Name: Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Leer mitochondriënmorfologie analyseren in muizenhersenen met serial block-face scanning electron microscopy. Deze methode biedt 3D-reconstructie van mitochondriën voor onderzoek naar neurodegeneratieve aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Sidney Walker voor de technische hulp. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie van het National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Ethiek Verklaring: Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op Virginia Tech. Let op: Extreme voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het hanteren en afvoeren verschillende onderdelen gebruikt in dit protocol. Voor gebruik moet de lokale institutionele richtlijnen en praktijken gezondheid en veiligheid worden opgesteld en in acht name van osmiumtetroxide dat vluchtig en zeer giftige, uranyl acetaat, die zowel een zwaar metaal en radioactieve bron en loodnitraat, wat een heavy metal gif. Thiocarbohydrazide (TCH) kan ontbinden explosieve en giftige gassen produceren, verkeerde behandeling. Veel instellingen zullen een EM kernfaciliteit waarin deze reagentia routinematig worden gebruikt en kan hulp te bieden hebben. 1. Voorbereiding van het hersenweefsel en SBFSEM Imaging <ol><li> Verdoven jonge (~ 2-4 maanden oud) C57 zwarte muizen (C57BL / 6J-stam) gebruikt 4-5% isoflurane volgens de institutionele richtlijnen. Bevestig verdoving door het volgen van het verlies van spiertonus, gebrek aan vrijwillige bewegingen en reacties op aversieve stimuli als een staart knijpen. </li><li> Speld de muis op een dissectie lade en zorg een incisie op de huid langs de ventrale middellijn. Verdere incisies in de huid op de borstkas van de muis bloot. Incise het middenrif, en zorgvuldig ontleden uit de borstholte langs de periferie naar het kloppend hart bloot te leggen, en maak dan een incisie aan de rechter atrium. </li><li> Met behulp van een vlinder canule canule de linker ventrikel. Perfuseren de muis transcardially behulp 10-20 ml fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) pH 7,2, tot leegbloeden wordt bevestigd door een verandering in de kleur van de lever. Opmerking: Een verandering in de kleur van de lever wordt gebruikt als een leidraad voor het bepalen van de omvang van de verbloeding. Bevestigen dat de lever kleur verandert van roodachtig bruin tot lichtroze. </li><li> Perfuseren de muis transcardially behulp 10-20 ml 2% glutaraldehyde en 4% paraformaldehyde in 0,10 M cacodylaatbuffer (pH 7,2), aan het hersenweefsel snel oplossen van binnenuit. Fixatie wordt bewaakt door het observeren van de staart verstijving. Opmerking: Bereid 0,10 M cacodylaatbuffer (pH 7,2) door het oplossen van 2,14 g natriumcacodylaat in 80 ml water, voeg zoutzuur om de pH en maken het volume op 100 ml met water. </li><li> Na perfusie onthoofden de muis, ontleden de hersenen, gevolgd door fixatie in 0,10 M natriumcacodylaat (pH 7,2) bevattende 2% glutaaraldehyde en 4% paraformaldehyde gedurende 48 uur bij 4 ° C </li><li> Na 48 uur laten 400 urn coronale secties met behulp van een vibratoom en vervolgens voorzichtig ontleden het gebied van belang in de hersenen (bijvoorbeeld de hippocampus) onder de dissectie microscoop 42. trimmen voorzichtig het weefsel en neem een ​​foto voor het behoud van de oriëntatie. Opmerking: Post verwerkingsmethoden weefsel kleuring in SBFSEM combineert een verscheidenheid van heavy metal kleuring methoden inOm de resolutie te verbeteren en zijn gebaseerd op de methode die eerder door Deerinck et al 40 ontwikkeld. </li><li> Was de glutaaraldehyde gefixeerde weefsels 3 keer 5 min elk in 0,1 M cacodylaatbuffer (pH 7,2). </li><li> Bereid 0,1% looizuuroplossing door oplossen looizuur in 0,1 M natriumcacodylaat (pH 7,2). Swirl totdat het is opgelost en filteren door middel van 0,45 pm filter, indien nodig. </li><li> Postfix de weefsels cacodylate gebufferde 0,1% looizuur door incubatie in 1 ml reagens voor 30 - 60 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: De incubatietijd is afhankelijk weefselgrootte, maar 30 min het beste werkt voor de meeste weefsels. </li><li> Wassen weefsels 3 keer 5 min elk in cacodylaatbuffer (pH 7,2). </li><li> Los op 0,3 g kaliumferrocyanide en 0,86 g natriumcacodylaat in 10 ml gedestilleerd H2 O (dH 2 O). Houd de kaliumferrocyanide-oplossing op het ijs. Net voor gebruik, voeg 10 ml van 4% osmiumtetroxide (OsO 4). </li><li> Vlekken op de weefsels met 2% osmium-ferrocyanide oplossing voor 90 min op ijs. Was 3 maal, 5 min elk in dH 2 O. </li><li> Bereid 1% thiocarbohydrazide (TCH) oplossing door het oplossen van 0,1 g TCH in 10 ml dH 2 O. Oplossen bij 60 ° C door zwenken om de 10 min tot het volledig opgelost. Neem de veiligheidsvoorschriften bij