Name: Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door Coxiella burnetii Tijdens siRNA Silencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Leer hoe siRNA-gen-silencing en FRET-reporterassays worden gebruikt om effector-translocatie-efficiëntie te meten bij Coxiella burnetii-infectie. Deze methode onthult gastheer-pathogeen-interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 en 1063646) toegekend aan HJN. EAL wordt ondersteund door een Australian Postgraduate Award.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Secretiesystemen, en de bacteriële effector eiwitten deze transportsystemen in het cytoplasma van gastheercellen, zijn een belangrijke virulentie onderdeel dat vele pathogene bacteriën gebruiken om een ​​infectie in unieke replicatieve niches stellen. De focus van veel onderzoeksgroepen is om de interactie tussen bacteriële effectoren en gastheer- en de invloed van deze effectoren hebben voor talrijke cellulaire routes onderzocht. Zeer weinig onderzoek, eventueel, de mogelijkheid van gastheereiwitten noodzakelijk is voo...

Coxiella burnetii is een unieke intracellulaire ziekteverwekker die de zoönotische menselijke besmetting Q-koorts veroorzaakt. Deze ziekte wordt geassocieerd met een breed spectrum van klinische presentaties uitstrekt van asymptomatische seroconversie tot levensbedreigende chronische infectie die vaak manifesteert als endocarditis jaar na blootstelling 1. Menselijke besmetting ontstaat voornamelijk door inhalatie van gecontamineerde aërosolen met herkauwers grote reservoir van infectie, in het bijzonder melkkoeien, schapen en geiten. Hoewel Coxiella-infectie bij deze dieren is meestal subklinische, kan de infectie leiden tot abortus en de aanzienlijke bacteriële belasting in het geboorteproces vloeistof en placenta kan de lokale omgeving 1 besmetten. Een voorbeeld van de enorme last dergelijke vervuiling kan hebben op zowel de volksgezondheid en de landbouwindustrie onlangs waargenomen in de Q-koorts die zich in Nederland 2. Tussen 2007 en2010, meer dan 4.000 menselijke gevallen van Q-koorts werden gediagnosticeerd en deze uitbraak was gekoppeld aan significante besmetting van geitenhouderijen 3. Bovendien, Coxiella een potentieel biologisch wapen, zoals geclassificeerd door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention, vanwege de milieustabiliteit van de bacteriën en lage infectieuze dosis nodig ernstige morbiditeit en mortaliteit 4 veroorzaken. Coxiella bestaat in twee fasen: Fase I organismen, geïsoleerd uit natuurlijke bronnen, zijn zeer virulent en Fase II organismen sterk verzwakt in vivo. Bijvoorbeeld, na een aantal overzettingen in vitro van Coxiella burnetii Nine Mile organismen Fase I, Fase II bacteriën werden geleverd dat een onomkeerbare chromosomale deletie bevatten waardoor afgeknotte lipopolysaccharide (LPS) 5. Deze stam C. burnetii NMII, fenotypisch vergelijkbaar met Fase I in weefselkweek modellen en zorgt voor een veiligere modusl voor onderzoekers om Coxiella pathogenese in laboratoria 5 bestuderen. De laatste jaren hebben verscheidene doorbraken snel gevorderd het gebied van Coxiella genetica. Het meest opvallend is de ontwikkeling van axenische media (aangezuurd citraat cysteine ​​midden - ACCM-2) heeft het celvrije groei van Coxiella toegestaan ​​in zowel vloeibare en vaste media 6,7. Dit resulteerde in de directe verbetering van genetische hulpmiddelen beschikbaar voor Coxiella waaronder een induceerbare genexpressie systeem, shuttle vectoren en willekeurig transposon systemen 8-11. Meest recent, twee methoden voor doelgerichte geninactivatie zijn ook ontwikkeld, die de weg vrijmaakt voor de behandeling van specifieke virulentie-gen kandidaten 12. Na internalisatie door alveolaire macrofagen, Coxiella gerepliceerd naar grote aantallen binnen een membraangebonden compartiment aangeduid als de Coxiella- met vacuole (CCV). Het CCV vereist gastheer endocytische mensenhandel thruwe vroege en late endosomen, totdat het rijpt in een lysosoom afgeleide organel 13. Gedurende dit proces, verkrijgt het CCV gastheer factoren die ofwel verschijnen tijdelijk of verbonden blijven met de vacuole, waaronder, maar niet beperkt tot, Rab5, Rab7, CD63 en LAMP-13-15 januari. Replicatie van Coxiella binnen gastheercellen is volledig afhankelijk van een volledig functionele Dot / Icm Type IVB Afscheiding System (T4SS) 8,16,17. Dit afscheidingssysteem is een multi-eiwitstructuur ancestrally betrekking conjugatie systemen en omvat zowel bacteriële als vacuolaire membranen bacteriële eiwitten leveren, genaamd effectoren, in de gastheercel cytoplasma 18. De Coxiella T4SS functioneel vergelijkbaar met de goed gekarakteriseerde Type IVB Dot / Icm afscheidingssysteem van Legionella pneumophila 19,20. Interessant is dat activering van de T4SS en daaropvolgende translocatie effector pas optreedt Coxiella de zure lysosoom afgeleide bereiktorganel, ongeveer 8 uur na infectie 17,21. Tot op heden hebben meer dan 130 Dot / Icm effectoren geïdentificeerd 9,17,22-24. Veel van deze effectoren waarschijnlijk een belangrijke rol spelen tijdens de replicatie van Coxiella binnen gastheercellen; Echter, slechts een paar effectoren zijn functioneel gekarakteriseerd 25-29. In dit onderzoek gebruiken we een fluorescentie gebaseerde translocatie assay die is gebaseerd op splitsing van de CCF2-AM FRET substraat (hierna het BLAM substraat) via β-lactamase activiteit in de gastheercel cytoplasma (Figuur 1). Het gen van belang wordt gefuseerd aan TEM-1 β-lactamase (BLAM) op een reporterplasmide die constitutieve expressie verschaft. De BLAM substraat bestaat uit twee fluoroforen (coumarine en fluoresceïne), die een FRET-paar vormen. Excitatie van de cumarine in FRET resultaten van het fluoresceïne en groene fluorescentie-emissie in afwezigheid van effector translokatie; Indien de BlaM-effector-eiwit translocatie in de gastheer cytoplasma, de resulterende β-lactamase activiteit splitst de β-lactam ring van het BLAM substraat, het scheiden van het FRET paar producerende blauwe fluorescentie-emissie na excitatie. Deze translocatie assay is bewezen als een benadering van