vereist. </li></ol></li><li> Acquire 3D-beeld.<ol><li> Afvinken &quot;Z-Stack&quot; op het tabblad Acquisitie naar de Z-Stack venster te openen. Start de &quot;Live&quot; preview-modus voor FITC-dextran. Focus op de top van het monster en klik op &quot;Set First&quot;, en zich richten op het andere uiteinde van het monster en klik op &quot;Set Last&quot; in de Z-stack venster. </li><li> Stel het interval tot 10 urn onder de Z-stack raam. Afhankelijk van de eerste en de laatste optische segment geselecteerd in de vorige stap, zal dit 10-20 plakjes genereren, met totale optische dikte van 90-180 urn. Opmerking: De z-stack interval afhankelijk van de grootte van de pinhole, waarbij de dikte van de optische segment bepaalt. Stel het interval tot minder dan de dikte van de optische segment zijn. </li><li> Klik op &quot;Start Experiment&quot; onder het tabblad Overname om te beginnen met het verzamelen van foto&#39;s. </li></ol></li><li> beeld 3D time-lapse te verwerven. <ol><li> Afvinken &quot;Time Series&quot; en &quot;Z-stack&quot; in het tabblad Acquisitie naar de Time-serie te openenen de Z-stack ramen. </li><li> Stel de tijdreeksen en Z-stack acquisitie parameters zoals beschreven in stap 2.14 en 2.15. Klik op &quot;Start Experiment&quot; onder het tabblad Overname om te beginnen met het verzamelen van foto&#39;s. </li></ol></li><li> Bewaken van de muis tijdens beeldvorming om ervoor te zorgen dat het stabiel is en onbewust. Als de muis is instabiel en / of bewuste tijdens beeldvorming, verwijder de muis van het podium, injecteer extra 100-150 ul van het anestheticum intraperitoneaal en verder imaging. Opmerking: tekenen van instabiliteit zijn een snelle ademhaling en beweging van de muis, die kan worden beschouwd als een verschuiving in artefacten verkregen beelden. </li><li> Na beeldacquisitie, neemt u de muis van het podium af en terug te sturen naar de kooi. Gebruik een warmtelamp om het warm te houden, en het toezicht op de muis totdat het bewuste. </li></ol> 3. beeldanalyse en kwantificering <ol><li> Gebruik beeldanalyse software om de 3D en tijdreeksen gegevens te analyseren. Open de software enfoto&#39;s toe te voegen door ze in de open scherm, dat &quot;Arena&quot; view heet slepen. Dubbelklik op een beeldbestand om het te openen; het beeld zal worden geopend in het kader van &quot;Overtref&quot; view. </li><li> Maak een 2D / 3D-beeld. <ol><li> Vanaf het &quot;Meer&quot; bar te vinden op de rechter bovenhoek, klik op &quot;Bewerken / Show Display Aanpassing&quot; om het venster &#39;Display Adjustment &quot;te openen. Optimaliseren van de fluorescentie-display door aanpassing van de drempels voor elk kanaal, en neem een ​​momentopname om het beeld op te slaan. </li></ol></li><li> Genereer object sporen met behulp van time-lapse beelden. <ol><li> Open het beeld te analyseren onder &quot;Overtref&quot; view. Klik op het icoon met een afbeelding van oranje stippen, gevonden onder de &quot;Surpass&quot; icoon. Dit opent een nieuw venster &quot;Spots&quot; te openen. </li><li> Afvinken &quot;Track vlekken (tijd)&quot; en klik op de blauwe pijl om naar de volgende stap. Selecteer het kanaal met de voorwerpen op te sporen onder &quot;Bron Channel&quot;, en stel de geschatte object Diameter onder &quot;Geschatte XY Diameter&quot; door het intypen van een getal in. Klik op de blauwe pijl om naar de volgende stap. Opmerking: Voor neutrofielen tracking, selecteert u het kanaal met APC fluorescentie voor neutrofielen en zet het object met een diameter tot 12 micrometer gebaseerd op de bekende omvang van neutrofielen. </li><li> In het venster, vinden en selecteren &quot;Quality&quot; filter door te klikken op het pijltje naar beneden. Let op de plekken die door de software en de drempel handmatig aan te passen op te nemen of uit te sluiten vlekken. Zodra drempel is gedefinieerd, klikt u op de blauwe pijl om naar de &quot;Tracking&quot; stap. </li><li> Onder algoritme, vinden en selecteren &quot;Autoregressieve Motion Algorithm&quot; door te klikken op het pijltje naar beneden. Typ 10 micrometer voor &quot;Max Distance&quot; en 3 voor &quot;Max Gap Size&quot; te vinden onder Parameters. Afvinken &quot;Vul gaten met alle gedetecteerde objecten &#39;te beginnen met het bijhouden, en klik op de blauwe pijl om naar de volgende stap. Opmerking: &quot;Autoregressieve beweging algoritme&quot; wordt gebruikt fof voorwerpen die zijn gerichte beweging, omdat het sporen op basis van de voorspelde locatie van de vorige beweging genereert. &quot;Max Distance&quot; en &quot;Max Gap Size&quot; kan worden aangepast, afhankelijk van de verwachte omvang en de snelheid van het object dat wordt gevolgd, evenals de totale duur imago van de time-lapse van. </li><li> Onder Filter Type, selecteer de &quot;Tijdsduur&quot; filter. Klik op de groene pijl om af te volgen, en controleer de sporen die werden gegenereerd. Ga terug naar de vorige stap indien nodig om de tracks handmatig sorteren. </li></ol></li><li> Als de gegenereerde time-lapse afbeelding drifts, juist voor translationeel drift. <ol><li> Klik op het icoon met een afbeelding van een potlood. Dit is een tab editing dat &quot;Tracks bewerken&quot; wordt geopend. Onderzoek imago van de time-lapse en vind een verwijzing plek die niet mogen worden bewegen voor alle opnamen. </li><li> In de linker bovenhoek van het scherm, vind venster &quot;Wijzer&quot; en afvinken &quot;Select&quot; om de cu activerenrsor voor een plek selecteren. Klik op de referentie-plek. </li><li> Klik op &quot;Correct Drift&quot; in het venster &quot;Tracks bewerken&quot;. Afvinken &quot;Translationeel Drift&quot;. De software genereert automatisch de gecorrigeerde reeks beelden. </li></ol></li><li> Meet cellulaire beweging die door het object tracks in time-lapse beelden. <ol><li> Onder het raam &quot;Tracks bewerken&quot;, afvinken &quot;Tracks&quot; en selecteer een track die de beweging van een cel vertegenwoordigt. De geselecteerde track wordt gemarkeerd in het geel imago van de tijdreeksen in. </li><li> Klik op het icoon met een afbeelding van een grafiek om de &quot;Statistieken&quot; window (tab statistiek) te openen. </li><li> Onder &quot;Selection&quot;, selecteer &quot;Track Speed ​​Mean&quot; door te klikken op de pijl omlaag om het genereren van de baan snelheid betekenen voor de geselecteerde track. Kies verschillende tracks en herhaal de stappen voor het meten van het circuit snelheid betekenen voor alle cellen van belang. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zhao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and the control of immunity.</a> Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).</li>
<li>Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+neutrophils%3A+friend+or+foe%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated neutrophils: friend or foe?</a> Carcinogenesis. , (2012).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+tumor-associated+neutrophil+phenotype+by+TGF-beta%3A+%27N1%27+versus+%27N2+TAN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN.</a> Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).</li>
<li>Coffelt, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17-producing+%5Bggr%5D%5Bdgr%5D+T+cells+and+neutrophils+conspire+to+promote+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis.</a> Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).</li>
<li>Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+promotion+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell promotion of metastasis.</a> Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).</li>
<li>Granot, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+entrained+neutrophils+inhibit+seeding+in+the+premetastatic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung.</a> Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).</li>
<li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li>
<li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Imaging windows for long-term intravital imaging.</a> IntraVital. 3 (2), e29917(2014).</li>
<li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. (96), e52476(2015).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Progenitor+Cell+Rolling+in+Bone+Marrow+Microvessels%3A+Parallel+Contributions+by+Endothelial+Selectins+and+Vascular+Cell+Adhesion+Molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+4-Dimensional+Tracking+of+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Adult+Mouse+Calvarial+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow.</a> J. Vis. Exp. (91), e51683(2014).</li>
<li>Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+imaging+reveals+structural+and+functional+heterogeneity+in+different+bone+marrow+compartments%3A+functional+implications+on+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells.</a> Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Balan, M., Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+for+ectopic%2C+chronic%2C+intravital+multiphoton+imaging+of+bone+marrow+vasculature+and+architecture+in+split+femurs%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs.</a> IntraVital. 4 (2), e1066949(2015).</li>
<li>Hansen-Algenstaedt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window--a+new+approach+to+microcirculation+of+living+bone+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ.</a> J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).</li>
<li>Xu, N., Lei, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Neutrophil+Intraluminal+Crawling%2C+Transendothelial+Migration+and+Chemotaxis+in+Tissue+by+Intravital+Video+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (55), e3296(2011).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Bucher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Ly6G+antibodies+determine+macrophage+phagocytosis+of+neutrophils+and+alter+the+retrieval+of+neutrophils+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice.</a> J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), (2013).</li>
<li>Koewler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+Monoclonal+Antibody+Raised+Against+Nerve+Growth+Factor+on+Skeletal+Pain+and+Bone+Healing+After+Fracture+of+the+C57BL%2F6J+Mouse+Femur%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur.</a> J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).</li>
<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+femoral+segmental+defect+model+for+bone+tissue+engineering+using+a+novel+rigid+internal+fixation+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system.</a> J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVacaru%2C+A+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Real-time, seriële beeldvorming van de dynamische cellulaire processen in het beenmerg bevat informatie die anders is een uitdaging voor het verkrijgen van het gebruik van conventionele technieken, zoals histologie en totale bloedbeeld. Het dijbeen WC model hier beschreven biedt unieke mogelijkheden om cellulaire en structurele veranderingen in het beenmerg te onderzoeken in de tijd. Hoewel een femur WC model hiervoor vermeld, ons nieuwe ontwerp dat een grotere imaging gezichtsveld en kleinere totale WC grootte, die mee...