behandeling van TCH, in het bijzonder zorgen om gebruik te maken van metalen, verhitting tot hoge temperaturen, of als oplossing te voorkomen uit te drogen. </li><li> Behandel de monsters met vers bereide 1% TCH gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was 3 maal, 5 min elk in dH 2 O. </li><li> Verdun 4% OsO 4-2% met dH 2 O, vlek weefsels met 2% waterig osmiumtetroxide door incubatie gedurende 1 uur. Wassen weefsels 3 keer, 5 minuten elk met dH 2 O. </li><li> Incubeer de monsters O / N op 1% uranylacetaat in dH 2 O bij 4 ° C. </li><li> Bereid Walton&#39;s lead aspartaat-oplossing (zoals beschreven door Deerinck et al 40). <ol><li> Los op 0,998 gram L-aspartaat in 250 ml dH 2 Oen voeg 10 N kaliumhydroxide (KOH) druppelsgewijze totdat de pH 5,5 bereikt. Na pH aanpassing, voeg 0,066 g loodnitraat in 10 ml asparaginezuur voorraad en verhit tot 60 ° C gedurende 30 minuten. </li></ol></li><li> Spoel weefsels in dH 2 O en incubeer met Walton&#39;s lead aspartaat vlek gedurende 30 minuten in een 60 ° C oven. Was 3 maal, 5 min elk in dH 2 O. </li><li> Uitdrogen monsters door een gegradeerde reeks van alcohol via gekoelde oplossing van 20%, 50%, 75%, 85% en 95% ethanol gedurende 5 minuten elk, gevolgd door 100% ethanol 3 maal, 10 minuten elk. Opmerking: Gebruik 100% ethanol uit vers geopende fles, als geopend ethanol absorbeert water uit de lucht en veroorzaken inbedding te mislukken. Langere incubaties nodig met grotere weefselmonsters. </li><li> Spoelmonsters 2 maal, 15 minuten elk in propyleenoxide. </li><li> Voeg plasticinsluiting hars middels 25 ml hars, 10,5 ml DDSA (dodecenyl barnsteenzuur anhydride), 15,5 ml NMA (methyl Nadic anhydride) en 1 mlDMP-30 (2,4,6-tris dimethylaminomethyl fenol). Meng de hars door schudden. Spin en laat de hars totdat bubbels vastberadenheid staan. Let op: Dit is de standaard gemiddelde hardheid recept. Andere soorten elektronenmicroscopie (EM) plastic hars gebruiken, maar moet worden getest met een niet-essentiële controlemonster van tevoren als niet alle harsen werken SBFSEM. </li><li> Incubeer de weefsels O / N op een 50: 50 mengsel van inbedding hars en propyleenoxide, in een flacon die aanvankelijk wordt afgedekt, dan afgetopte na 2 uur, zodat het propyleenoxide verdampt in de periode van ongeveer 8-10 uur. </li><li> Transfer het weefsel 100% verse inbedding hars in schone flesjes voor 2 uur. </li><li> Insluiten monsters verse inbedding hars in vlakke matrijzen bevattende bedrukte papieren etiketten en harden ze in een oven bij 60 ° C gedurende 48 uur. Na ongeveer 1 uur, controleer dan het weefsel plaatsing en uitlijning weer, en indien nodig bijstellen. </li><li> Trim monsters naar het gebied van interesse en monteren op een aluminium pin met behulp van Gelling cyanoacrylaat superlijm of een geleidende epoxyhars, vervolgens een laag colloïdaal zilver pasta rond de zijkanten van het blok naar een geleidingsbaan aan de aluminium pen verschaffen. </li><li> Onderzoek weefselmonsters met behulp van een scanning elektronenmicroscoop systeem uitgerust met een interne kamer ultramicrotoom stadium lage kV teruggekaatste elektronen detector 32. Let op: Zorg voor instrument- en de site-opleiding in de scanning elektronenmicroscoop (SEM) te gebruiken en uitgegroeid tot een geautoriseerde gebruiker. Als alternatief kan samenwerking met een onderzoeker of kernfaciliteit voor kleine projecten mogelijk zijn. Straling training kan ook nodig zijn als SEM genereren x-stralen. </li><li> Om het beeld van de monsters, kunt u de volgende instellingen: 2,25 kV, is 5 - 10 nm / pixel resolutie, met veld maten tussen 80-250 urn x, y (ander gebied maten mogelijk), en slice dikte van 50 - 100 nm, met in totaal 250-600 segmenten in een 16 - 20 uur periode. Opmerking: Instellingen aanzienlijk variëren tussen de verschillende microscopen, indiindividuele monsters, en de gewenste resolutie. Deze instellingen moeten beelden die eenvoudig te interpreteren vele monsters produceren. </li></ol> 2. Het analyseren van de Imaging Dataset Opmerking: Het beeld J / Fiji software wordt gebruikt om de dataset te analyseren en vertrouwt op de TrakEM2 plug. Voorbewerken stappen kunnen worden uitgevoerd met verschillende software, en kan daarna of kleine afhankelijk van de ervaring niveau en de stapels verkregen. De belangrijkste transformaties met behulp van de open-source software (ImageJ ver 1.50b, Fiji downloaden 1 oktober 2015) worden hier beschreven. <ol><li> afbeeldingen naar 8 bit tiff-formaat te converteren van de oorspronkelijke eigen 16-bits afbeeldingen door het openen in de software en het selecteren van menu-items Afbeelding → Type → 8 bit. <ol><li> Als automatische conversie contrast / helderheid tijdens deze stap is niet ideaal voor afbeeldingen, heropenen de 16-bits