effector eiwitten te identificeren van een reeks verschillende intracellulaire en extracellulaire bacteriën, waaronder C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropathogene E. coli, Salmonella en Brucella 17,30-35. Om de rol van specifieke host factoren op Coxiella effector translocatie bepalen we gebruik van een bekende methode voor het gene silencing bekend als RNA-interferentie, in het bijzonder kleine interfererende RNA (siRNA). Oorspronkelijk geïdentificeerd in Caenorhabditis elegans, RNA-interferentie is een geconserveerd endogeen cellulair proces dat wordt gebruikt voor het aangeboren defense tegen virussen en genregulatie 36,37. Na binding van sequentie-specifieke siRNA, afbraak van mRNA vindt plaats via RISC (RNA-geïnduceerd silencing complex) waardoor specifiek gen silencing of 38 knockdown. In deze studie werd gebruikt siRNA targeten twee gastheereiwitten, Rab5A en Rab7A, die belangrijke regulatoren van de endocytische route zijn. De impact van zwijgen Rab5A en Rab7A op effector translocatie werd vastgesteld met behulp van C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 werd geselecteerd als zij eerder werd aangetoond dat getransloceerd door de Dot / Icm secretie systeem van Coxiella 17. Gebruik makend van beide siRNA gene silencing en de fluorescencebased translocatie test hier beschreven, beginnen we een rol voor host factoren te vestigen in de translocatie van effector eiwitten door Coxiella. Deze benadering kan worden toegepast op een breed scala aan zowel intracellulaire als extracellulaire bacteriën die vergelijkbaar secretio bezittenn systemen verantwoordelijk voor de translocatie van effector eiwitten.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Sigma</td><td>60218</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Iron sulfate</td><td>Fisher</td><td>S93248</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>C6852</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Bacto-neopeptone</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Fisher</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Methyl beta cyclodextrin</td><td>Sigma</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Voor bacteriecultuur</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td>Non-targeting control</td></tr><tr><td>siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-003290-01-005</td><td>Veroorzaakt celdood; maatstaf voor transfectie-efficiëntie</td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA buffer</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Gebruik steriele RNase-vrije water om 5x siRNA buffer te verdunnen tot 1x siRNA buffer</td></tr><tr><td>DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>Voor transfectie</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>Reduced-serum medium gebruikt voor transfectie</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>Voor celcultuur en infectie</td></tr><tr><td>Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Kan alternatief equivalent product gebruiken</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Voor opslag van Coxiella-stam</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin + EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>Voor verdunning van monsters en standaarden voor qPCR</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>Kan alternatief equivalent product gebruiken om gDNA te extraheren</td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>Kan alternatief equivalent qPCR mastermix product gebruiken voor qPCR reactie</td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM</td><td>Invitrogen</td><td>K1032</td><td>Voor meting van translocatie met behulp van fluorescentie en generatie van de 6X laadoplossing (bevat oplossing A, B, C en DMSO)</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Merck</td><td>106469</td><td>Probenicid-oplossingscomponent</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td>Probenicid-oplossingscomponent</td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen orthophosphate</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>Probenicid-oplossingscomponent</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>Probenicid-oplossingscomponent</td></tr><tr><td>DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62251</td><td>Kernkleurstof om celviabiliteit te bepalen. Gebruik 1:4000 verdund in PBS.&nbsp;</td></tr><tr><td>4% PFA (paraformaldehyde) oplossing in PBS</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Fixeeroplossing voor HeLa 229 cellen</td></tr><tr><td>25 cm2 weefselcultuurflacon met ontluchtingsdop</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Voor groei van bacteriestam</td></tr><tr><td>96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individueel verpakt, met Deksel, Sterieel</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 weefselcultuurflacon met ontluchtingsdop</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Voor groei van HeLa 229 cellen</td></tr><tr><td>175 cm2 weefselcultuurflacon met ontluchtingsdop</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>Voor groei van HeLa 229 cellen</td></tr><tr><td>Haemocytometer</td><td></td><td></td><td>Voor kwantificering van HeLa 229 cellen</td></tr><tr><td>Tear-A-Way 96 Well PCR plates</td><td>4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td>Voor qPCR reactie</td></tr><tr><td>8-Lid chain, flat</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>Voor qPCR reactie</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bench top microfuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bench top vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitale mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Voor pelleting van bacteriecultuur</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td>Voor gDNA kwantificering</td></tr><tr><td>Mx3005P QPCR-machine</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>Voor kwantificering van Coxiella-genomen in 7 dagen cultuur</td></tr><tr><td>ClarioSTAR microplate reader</td><td>BMG LabTech</td><td></td><td>Voor meting van fluorescentie</td></tr></tbody></table>