Beenmerg is een belangrijk orgaan betrokken bij hematopoiese en immuun regelgeving. Het bestaat uit een bestanddeel dat hematopoietische stamcellen en hematopoietische progenitorcellen (HSPCs) en een stromale component met niet-hematopoietische stamcellen die aanleiding geven tot mesenchymale cellen 1. Tweederde van hematopoietische activiteit is gewijd aan het genereren van myeloïde cellen 2. Vooral een groot aantal neutrofielen geproduceerd in het beenmerg, met 1-2 x 10 11 cellen per dag gegenereerd in een normaal volwassen mens 2. Neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie tegen microbiële infecties en zijn meestal gereserveerd in het beenmerg tot stress-triggers hun mobilisatie van perifere neutrofielen 1,3 vullen. Naast hun antimicrobiële effecten, suggereren recente studies een belangrijke rol van neutrofielen in kankerbiologie heeft zowel pro- als anti-tumorigene fenotype afhankelijk transforming growthfactor beta (TGF-β) signalering in de tumor micro 4,5. Bovendien hebben onderzoeken aangetoond dat neutrofielen die accumuleren in primaire tumoren uitoefenen pro-tumorigene en metastatische effect van onderdrukken van de cytotoxische functie van T-cellen 6,7, terwijl neutrofielen in omloop oefenen een cytotoxische anti-metastatisch effect 8. Als zodanig onderzoek hematopoietische cellen in het beenmerg, met name neutrofielen, is cruciaal voor het ophelderen van hun rol bij immuun en tumor regelgeving. Histopathologie en volledig perifeer bloedbeeld worden routinematig gebruikt om cellulaire en structurele veranderingen in het beenmerg 9 evalueren. Echter, deze methoden leveren alleen statische informatie van verschillende celpopulaties of weefsel microstructuren. Longitudinale in vivo beeldvorming kan worden gebruikt in combinatie met standaardmethoden om de dynamiek van meerdere cellulaire en vasculaire stromale componenten en beoordeelt cel-Cell interacties in een longitudinale wijze. Intravitale microscopie (IVM), gedefinieerd als beeldvorming van levende dieren bij microscopische resolutie van 10, is met name handig voor de beoordeling van dynamische cellulaire processen in de tijd in hetzelfde monster, vermindering van het aantal proefdieren nodig. IVM wordt vaak gecombineerd met een chronisch getransplanteerde venster kamer (WC) om het betreffende orgaan voor beeldvorming over een periode van weken tot maanden. Cranial en dorsale-huidplooi WC-modellen hebben de langste geschiedenis van gebruik teruggaat tot het midden van de jaren 1990. Meer recent zijn andere orgaanspecifieke WC modellen zoals die van de uiervet pad en verschillende buikorganen ontwikkeld 11. De typische aanpak voor het afbeelden van het beenmerg in vivo heeft voornamelijk bezig blootstelling van het schedeldak van muizen, waarbij de verdunde bot maakt directe visualisatie van afzonderlijke cellen met een minimale chirurgische ingreep 12-14. Echter de calvarial beenmerg be verschillend van die van andere botten, zoals de lange botten, hetgeen blijkt uit een lager aantal HSPCs en hypoxische cellen calvaria, aanduidt, minder onderhoud en de ontwikkeling van HSPCs 15. Daarom zijn alternatieve werkwijzen om de cellulaire componenten in het pijpbeen onderzocht. Deze omvatten directe blootstelling van de femorale beenmerg 16 en buitenbaarmoederlijke transplantatie van split dijbeen in de dorsale huidplooi WC 17. De eerste is een terminal procedure die niet volgen van cellulaire structurele en functionele veranderingen toelaat gedurende langere perioden, en deze waarschijnlijk verstoort normale beenmergfunctie door de transplantatie van dijbeen een ectopische plaats in het dorsale huidplooi WC. Een andere methode die orthotope seriële beeldvorming van femorale beenmerg maakt de tijd is het gebruik van een toilet in het dijbeen. Een vorige verslag aangetoond op lange termijn beeldvorming van de microcirculatie in het dijbeen beenmerg met behulp van eenfemur WC in muizen 18. Bovendien, de auteurs aangetoond visualisatie van tumorcellen in het dijbeen met vermelding van de bruikbaarheid in controle beenmerg metastase. Dit was echter WC ontwerp beperkt door zijn grote omvang (1,2 cm diameter) en relatief kleine opnamegebied (4 mm diameter), die alleen voor grote muizen (26-34 g, 3-6 maanden oud) werd aldus het benadering onpraktisch voor routinegebruik. Derhalve een nieuw toilet met een kleinere totale afmeting en grotere binnendiameter opnamegebied is ontworpen voor het doel van deze studie. Het doel van deze studie was om een ​​werkwijze voor het afbeelden van verschillende celtypes in de femorale beenmerg verschaffen. Het dijbeen WC model werd in eigen huis ontwikkeld en werd gebruikt om neutrofielen te visualiseren en te volgen binnen het 3D-vasculaire netwerk. Met behulp van dit model, kan IVM van het beenmerg in serie worden uitgevoerd over 40 dagen. Deze benadering kan worden toegepast op verschillende gebieden voor het ophelderen van de processen van hematopoiese, immuunregulatie eennd de ontwikkeling van tumoren.