afbeeldingen, en druk op Afbeelding → Aanpassen → Helderheid / Contrast. Selecteer een bereik die werkt voor alle afbeeldingen en druk op Toepassen. Voer vervolgens conversion. Opmerking: Op sommige SEM, kan deze stap microscope fabrikant van software nodig. </li><li> Indien nodig, te wijten aan een gebrekkige beeld- beweging tussen segmenten (bv. Drift als gevolg van het laden), registreren / uitlijnen het beeld stacks (menu-items Plugins → Registratie → Linear StackAlignmentWithSIFT). In de meeste registratie software, die voor &quot;vertaling-only&quot; mode in plaats van &quot;star lichaam&quot;. Opmerking: Veel benaderingen en software kan werken: de SIFT registratie plug-in werkt voor vele toepassingen en er is een virtuele stack versie. <ol><li> Indien nodig, vergroot het doek grootte voorafgaand aan de registratie (Afbeelding → Aanpassen → canvasmaat) of te reduceren tot een gebied van belang (Afbeelding → Crop). Opmerking: Sommige drift of splaying kunnen optreden, en proberen andere plugins of software kunnen betere resultaten. Handmatige opties zijn ook beschikbaar (bijv. ImageJ / Fiji, Plugins → Registratie → ManualLandmarkSelection). </li></ol></li><li> Als desired, schaal beelden naar kleinere, meer beheersbare omvang (bv. 25%) met behulp van ImageJ (Afbeelding → ​​Scale). </li></ol></li><li> Start de software, selecteert u Bestand → Importeren → reeks afbeeldingen en selecteer vervolgens de tiff-bestanden. </li><li> Start de plugin door Bestand → Nieuw → TrakEM2 (blanco). Twee vensters te openen; één beheert het project en area_lists en de andere beheert tracing, en wordt aangeduid als het &#39;doek&#39;. </li><li> Laad de afbeelding stapel in de plugin door een klik met de rechtermuisknop op het doek import. Kies de invoer en klik op import stack. In de pop-up opties, vinkt u het vakje voor virtuele stacks. Opmerking: hoewel het beeld stacks reeds in de software worden geopend, moeten ze ook worden geopend in de plugin. De computer kan soepeler lopen als de doos virtuele stacks wordt gecontroleerd. </li><li> Nadat de mipmaps worden gecreëerd en de stack wordt geladen, klik met de rechtermuisknop op het project onder de plugin venster te noemen. Klik met de rechtermuisknop op &#39;nieuw project&#39; in de sjabloon colUMN, en selecteer &#39;add new kind&#39; voor dat project. Klik met de rechtermuisknop opnieuw om &#39;area_list&#39; te selecteren. </li><li> Stel de Z-as omvang van het project in te stemmen met de originele electronen microscoop instellingen door rechts te klikken op het doek, en klik vervolgens op scherm en selecteer kalibratie. Stel bovendien de Z-schaal door het selecteren van alle lagen in de plug-in venster, klik met de rechtermuisknop op schaal Z en de dikte te selecteren. </li><li> Klik en sleep de &#39;project&#39; en al &#39;kinderen&#39; in het project sectie om de &#39;gebied lijsten&#39; onder de tab &#39;Z ruimte&#39; in het doek venster te maken objecten. </li><li> Selecteer het &#39;gebied list&#39; en klik met de rechtermuisknop te selecteren en een kleur. Nu, met de kwast tool om objecten zoals mitochondriën te sporen, in de electronen microscoop beelden. Gebruik &#39;Shift + klik op&#39; in een gesloten cirkel te vullen, &#39;Ctrl + scrollen&#39; om in en uit te zoomen, en &#39;Alt + klik op&#39; om kwast cursor veranderen in een gum. </li><li> Kies twee gebieden van ~ 10-15 urnvan 10 - 15 urn op de linkerbovenhoek en rechteronderhoek van het beeld en identificeren van alle mitochondriën binnen deze gebieden onpartijdige bemonstering van mitochondriën in elke dataset mogelijk te maken. </li><li> Op het &#39;doek&#39;, te observeren en te traceren mitochondriën het hele secties. Let op: Mitochondriën zijn vrij donker / dichte verschijnen organellen, van vergelijkbare grootte in diameter en losjes cilindrisch. De unieke cristae gevormd door de binnenste membraan zijn gemakkelijk te onderscheiden binnen dit organel. </li><li> Wanneer u klaar bent met het traceren, klik met de rechtermuisknop op het area_list onder het tabblad Z ruimte, selecteert u &#39;Show in 3D&#39;. Dit zal de 3D-viewer plugin lanceren om een ​​3D-reconstructie van de getraceerd afbeelding te bekijken. <ol><li> Mitochondriale volume metingen, selecteert u object in 3D-viewer uit te voeren, klikt u op het tabblad &#39;Edit&#39; en selecteer &#39;Objecteigenschappen&#39;. De mitochondriale volume schatting wordt vermeld samen met een aantal andere metingen. </li></ol></li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben. Emily K Benson is een betaalde werknemer van Renovo Neural Inc., en Grahame J Kidd dient als Wetenschappelijk Directeur voor 3DEM bij Renovo Neural Inc., wat een commerciële aanbieder is van seriële block-face SEM-diensten en analyse.

