Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Het algemene doel van de seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie techniek is om mitochondriale morfologie, structuur, distributie, volume en aantal te analyseren in een gedefinieerd gebied van de muizenhersenen. Deze methode kan helpen om veel belangrijke vragen in de neurobiologie te beantwoorden, zoals of veranderingen in de structuur, het aantal en de verdeling van de mitochondriën in de hersenen een substantiële bijdrage leveren aan neurodegeneratieve en neurodevelopmentele stoornissen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het het proces van beeldvorming van seriële secties automatiseert door een aangepaste ultramicrotoom in te bouwen in de lage vacuüm-scannende elektronenmicroscoopkamer.

Om het experiment te beginnen, was de eerder bereide glutaraldehyde-gefixeerde weefsels drie keer gedurende vijf minuten in 0,1 molair cacodylaatbuffer. Post-fixeer de weefsels met 1 milliliter cacodylaat-gebufferd 0,1% tanninezuur gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na post-fixatie, was de weefsels in cacodylaatbuffer.

Los 0,3 gram kaliumferrocyanide en 0,86 gram natriumcacodylaat op in 10 milliliter gedistilleerd water. Voeg net voor gebruik 10 milliliter 4% osmiumtetraoxide toe en bekleur de weefsels met 2% osmiumferrocyanideoplossing gedurende 90 minuten op ijs. Na het kleuren, was het weefsel in gedistilleerd water.

Behandel de monsters met vers bereide 1% thiocarbohydrazide of TCH-oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de monsters. Vervolgens kleuren de weefsels met 2% waterig osmiumtetraoxide gedurende een uur.

Na het kleuren, was de weefsels met gedistilleerd water. Incubeer de monsters een nacht in 1% uranylacetaan in gedistilleerd water bij 4 graden Celsius. De volgende dag, spoel de weefsels in gedistilleerd water en incubeer ze met Welton's loodaspartaatkleurstof in een oven.

Het verkrijgen van de best mogelijke kleuring van weefsels is cruciaal voor beeldvorming, aangezien slechte kleuring resulteert in een ladingsfenomeen op het monster dat beeldvorming moeilijk of onmogelijk maakt. Was het weefsel in gedistilleerd water. Dehydrateer de monsters door een gegradueerde reeks alcohol met gekoelde oplossingen van ethanol gedurende vijf minuten elk, gevolgd door een 100% ethanol-dehydratie gedurende drie keer 10 minuten elk.

Was de monsters twee keer gedurende 15 minuten elk in propyleenoxide. Plaats de weefsels in een 1:1 mengsel van inbeddingshars en propyleenoxide, sluit de fles af en incubeer de weefsels een nacht. Open de fles na twee uur zodat het propyleenoxide gedurende de negen uur periode kan verdampen.

Breng de weefsels over naar 100% verse inbeddingshars in schone flessen gedurende twee uur. Bed de monsters in verse inbeddingshars in platte mallen met bedrukte papieren etiketten en laat ze uitharden in een oven. Controleer na een uur de weefselplaatsing en uitlijning en pas indien nodig aan.

Trim de monsters tot het gebied van belang en bevestig ze op een aluminium pin met behulp van gelling cyanoacrylaat superlijm. Bekleed vervolgens het monster met colloïdaal zilverpasta rond de zijden van de blok om een geleidende pad naar de aluminium pin te bieden. Onderzoek de weefselmonsters met behulp van een scannende elektronenmicroscoopsysteem uitgerust met een ultramicrotoom-trap in de kamer en een laag kilovolt terugverstrooid elektronendetector.

Maak beelden van de monsters met deze instellingen. Begin de analyse door Image, Type te selecteren, vervolgens 8-bit om de afbeeldingen om te zetten naar 8-bit TIFF-formaat vanuit het oorspronkelijke 16-bits eigendom. Als automatische contrast- en/of helderheidsomzetting tijdens deze stap niet ideaal is voor afbeeldingen, open dan de 16-bits afbeeldingen opnieuw en druk op Image, Adjust, Brightness/Contrast.

Selecteer een bereik dat voor alle afbeeldingen werkt en druk op Apply. Voer vervolgens de conversie uit. Als er onaanvaardbare beeldbeweging tussen plakjes was, lijn de beeldstacks uit door Plugins, Registration en Linear Stack Alignment with SIFT te selecteren en stel de uitlijning in voor translatie-alleen modus in plaats van stijve lichamen.

Vergroot de canvasgrootte voorafgaand aan registratie door Image, Adjust, Canvas Size te selecteren. Of verminder de afbeelding tot een gebied van belang door het gewenste gebied te selecteren en vervolgens bij te snijden. Indien nodig, schaal de afbeeldingen naar een kleinere, beter beheersbare grootte met ImageJ, vervolgens Image en Scale te selecteren.

Confocale microscopie op neuronale culturen met lage dichtheid toonde aan dat mitochondriën die zich in neuronale soma bevinden een reticulair netwerk vormen, terwijl die zich in distale neurites een discrete langwerpige morfologie vertonen. Met behulp van de seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie of SBFSEM-techniek, werden mitochondriën, dendrieten en axonvaricosities duidelijk waargenomen in de muizenhersenen. Drie dagen reconstructies van mitochondriën in de neurites van muizenhersenweefsel toonden een verschil in grootte tussen dendritische en axonale mitochondriën.

Gegevens uit een representatieve 2-D SBFSEM-afbeelding onthulden dat het volume of de grootte van mitochondriën die zich binnen de neuronale presynapses bevinden, significant kleiner was dan die zich in de extrasynaptische regio bevinden. De afbeeldingen verkregen door SBFSEM-analyse bieden verhoogde resolutie om de ultrastructurele kenmerken van individuele mitochondriën te visualiseren. Het is mogelijk om het cellulaire compartiment van mitochondriën te classificeren door de nabijheid ervan te bepalen tot gemakkelijk identificeerbare structuren zoals niet-synaptische somatische mitochondriën en presynaptische mitochondriën.

Deze techniek kan in ongeveer zeven dagen worden uitgevoerd, waaronder drie dagen voor kleuring, twee dagen voor harsuitharding, één dag voor beeldvorming om een stack te produceren die geschikt is voor deze analyse, en ongeveer twee tot vier uur voor beeldnabewerking ter voorbereiding op de analyse. Deze procedure kan ook worden gebruikt in combinatie met andere methoden voor het beeldvormen van mitochondriën, zoals live beeldvorming met genetisch gelabelde mitochondriën om vragen over mitochondriale trafficking en