aanbrengen fluorescence resonance energy transfer (fret) naar effector translocatie efficiency onderzoek door<em&gt; coxiella burnetii</em&gt; tijdens sirna silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, de verwekker van Q-koorts is een intracellulair pathogeen die is gebaseerd op een Type IV Dot / Icm secretiesysteem een replicatieve niche richten. Een cohort van effectoren van translocatie via dit systeem in de gastheercel gastheerprocessen manipuleren en kan de instelling van een uniek lysosoom afgeleide vacuole voor replicatie. De hier gepresenteerde methode omvat de combinatie van twee goed gevestigde technieken: specifiek gen silencing middels siRNA en meting van effector translocatie gebruik van een op FRET gebaseerde substraat dat is gebaseerd op β-lactamase-activiteit. De toepassing van deze twee benaderingen, kunnen we beginnen met de rol van gastheerfactoren in bacteriële secretie systeem functioneren en effector translocatie begrijpen. In deze studie onderzoeken we de rol van Rab5A en Rab7A, beide belangrijke regulatoren van de endocytische mensenhandel route. We tonen aan dat silencing de uitdrukking van eiwit resulteert in een afname van effector translocation efficiency. Deze werkwijzen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere intracellulaire en extracellulaire pathogenen die ook secretie systemen gebruiken onderzoeken. Op deze wijze kan een globaal beeld van gastheerfactoren betrokken in bacteriële translocatie effector geopenbaard.

Voor deze studie, de C. burnetii pBlaM CBU0077-stam werd geselecteerd als CBU0077 Eerder is aangetoond een translocatie effector van Coxiella Dot / Icm secretiesysteem 17 zijn. Vóór infectie, het totale aantal genomen / ml in de zeven dagen C. burnetii pBlaM-CBU0077 kweek werd geteld middels qPCR. Figuur 4 toont een voorbeeld van de cyclus drempelwaarde (Ct) waarden verwacht beide standaarden en monsters na qPCR. De Ct-waarden (grafi...