De complexiteit van het zenuwstelsel moeilijk na te reconstrueren grote weefselvolumes en analyseren van de morfologie en de verdeling van organellen zoals mitochondriën met voldoende resolutie. Meerdere cellen waaronder neuronen, oligodendrocyten en astrocyten met talrijke processen verlengd driedimensionaal communiceren in het hersenweefsel 43. Omdat mitochondriën bevindt zowel in de soma van cellen en distale processen, mitochondriale morfologie uiterst pleomorf in het zenuwstelsel (figuur 1).</str...

Mitochondriën zijn dynamische organellen die hun vorm en locatie afhankelijk van de cellulaire signalen en verandert zal in nauwe interactie met mobiele cytoskelet en als reactie op cellulaire gebeurtenissen zoals calcium stromen in neuronen 1. Mitochondriën ook een wisselwerking met andere cellulaire organellen, bijv endoplasmatisch reticulum, waardoor reguleert de dynamiek en metabolisme 2. Mitochondriale morfologie toont heterogeniteit in verschillende celtypen dwz. de vorm van het organel verschilt van die buisvormige bestaande uit platen, zakken en ovalen 3. Het is aangetoond dat mitochondriale fusie en splijtstofcyclus eiwitten de locatie, afmeting, vorm en verdeling van mitochondria 4 kan reguleren. Bovendien, veranderingen in mitochondriale vorm geassocieerd met neurodegeneratie, neuronale plasticiteit, spieratrofie, calcium signaaloverdracht, reactieve zuurstofspecies generatie en levensduur en celdood impliceert that celspecifieke mitochondriale morfologie essentieel is voor de handhaving van normale cellulaire functie 5-11. Een belangrijke bio-energetische functie van de mitochondriën is om adenosine trifosfaat (ATP) te genereren door het uitvoeren van een reeks van metabole reacties die volledige afbraak van voedingsstoffen (ie glucose, vetzuren en aminozuren) via de TCA cyclus te betrekken en OXPHOS trajecten 12. Het menselijk brein vormt slechts 2% van het lichaamsgewicht maar het verbruikt ~ 20% van de totale energie geproduceerd, waardoor het een zeer energie veeleisende orgaan 13. Het is dan ook niet verwonderlijk dat mitochondriale dysfunctie bij de mens leidt tot een groot aantal neurologische verschijnselen 14-17. Genetische mutaties in OXPHOS componenten die ATP productie leidt afbreuk mitochondriale aandoeningen 17,18, die klinisch heterogene groep van aandoeningen met een prevalentie van ~ 1: 5000 individuen, en een van de meest voorkomende oorzaak van metabolic stoornissen bij kinderen en volwassenen. Deficit van mitochondriën afkomstig ATP invloed op meerdere orgaansystemen met een hoge energie-eisen organen, zoals de hersenen, het hart en de skeletspieren wordt voornamelijk beïnvloed bij deze patiënten 14,17,18. In de afgelopen jaren hebben meerdere studies bewijs geleverd voor mitochondriële disfunctie bij zowel neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen 15-17,19,20. Aangezien mitochondria essentieel en kritisch voor ontwikkeling van de hersenen en de functie, is het noodzakelijk om protocollen die veranderingen in de hersenen mitochondriale morfologie, structuur, grootte, aantal en distributie onder zowel gezonde als zieke toestanden kunnen analyseren ontwikkelen. Muismodellen mitochondriën gerichte groen fluorescerend eiwit (GFP) werden geproduceerd om mitochondriale mutaties en lokalisatie visualiseren in de hersenen 21,22. Hoewel dit een zeer nuttig hulpmiddel mitochondriale motiliteit algemene verspreiding te onderzoeken, zijn er een aantal nadelen die include beperkte resolutie en gevoeligheid van fluorescentie microscopie. Deze kenmerken maken het moeilijk om de relatief kleine formaat mitochondria volgen. Evenzo seriële transmissie elektronenmicroscopie is met succes gebruikt om synaptische mitochondriën 23 bekijken, maar deze methode is zeer tijdrovend. Mitochondriale morfologie bekend is zeer dynamisch te zijn als ze worden voortdurend kernsplijting en kernfusie cycli, en in de meeste cellen mitochondria onderhouden van een sterk verbonden netwerk 24-26. Neuronen zijn sterk gepolariseerde cellen met meerdere dendrieten en axonen verlengd, en dat mitochondria een aangesloten netvormige netwerk in het cellichaam vormen kan hebben om te scheiden als zij hun weg door deze neurieten (figuur 1). Hierdoor hersenen mitochondriën zeer gevarieerd in grootte en vorm. Bijvoorbeeld met gebruikmaking serieblok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) techniek we eerder waargenomen dat het verschil in de hoeveelheid of de grootte van extrasynaptic mitochondria aan mitochondria in de zenuwuiteinden kan zo veel als zestien vouwen 27. Er zijn verschillende manieren voor het uitvoeren van analyses volume 28, welke seriële sectie