<table><tbody><tr><td>NRCNU-F athymic nude mice</td><td>Taconic</td><td>Ncr nude</td><td>8-10 weken oud, vrouwelijk</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&nbsp;</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch scherm</td><td>Proxima</td><td>DYNJP2405</td><td></td></tr><tr><td>Elektrisch verwarmingskussen</td><td>Life Brand</td><td>57800827375</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>Leica M60</td><td></td></tr><tr><td>Oogzalf (tranengel)</td><td>Novartis&nbsp;</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>7.5% betadine</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>70% isopropyl alcohol</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>10% betadine</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelhandvat (#3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelmestje (#15)</td><td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen springschaar</td><td>Fine science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Baby-Mixter Hemostat</td><td>Fine science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar</td><td>Fine science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Extra fijne Graefe-tang</td><td>Fine science Tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Fine science Tools</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Microboor</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>Microboorkoppen</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-14</td><td></td></tr><tr><td>Femur vensterkamer</td><td>PMCC machine shop</td><td>custom design</td><td>9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (buiten tot binnendiameter), 2.16 mm (radius van twee gaten), 13.9 mm (afstand tussen twee gaten), 0.7 mm (dikte)</td></tr><tr><td>U-vormige balk</td><td>PMCC machine shop</td><td>custom design</td><td>13.8 mm (lengte), 1.6 mm (breedte), 3.7 mm (hoogte)</td></tr><tr><td>Dekglas (8 mm)</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>Bevestigingsring (8 mm)</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC # 31163202</td><td></td></tr><tr><td>Motten (zeshoekige roestvrij staal)</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>Tandheelkundig cement</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>Hechtdraad (5-0 Monosof zwart)</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td></tr><tr><td>Halsey naaldhouder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine (Temgesic)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>DIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Metacam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>Amoxicilline (Clamavox)</td><td>Pfizer</td><td>DIN 02027879</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>Twee-fotonmicroscoop LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>Beeldvormingsfase</td><td>PMCC machine shop</td><td>custom design</td><td>15.9 cm (lengte), 11 cm (breedte), 0.9 cm (hoogte)</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td><td>Beeldanalysesoftware beschreven in sectie 3 van het protocol&nbsp;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>Beeldverwervingssoftware beschreven in sectie 2 van het protocol&nbsp;</td></tr></tbody></table>