Onderzoek naar de interactie tussen bacteriële pathogenen en hun gastheren is een belangrijk gebied van biologisch onderzoek. Hier beschrijven we de noodzakelijke technieken om effector translocatie door Coxiella burnetii tijdens siRNA gene silencing behulp blam substraat te meten.

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Tijdens siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de impact van specifieke gastheerprocessen te onderzoeken op het vermogen van bacteriële pathogenen om effectoreiwitten te transloceren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de cellulaire microbiologie. In het bijzonder hoe de gastheer betrokken is bij het blokkeren of bevorderen van de levering van bacteriële virulentie-effectoren in de gastheercel.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het twee gevestigde methoden combineert: siRNA-gen-silencing en een reporter-assay om de translocatie van bacteriële eiwitten te meten. Dit dient om de interactie tussen pathogenen en de eukaryote cel te onderzoeken.Deze methode biedt inzicht in de pathogenese van Coxiella en kan ook worden toegepast om de interacties tussen gastheer en pathogeen van andere bacteriën te onderzoeken die afhankelijk zijn van een efficiënte eiwittranslocatie. Voorbeelden hiervan zijn Chlamydia, Salmonella en adhesief-invasieve E.coli. Na het kweken van C.burnetii die CBU0077 tot expressie brengt, wordt de betalactamase gefuseerd volgens het tekstprotocol in een kweekfles van 25 centimeter vierkant met een geven

applying-fluorescence-resonance-energy-transfer-fret-to-examine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Shi, J., et al. Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates a co-infiltration assay for identifying pathogen effector proteins that suppress RNA silencing in Nicotiana benthamiana 16c. A fluorescent reporter and a candidate effector gene are delivered into plant leaves via Agrobacterium. Normally, RNA silencing degrades reporter transcripts, reducing fluorescence. Suppressor effectors...

Co-Infiltration Assay for Screening Pathogen Effectors that Suppress Plant RNA Silencing

Hier beschrijven we een methode om endoplasmatisch reticulum-geassocieerde mRNA in zoogdiercellen visualiseren weefselcultuurcellen. Deze techniek omvat het selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan met digitonine verwijderen cytoplasmatische inhoud gevolgd door...

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA&#39;s in zoogdiercellen

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Effectortranslocatie naar gastcellen via een type III secretiesysteem is een veelvoorkomende virulentiestrategie bij gramnegatieve bacteriën. Een op beta-lactamase gebaseerde effectorfusie-assay voor kwantitatieve analyse van translocatie werd toegepast. In Yersinia geïnfecteerde cellen wordt de conversie van een FRET-reporter door de beta-lactamase gemonitord met behulp van laserscanemicroscopie.

Analyse van<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Dit protocol toont het gebruik van de nabijheidsligatietest om te sonde voor eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans kiembaan.

In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

Single molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) is een methode om niveaus en lokalisatie van specifieke RNA's op het niveau van één cel nauwkeurig te kwantificeren. Hier rapporteren we onze gevalideerde laboratoriumprotocollen voor natte-bench verwerking, beeldvorming en beeldanalyse voor eencellige kwantificering van specifieke RNA's.

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Single molecule fluorescentie energieoverdracht is een methode die de tRNA-dynamiek volgt tijdens ribosomale eiwitsynthese. Door individuele ribosomen te volgen, worden inhomogene populaties geïdentificeerd, die licht werpen op mechanismen. Deze methode kan worden gebruikt om biologische conformatieveranderingen in het algemeen te volgen om dynamisch-functierelaties in vele andere complexe biosystemen te onthullen. Single molecule-methoden kunnen niet-snelheidsbeperkende stappen en laagbevolkte...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Dit artikel beschrijft de tweekleurige labeling van lange RNA's op termini-posities en hun oppervlakte-immobilisatie via inkapseling in fosfolipideblaasjes voor FRET TIRF-microscopietoepassingen met één molecuul. De combinatie van deze technieken maakt nauwkeurige visualisatie en analyse van de RNA-dynamiek op het niveau van één molecuul mogelijk.

Fluorescerende eindlabeling en inkapseling van lange RNA's voor FRET-TIRF-microscopie met één molecuul

Leer hoe siRNA-gen-silencing en FRET-reporterassays worden gebruikt om effector-translocatie-efficiëntie te meten bij Coxiella burnetii-infectie. Deze methode onthult gastheer-pathogeen-interacties.

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door Coxiella burnetii Tijdens siRNA Silencing (Video) | JoVE Journal

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door

Meer video's verkennen