TEM 29, geautomatiseerde tape verzamelen ultramicrotoom SEM 30 omvat, gefocusseerde ionenbundel SEM 31 en SBFSEM 32. De SBFSEM analyse heeft voordelen doordat zij de resolutie kwantitatieve gegevens over de morfologische vorm, grootte, verdeling en het aantal van organellen zoals mitochondriën, deze gebieden tot 1 mm van de hersenen. De technische werking is ook de minst veeleisende, met data-acquisitie en analyse binnen de mogelijkheden van vele biologische laboratoria die eerdere EM ervaring missen. De komst van commerciële instrumenten voor het genereren seriële sectie-achtige beelden heeft 3D ultrastructurele analyse van weefsels die routinematig techniek, die een onbevooroordeelde volumetrische analyse op een snelle en reproduceerbare wijze 28 verder toelaat </sup&gt;. De SBFSEM werd eerst beschreven en gebruikt in het gebied van neurobiologie in 2004 32, gebaseerd op een idee van Leighton geïntroduceerd in 1981 33. Meerdere studies sindsdien deze techniek als een belangrijk instrument voor reconstructie analyse van neuronale circuits 34 zijn opgesteld. Bovendien vele kleinere projecten, biedt reconstructie analyse celorganellen 27,35-39 identificeren. Daar worden de verkregen beelden afkomstig zijn van lage spanning terug scatter elektronen, nieuwe kleuringsprotocollen waarin verschillende bekende heavy metal-kleuring technieken te combineren werden ontwikkeld om de resolutie van 40 te verhogen. In dit artikel geven we een protocol voor het gebruik van 3D-elektronenmicroscopie beeldvorming en volumetrische analyse van de hersenen mitochondriën gebaseerd op methoden die eerder zijn gebruikt door ons en anderen 38,39,41. Het weefsel nabewerking methoden waren zoals eerder beschreven door Deerinck c.s.40.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J muizen</td><td>Jackson laboratorium&nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>VETone, handelsnaam Fluriso</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Dissectielade</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td>S65105&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiescharen</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly canula</td><td>Exel International</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat bufferoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Filter (0,45 micron)</td><td>EMD Millipore</td><td>NC0813356</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome snijsysteem</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Vibratome 3000</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Cacodylate</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Tanzuur</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Kalium Ferrocyanide</td><td>J.T. Baker</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide 4% oplossing</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparaginezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>Kalium Hydroxide</td><td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>Lodzaan</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 EMBEDING KIT</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>Bevat Embed 812&nbsp; hars, DDSA, NMA en DMP-30.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25% EM Grade</td><td>Polysciences Inc.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetaat</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Propyleenoxide</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Inbeddingsmal</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium monsterspeld</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>Colloïdaal Zilver Vloeistof</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Scherer</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Superlijm (Loctite Gel Control)</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Hardware/craft winkels hebben dit artikel</td></tr><tr><td>Leidbare epoxy</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>Scanning elektronenmicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr><td>In kamer ultramicrotoom voor SEM</td><td>Gatan Inc.</td><td>3View2</td><td>Kan worden ontworpen voor andere SEM's</td></tr><tr><td>Trimmen microscoop voor pin voorbereiding</td><td>Gatan Inc.</td><td>geleverd als onderdeel van 3View systeem</td><td></td></tr><tr><td>Laag kV terugverstrooide elektronen detector</td><td>Gatan Inc.</td><td>3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/ Fiji verwerkingspakket&nbsp;</td><td>ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015</td><td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a></td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td></tr></tbody></table>