dijbeen window chamber model voor<em&gt; in vivo</em&gt; cell tracking in het muizen bone marrow

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Beendermerg is een complex orgaan dat verschillende hematopoëtische en niet-hematopoëtische cellen bevat. Deze cellen zijn betrokken bij vele biologische processen, waaronder hematopoëse, immuunregulatie en tumorregulatie. Veelgebruikte methoden om cellulaire acties in het beenmerg te begrijpen, zoals histologie en bloedtellingen, leveren statische informatie op in plaats van de dynamische actie van meerdere cellulaire componenten in vivo vast te leggen. Om de standaardmethoden aan te vullen, werd een model op basis van een vensterkamer (WC) ontwikkeld om seriële in vivo beeldvorming van cellen en structuren in het muisbeenmerg mogelijk te maken. Dit protocol beschrijft een chirurgische procedure voor het installeren van de WC in het dijbeen om langdurige optische toegang tot het dijbeenmerg mogelijk te maken. Met name om de experimentele bruikbaarheid te demonstreren, werd deze WC-aanpak gebruikt om neutrofielen binnen het vasculaire netwerk van het dijbeen af te beelden en te volgen, waardoor een nieuwe methode werd geboden om immuuncelverkeer en regulatie in het beenmerg te visualiseren en te kwantificeren. Deze methode kan worden toegepast om verschillende biologische processen in het muisbeenmerg te bestuderen, zoals hematopoëse, stamceltransplantatie en immuunresponsen in pathologische omstandigheden, inclusief kanker.

Murine femorale beenmerg succesvol opgeroepen met de WC visualisatie van afzonderlijke neutrofielen en vasculaire netwerken te schakelen. Figuur 1 toont de WC instrument en beschrijft de chirurgische procedure, waarbij blootstelling van de femorale bot en dunner worden van corticaal bot omvat om de optische toegang in het krijgen bot. De operatie wordt goed verdragen bij muizen; ze werden beoordeeld op ongewenste fysieke reacties zoals achterste ledematen zwelling, zonde...