analyse van de brain mitochondriën gebruik van serial block-face scanning electron microscopy



Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Menselijk brein is een hoge energie verbruikende orgaan dat voornamelijk is gebaseerd op glucose als brandstof bron. Glucose wordt gekataboliseerd door hersenen mitochondria via glycolyse, tri-carbonzuur (TCA) cyclus en oxidatieve fosforylering (OXPHOS) wegen om cellulaire energie te produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP). Bijzondere waardevermindering van mitochondriale ATP productie veroorzaakt mitochondriale aandoeningen, die klinisch presenteren met prominente neurologische en myopathische symptomen. Mitochondriale gebreken zijn ook aanwezig in neurologische aandoeningen (bv autisme spectrum stoornis) en neurodegeneratieve aandoeningen (bijvoorbeeld amyotrofe laterale sclerose, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson). Aldus is er een toenemende belangstelling voor het gebied voor het uitvoeren van 3D analyse van mitochondriale morfologie, structuur en distributie onder gezond en ziektetoestanden. De hersenen mitochondriale morfologie is zeer divers, met een aantal mitochondria name inde synaptische gebied in het bereik van &lt;200 nm diameter, hetgeen lager is dan de resolutielimiet van traditionele lichtmicroscopie. Uitdrukken van een op mitochondriën gerichte groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen aanzienlijk verbetert de organellen detectie met confocale microscopie. Dit betekent echter niet de beperkingen van de gevoeligheid van detectie van relatief kleinschalige mitochondria overwinnen zonder oversaturating de beelden van groot formaat mitochondria. Terwijl seriële transmissie elektronenmicroscopie is met succes gebruikt om mitochondriën karakteriseren de neuronale synaps, deze techniek is zeer tijdrovend vooral bij het vergelijken van meerdere monsters. De seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) techniek houdt een geautomatiseerd proces van snijden, imaging blokken van weefsel en data-acquisitie. Hier bieden we een protocol om SBFSEM uitvoeren van een bepaald gebied van knaagdieren hersenen om snel te reconstrueren en te visualiseren mitochondriale morfologie. deze technique kan ook worden gebruikt om nauwkeurige informatie over mitochondrial nummer, volume, grootte en verdeling in een bepaald hersengebied verschaffen. Omdat de verkregen beeldresolutie is hoog (meestal minder dan 10 nm) alle bruto mitochondriale morfologische defecten kunnen ook worden gedetecteerd.

We tonen aan dat de hersenen mitochondriale morfologie en grootte heterogeen van verschillende neuronale deelcompartimenten. Confocale microscopie op lage dichtheid neuronale culturen getransduceerd met lentivirus uiten van mitochondriën gerichte groen fluorescerend eiwit toonde aan dat mitochondria die woonachtig zijn in neuronale soma vormen een reticulair netwerk, terwijl die woonachtig zijn in distale neurieten vertonen een discrete langwerpig morfologie (figuur 1 AB).</stron...

Het visualiseren en analyseren van mitochondriën uit hersenweefsel van zoogdieren is een uitdagende taak. Hier beschrijven we hoe driedimensionale (3D) reconstructie-analyse van de seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de morfologische en volumetrische analyse van dit cruciale energieproducerende orgaantje.

Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Het algemene doel van de techniek van seriële block-face scanning elektronenmicroscopie is het analyseren van de morfologie, structuur, distributie, het volume en het aantal mitochondriën in een gedefinieerd gebied van het muizenbrein. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van veel kernvragen in de neurobiologie, zoals de vraag of veranderingen in de structuur, het aantal en de distributie van mitochondriën in de hersenen wezenlijk bijdragen aan neurodegeneratieve en neuro-ontwikkelingsstoornissen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het proces van het beelden van seriële coupes wordt geautomatiseerd door een op maat gemaakte ultramicrotoom te integreren in de kamer van de laagvacuüm scanning elektronenmicroscoop.Om het experiment te starten, wast u de eerder bereide met glutaraldehyde gefixeerde weefsels drie keer gedurende vijf minuten in 0,1 molar cacodylaatbuffer. Fixeer de weefsels vervolgens met 1 milliliter cacodylaatgebufferde 0,1% tanninezuur gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de weefsels na de nacfixatie in cacodylaatbuffer.Los 0,3 gram kaliumferrocyanide en 0,86 gram natriumcacodylaat op in 10 milliliter gedestilleerd water. Voeg vlak voor gebruik 10 milliliter 4%osmiumtetroxide toe en kleur de weefsels gedurende 90 minuten op ijs met een 2%osmiumferrocyanide-oplossing. Was het weefsel na het kleuren met gedestilleerd water.Behandel de monsters gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met vers bereide 1% thiocarbohydrazide- of TCH-oplossing. Was vervolgens de monsters. Kleur daarna de weefsels gedurende één uur met 2% waterige osmiumtetroxide.Was de weefsels na het kleuren met gedestilleerd water. Incubeer de monsters gedurende de nacht in 1% uranylacetate in gedestilleerd water bij 4 °C. Spoel de weefsels de volgende dag af met gedestilleerd water en incubeer ze in een oven met Welton's lead aspartate-kleuring.Het verkrijgen van de best mogelijke kleuringen van weefsels is cruciaal voor beeldvorming, aangezien een slechte kleuring leidt tot een opladingsfenomeen op het monster dat beeldvorming bemoeilijkt of onmogelijk maakt. Was het weefsel in gedestilleerd water. Dehydrateer de monsters via een oplopende reeks alcoholen met behulp van gekoelde ethanoloplossingen gedurende telkens vijf minuten, gevolgd door drie dehydraties met 100% ethanol van telkens 10 minuten.Was de monsters twee keer gedurende 15 minuten in propyleenoxide. Plaats de weefsels in een 1:1 mengsel van inbeddingshars en propyleenoxide, sluit het flaconnetje en incubeer de weefsels een nacht. Verwijder na twee uur de dop van het flaconnetje zodat het propyleenoxide gedurende de periode van negen uur kan verdampen.Breng de weefsels gedurende twee uur over naar 100% verse inbeddingshars in schone vials. Bed de monsters in verse inbeddingshars in platte vormen met geprinte papieren labels en hard ze uit in een oven. Controleer na één uur de plaatsing en uitlijning van het weefsel en pas dit indien nodig aan.Trim de monsters tot het gebied van belang en monteer ze op een aluminium pin met gellende cyanoacrylaat superlijm. Bedek vervolgens het monster rond de zijkanten van het blok met colloïdaal zilverpasta om een geleidend pad naar de aluminium pin te creëren. Onderzoek de weefselmonsters met een scanning elektronenmicroscoopsysteem dat is uitgerust met een ultramicrotoom-tafel in de kamer en een detector voor terugverstrooide elektronen met een laag kilovolt.Neem beelden van de monsters met deze instellingen. Begin de analyse door Image, Type en vervolgens 8-bit te selecteren om de beelden om te zetten van het oorspronkelijke propriëtaire 16-bit formaat naar het 8-bit TIFF-formaat. Als de automatische conversie van contrast en/of helderheid tijdens deze stap niet ideaal is voor de beelden, open dan de 16-bit beelden opnieuw en selecteer Image, Adjust, Brightness/Contrast.Selecteer een bereik dat voor alle afbeeldingen werkt en druk op Apply. Voer vervolgens de conversie uit. Als er een onaanvaardbare beweging van de afbeelding tussen de coupes was, lijn dan de afbeeldingsstacks uit door Plugins, Registration en Linear Stack Alignment with SIFT te selecteren en stel de uitlijning in op de modus translation-only in plaats van rigid body.Vergroot de canvasgrootte vóór de registratie door Afbeelding, Aanpassen, Canvasgrootte te selecteren. Alternatief kan de afbeelding worden beperkt tot een gebied van belang door de gewenste regio te selecteren en deze vervolgens bij te snijden. Schaal afbeeldingen indien nodig naar een kleiner, beter beheersbaar formaat met ImageJ door Afbeelding en Schalen te selecteren.Confocale microscopie op neuronale culturen met lage dichtheid toonde aan dat mitochondria in het neuronale soma een reticulair netwerk vormen, terwijl mitochondria in distale neurieten een discrete, verlengde morfologie vertonen. Met behulp van de serial block-face scanning electron microscopy, of SBFSEM-techniek, werden de mitochondria, dendrieten en axonale varicositeiten in de muizenhersenen duidelijk waargenomen. Driedimensionale reconstructies van mitochondria in de neurieten van muizenhersenweefsel toonden een verschil in grootte aan tussen dendritische en axonale mitochondria.Gegevens geëxtraheerd uit een representatieve 2-D SBFSEM-afbeelding onthulden dat het volume of de grootte van mitochondriën in de neuronale presynapsen significant kleiner was dan die in de extrasynaptische regio. De afbeeldingen verkregen via SBFSEM-analyse bieden een verhoogde resolutie om de ultrastructurele kenmerken van individuele mitochondriën te visualiseren. Het is mogelijk om het cellulaire compartiment van mitochondriën te classificeren door de nabijheid tot gemakkelijk identificeerbare structuren te bepalen, zoals niet-synaptische somatische mitochondriën en presynaptische mitochondriën.Deze techniek kan in ongeveer zeven dagen worden uitgevoerd, wat drie dagen kleuren, twee dagen uitharden van de hars, één dag beeldvorming om een stack te produceren die geschikt is voor deze analyse, en ongeveer twee tot vier uur nabewerking van beelden ter voorbereiding op de analyse omvat. Deze procedure kan ook worden gebruikt in combinatie met andere methoden voor de beeldvorming van mitochondria, zoals live imaging met genetisch gelabelde mitochondria, om vragen te beantwoorden over mitochondriaal transport en de dynamiek van hun deling en fusie.