Het protocol beschrijft een nieuw model voor een muis dijbeenraamkamer dat kan worden gebruikt om de beweging van cellen in het beenmerg in vivo te volgen. Intravitale multifotonfluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om drie componenten van het dijbeenmerg (vaatstelsel, collageenmatrix en neutrofielen) in de tijd te beeldvormen.

Dijbeen Window Chamber Model voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Tracking in het Muizen Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van langdurige microscopische beeldvorming en tracking van neutrofielen in vasculaire structuren binnen het muizenbeenmerg via een geïmplanteerde chronische window chamber over het dijbeen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de immunologie en oncologie over de rol van monocyten bij de regulatie van een infectie, tumorigenese en tumormetastasering. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze langdurige microscopische toegang biedt tot het beenmerg van het dijbeen, een centrale plaats van hematopoëse, en dynamische informatie verschaft die anders moeilijk te verkrijgen is met conventionele methoden.Hoewel deze methode specifiek is voor de beeldvorming van neutrofielen binnen een vasculair netwerk, kan deze ook worden gebruikt om andere immuuncelpopulaties van belang te visualiseren. Bevestig op de dag van de operatie het passende sedatieniveau door het gebrek aan respons op een knijpreflex in de teen van een athymische naaktmuis. Plaats de muis vervolgens onder een stereomicroscoop op een elektrische warmtemat, afgedekt met een steriele operatiedoek.Breng vervolgens zalf aan in de ogen van het dier en steriliseer het operatiegebied door het tweemaal opeenvolgend af te vegen met 7,5% povidone-jodium, 70% isopropylalcohol en 10% povidone-jodium. Wanneer het dier is voorbereid, wordt met een scalpel met een blad nummer 15 een longitudinale huidincisie van 10 millimeter gemaakt richting het femur vanaf de laterale zijde. Voer vervolgens een botte dissectie uit met pincetten en hemostaten om het femur tussen de flexor- en extensorspieren bloot te leggen.Wanneer het dijbeen zichtbaar is, plaatst u een U-vormige staaf onder het bot en installeert u de window chamber. Bevestig de staaf aan het venster met twee moeren. Draai de moeren vervolgens vast met een pincet.Gebruik de pincet om de musculatuur van de flexoren en extensoren terug te plaatsen op hun oorspronkelijke posities. Vul de ruimte tussen het bot en de window chamber met tandcement om de window chamber te fixeren. Gebruik vervolgens een microboor om een gebied van zes bij twee millimeter in het corticale bot weg te slijpen om optische toegang tot de mergholte te verkrijgen.Zodra een bijna transparante periostale laag van het bot is verkregen, wordt er een dekglas van acht millimeter op het venster geplaatst en wordt een klemring gebruikt om het dekglas op zijn plaats te fixeren. Sluit vervolgens de dermis met een 5-0 hechtdraad en een naaldhouder. Plaats de muis daarna in een nieuwe kooi met schoon strooisel en monitor het dier totdat het volledig is hersteld.Om gecombineerde multifoton- en confocale microscopiebeelden via de window chamber te verkrijgen, injecteer dan eerst de geschikte fluorescerende labelingsoplossingen voor neutrofielen in de vasculatuur van de muis via de staartvene. Klem de uiteinden van de window chamber met krokodillenklemmen om de muis aan de op maat gemaakte objecttafel te bevestigen. Plaats vervolgens de beeldvormingstafel op de gecombineerde multifoton- en confocale microscoop.Zodra de muis is gefixeerd, schakelt u de tweefotonenlaser en het confocale systeem in en klikt u op Start System om de software voor beeldacquisitie te starten. Klik onder het tabblad Acquisition op Smart Setup om de beeldvormingskanalen in te stellen en selecteer de lasers voor de beeldvorming. Kies Best signal en klik op Apply.Voeg handmatig het acquisitiekanaal voor second harmonic generation toe door de