analysis-brain-mitochondria-using-serial-block-face-scanning-electron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Mukherjee, K., et. al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation, imaging, and analysis of mouse brain tissue using a serial block-face scanning electron microscope (SBFSEM) to visualize mitochondrial ultrastructure, enabling precise mapping of their morphology and spatial distribution in axonal and dendritic neuronal compartments.

 Imaging of Neuronal Mitochondria Using a Serial Block-Face Scanning Electron Microscope

Confocale scanning microscopie wordt toegepast voor beeldvorming enkele mitochondriale gebeurtenissen in doorbloed hart of skeletspieren in levende dieren. Real-time monitoring van enkele mitochondriale processen zoals superoxide flitsen en membraanpotentiaal schommelingen kan de evaluatie van de mitochondriale functie in een fysiologisch relevante context en tijdens pathologische verstoringen.

Confocale beeldvorming van Single mitochondriaal superoxide Knippert Intact Heart of In Vivo

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Verminderde mitochondriale vervoer en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide voorhersenen neuronen om mitochondriale vervoer en morfologie in erfelijke spastische dwarslaesie te beoordelen. Dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk, wat de studie van neurodegeneratieve ziekte zal vergemakkelijken.

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik bij het modelleren van mitochondriale ziekten.

Generatie van organoïden in de menselijke hersenen voor mitochondriale ziektemodellering

Het mitochondriale netwerk is uiterst complex, waardoor het zeer uitdagend is om te analyseren. Een nieuwe MATLAB-tool analyseert live confocale mitochondriën in timelapse-beelden, maar resulteert in een groot uitvoervolume dat individuele handmatige aandacht vereist. Om dit probleem aan te pakken, werd een routinematige optimalisatie ontwikkeld, waardoor een snelle bestandsanalyse mogelijk is.

Geoptimaliseerde geautomatiseerde analyse van homeostasemodulatie van levende neuronale mitochondriën door isovormspecifieke retinoïnezuurreceptoren

Deze studie presenteert een methode om de morfologie van mitochondriën te analyseren op basis van immunokleuring en beeldanalyse in hersenweefsel van muizen in situ. Het beschrijft ook hoe dit het mogelijk maakt om veranderingen in de mitochondriale morfologie te detecteren die worden veroorzaakt door eiwitaggregatie in modellen voor de ziekte van Parkinson.

Histologisch onderzoek van mitochondriale morfologie in een model voor de ziekte van Parkinson

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering voor het in beeld brengen van de mitochondriale morfologie in meerdere weefsels van C. elegans tijdens veroudering.

Beeldvorming en kwantificering van mitochondriale morfologie in C. elegans tijdens veroudering

In deze studie beschrijven we een stapsgewijs protocol en benadrukken we de belangrijkste details voor het bepalen van morfologische kenmerken van mitochondriën in levende cellen, inclusief monstervoorbereiding, beeldacquisitie en gegevensanalyse. Deze methode wordt vaak gebruikt om de mitochondriale morfologie te onderzoeken voor het bestuderen van verschillende aandoeningen.

Bepaling van mitochondriale morfologie in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Leer mitochondriënmorfologie analyseren in muizenhersenen met serial block-face scanning electron microscopy. Deze methode biedt 3D-reconstructie van mitochondriën voor onderzoek naar neurodegeneratieve aandoeningen.

Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Meer video's verkennen