tweefotonenlaser in het Laser-venster in te schakelen en de juiste acquisitiegolflengten voor second harmonic generation in te stellen. Klik onder het tabblad Locate op Oculars online en lokaliseer het interessegebied via de microscoop door visuele inspectie. Klik op Oculars offline en open het tabblad Acquisition.Selecteer in het venster Kanalen het FITC-spoor en klik op Live om het FITC-Dextran-beeld met een 5x objectief voor te bekijken. Pas de focus indien nodig aan. Klik vervolgens op Stop onder het tabblad Acquisitie om het voorbeeld te stoppen.Select nu handmatig het 20x water-objectief en bekijk de FITC-Dextran afbeelding opnieuw, waarbij de master Gain en Pinhole in het venster Channels worden aangepast om het beste signaal en contrast te verkrijgen. Wanneer een optimale afbeelding voor alle drie de kanalen is verkregen, selecteert u alle kanalen in het venster Channels en klikt u op Snap onder het tabblad Acquisition om een 2D-snapshot te maken. Selecteer vervolgens Time Series om het venster Time Series te openen en voer nul in voor de intervallen en 40 voor het totaal aantal scans om 40 afbeeldingen continu en zonder tijdsinterval te verkrijgen voor een 2D-time-lapse afbeelding.Om de beelden te analyseren, opent u de juiste software voor beeldanalyse en opent u een beeldbestand. Om objecttracks te genereren met behulp van de time-lapse beelden, opent u in de Surpass-weergave het te analyseren beeld en klikt u op het icoon met de afbeelding van oranje stippen om het nieuwe Spots-venster te openen. Nadat de trackingparameters zijn ingesteld, vinkt u het vakje Fill gaps with all detected objects aan om de tracking te starten.Klik vervolgens op de blauwe pijl om naar de volgende stap te gaan. Selecteer onder Filter Type het filter Track Duration en klik op de groene pijl om het tracken te voltooien. Controleer daarna de gegenereerde tracks en keer indien nodig terug naar de vorige stap.Om de cellulaire beweging te meten, gedefinieerd door de Object tracks in de time-lapse beelden, selecteert u in het venster Edit Tracks het vakje Tracks en kiest u een track die overeenkomt met de beweging van de betreffende cel. De geselecteerde track wordt geel gemarkeerd in het tijdseriebeeld. Klik slutere, onder het tabblad Statistics, op het pictogram met de afbeelding van een grafiek om het venster Statistics te openen.Klik vervolgens onder Selectie op de pijl naar beneden om de Track Speed Mean te genereren. Vasculatuur binnen het beenmerg kan worden gevisualiseerd met intravasculaire kleurstoffen, zoals FITC-Dextran. Omdat het contrast afhankelijk is van de injectie van de kleurstof, representeert de verkregen afbeelding de functionele vasculatuur waar sprake is van voldoende bloedstroom.Deze beelden van hetzelfde gebied van het beenmerg op verschillende tijdstippen tonen de aanwezigheid van neutrofielen in zowel de intravasculaire als extravasculaire ruimtes over een periode van meerdere dagen. De beeldvorming van dit corticale bot, dat hoofdzakelijk uit collageenvezels bestaat, werd uitgevoerd via second harmonic generation, wat de infiltratie van het vasculaire weefsel door neutrofielen verder illustreert. Deze neutrofielen werden gevolgd in de vasculaire niche van het beenmerg zonder aanvullende tijdsintervallen tussen elke scan, waardoor hun beweging nauwkeurig kon worden gevolgd.De snelheid van de door de beeldanalyse-software gegenereerde tracks kan vervolgens worden gemeten om de snelheid van elke cel te analyseren. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals het gebruik van ex vivo gelabelde cellen of transgene reportermuizen, worden ingezet om andere biologische processen in situ te evalueren, zoals de invloed van immuuncellen op tumorprogressie en metastase. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe een window chamber op het femurale bot van een muis moet worden geïnstalleerd om neutrofielen door de vasculaire niche van het beenmerg en collageenstructuren te volgen.

femur-window-chamber-model-for-vivo-cell-tracking-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit protocol beschrijft een procedure voor seriële bemonstering van femur beenmerg (BM) zonder dat muizen hiervoor worden geofferd. Deze procedure vergemakkelijkt longitudinale studies van de samenstelling van beenmerg van muizen in de loop van de tijd en biedt seriële toegang tot cellen binnen het beenmerg voor ex vivo en transplantatiestudies.

Femorale beenmergaspiratie in levende muizen

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Monocyten zijn belangrijke regulatoren van aangeboren immuniteit en spelen een cruciale rol bij de vernieuwing van het perifere mononucleaire fagocytische systeem en in geval van ontsteking. Dit manuscript beschrijft de procedure van realtime beeldvorming van het muiscalvaria beenmerg om het mechanisme van monocytmobilisatie te bestuderen.

Tracking muisbeenmerg Monocyten<em&gt; In Vivo</em

Er wordt een strategie gepresenteerd om histologisch data in het beenmerg kwantitatief te analyseren. Confocale microscopie van fluorescent gelabelde cellen in weefselsecties resulteert in 2-dimensionale beelden, die automatisch worden geanalyseerd. Co-lokalisatieanalyses van verschillende celtypen worden vergeleken met gegevens van gesimuleerde beelden, waardoor kwantitatieve informatie over cellulaire interacties wordt verkregen.

Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Een methode om verschillende gehumaniseerde beenmergnissen in muizen te creëren en te leven, wordt gepresenteerd. Op basis van de ondersteunende niche die door menselijke mesenchymale cellen is gecreëerd, induceert de toevoeging van menselijke endotheelcellen de vorming van menselijke vaten, terwijl de toevoeging van rhBMP-2 de vorming van chimerisch volwassen weefsel van humane muizen veroorzaakt.

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Hier presenteren we een protocol om de ultrastructuur van de megakaryocyten in situ te analyseren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Murine beenmerg wordt verzameld, gefixeerd, ingebed in epoxyhars en gesneden in ultradunne secties. Na contrastkleuring wordt het beenmerg waargenomen onder een TEM-microscoop bij 120 kV.

In situ Exploratie van Murine Megakaryopoiesis met behulp van Transmissie ElektronenMicroscopie

We beschrijven hier de methode voor het afbeelden van megakaryocyten en proplatelets in het merg van het schedelbot van levende muizen met behulp van twee-fotonenmicroscopie.

In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg

Intravitale microscopie maakt het mogelijk om dynamische biologische processen zoals weefselregeneratie en tumorontwikkeling te bestuderen. Het calvariale beenmerg, een zeer dynamisch weefsel, biedt inzicht in hematopoëse en vasculaire functie. Het gebruik van een biocompatibel 3D-geprint hoofdfixatie-implantaat maakt repetitieve longitudinale beeldvorming mogelijk, waardoor ons begrip van weefseldynamiek en de micro-omgeving van de tumor wordt verbeterd.

Intravitale longitudinale beeldvorming van vasculaire dynamiek in het calvariale beenmerg

Het beenmergletselmodel bij muizen is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van postnatale osteogenese door middel van intramembraneuze ossificatie. Dit vereenvoudigde chirurgische protocol beschrijft de beenmergablatieprocedure voor stroomafwaartse beoordeling van nieuwe botvorming en cellulaire reacties na verwonding.

Verbeterde methodologie voor het bestuderen van postnatale osteogenese via intramembraneuze ossificatie in een beenmergletselmodel bij muizen

Leer het dijbeen window chamber model voor in vivo celtracking in muizenbotmerg. Deze methode maakt langdurige beeldvorming van neutrofielen mogelijk met intravitaal multiphoton microscopie.

Dijbeen Window Chamber Model voor

Meer video's verkennen