Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy
July 9th, 2016
Het visualiseren en analyseren van mitochondriën uit hersenweefsel van zoogdieren is een uitdagende taak. Hier beschrijven we hoe driedimensionale (3D) reconstructie-analyse van de seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de morfologische en volumetrische analyse van dit cruciale energieproducerende orgaantje.
Het algemene doel van de seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie techniek is om mitochondriale morfologie, structuur, distributie, volume en aantal te analyseren in een gedefinieerd gebied van de muizenhersenen. Deze methode kan helpen om veel belangrijke vragen in de neurobiologie te beantwoorden, zoals of veranderingen in de structuur, het aantal en de verdeling van de mitochondriën in de hersenen een substantiële bijdrage leveren aan neurodegeneratieve en neurodevelopmentele stoornissen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het het proces van beeldvorming van seriële secties automatiseert door een aangepaste ultramicrotoom in te bouwen in de lage vacuüm-scannende elektronenmicroscoopkamer.
Om het experiment te beginnen, was de eerder bereide glutaraldehyde-gefixeerde weefsels drie keer gedurende vijf minuten in 0,1 molair cacodylaatbuffer. Post-fixeer de weefsels met 1 milliliter cacodylaat-gebufferd 0,1% tanninezuur gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na post-fixatie, was de weefsels in cacodylaatbuffer.
Los 0,3 gram kaliumferrocyanide en 0,86 gram natriumcacodylaat op in 10 milliliter gedistilleerd water. Voeg net voor gebruik 10 milliliter 4% osmiumtetraoxide toe en bekleur de weefsels met 2% osmiumferrocyanideoplossing gedurende 90 minuten op ijs. Na het kleuren, was het weefsel in gedistilleerd water.
Behandel de monsters met vers bereide 1% thiocarbohydrazide of TCH-oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de monsters. Vervolgens kleuren de weefsels met 2% waterig osmiumtetraoxide gedurende een uur.
Na het kleuren, was de weefsels met gedistilleerd water. Incubeer de monsters een nacht in 1% uranylacetaan in gedistilleerd water bij 4 graden Celsius. De volgende dag, spoel de weefsels in gedistilleerd water en incubeer ze met Welton's loodaspartaatkleurstof in een oven.
Het verkrijgen van de best mogelijke kleuring van weefsels is cruciaal voor beeldvorming, aangezien slechte kleuring resulteert in een ladingsfenomeen op het monster dat beeldvorming moeilijk of onmogelijk maakt. Was het weefsel in gedistilleerd water. Dehydrateer de monsters door een gegradueerde reeks alcohol met gekoelde oplossingen van ethanol gedurende vijf minuten elk, gevolgd door een 100% ethanol-dehydratie gedurende drie keer 10 minuten elk.
Was de monsters twee keer gedurende 15 minuten elk in propyleenoxide. Plaats de weefsels in een 1:1 mengsel van inbeddingshars en propyleenoxide, sluit de fles af en incubeer de weefsels een nacht. Open de fles na twee uur zodat het propyleenoxide gedurende de negen uur periode kan verdampen.
Breng de weefsels over naar 100% verse inbeddingshars in schone flessen gedurende twee uur. Bed de monsters in verse inbeddingshars in platte mallen met bedrukte papieren etiketten en laat ze uitharden in een oven. Controleer na een uur de weefselplaatsing en uitlijning en pas indien nodig aan.
Trim de monsters tot het gebied van belang en bevestig ze op een aluminium pin met behulp van gelling cyanoacrylaat superlijm. Bekleed vervolgens het monster met colloïdaal zilverpasta rond de zijden van de blok om een geleidende pad naar de aluminium pin te bieden. Onderzoek de weefselmonsters met behulp van een scannende elektronenmicroscoopsysteem uitgerust met een ultramicrotoom-trap in de kamer en een laag kilovolt terugverstrooid elektronendetector.
Maak beelden van de monsters met deze instellingen. Begin de analyse door Image, Type te selecteren, vervolgens 8-bit om de afbeeldingen om te zetten naar 8-bit TIFF-formaat vanuit het oorspronkelijke 16-bits eigendom. Als automatische contrast- en/of helderheidsomzetting tijdens deze stap niet ideaal is voor afbeeldingen, open dan de 16-bits afbeeldingen opnieuw en druk op Image, Adjust, Brightness/Contrast.
Selecteer een bereik dat voor alle afbeeldingen werkt en druk op Apply. Voer vervolgens de conversie uit. Als er onaanvaardbare beeldbeweging tussen plakjes was, lijn de beeldstacks uit door Plugins, Registration en Linear Stack Alignment with SIFT te selecteren en stel de uitlijning in voor translatie-alleen modus in plaats van stijve lichamen.
Vergroot de canvasgrootte voorafgaand aan registratie door Image, Adjust, Canvas Size te selecteren. Of verminder de afbeelding tot een gebied van belang door het gewenste gebied te selecteren en vervolgens bij te snijden. Indien nodig, schaal de afbeeldingen naar een kleinere, beter beheersbare grootte met ImageJ, vervolgens Image en Scale te selecteren.
Confocale microscopie op neuronale culturen met lage dichtheid toonde aan dat mitochondriën die zich in neuronale soma bevinden een reticulair netwerk vormen, terwijl die zich in distale neurites een discrete langwerpige morfologie vertonen. Met behulp van de seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie of SBFSEM-techniek, werden mitochondriën, dendrieten en axonvaricosities duidelijk waargenomen in de muizenhersenen. Drie dagen reconstructies van mitochondriën in de neurites van muizenhersenweefsel toonden een verschil in grootte tussen dendritische en axonale mitochondriën.
Gegevens uit een representatieve 2-D SBFSEM-afbeelding onthulden dat het volume of de grootte van mitochondriën die zich binnen de neuronale presynapses bevinden, significant kleiner was dan die zich in de extrasynaptische regio bevinden. De afbeeldingen verkregen door SBFSEM-analyse bieden verhoogde resolutie om de ultrastructurele kenmerken van individuele mitochondriën te visualiseren. Het is mogelijk om het cellulaire compartiment van mitochondriën te classificeren door de nabijheid ervan te bepalen tot gemakkelijk identificeerbare structuren zoals niet-synaptische somatische mitochondriën en presynaptische mitochondriën.
Deze techniek kan in ongeveer zeven dagen worden uitgevoerd, waaronder drie dagen voor kleuring, twee dagen voor harsuitharding, één dag voor beeldvorming om een stack te produceren die geschikt is voor deze analyse, en ongeveer twee tot vier uur voor beeldnabewerking ter voorbereiding op de analyse. Deze procedure kan ook worden gebruikt in combinatie met andere methoden voor het beeldvormen van mitochondriën, zoals live beeldvorming met genetisch gelabelde mitochondriën om vragen over mitochondriale trafficking en
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt het gebruik van seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) voor het analyseren van mitochondriale morfologie in muizenhersenweefsel. Het benadrukt het belang van het begrijpen van mitochondriale structuur en distributie in relatie tot neurodegeneratieve en neurodevelopmentele stoornissen.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Elektronenmicroscopie
Achtergrond
- Mitochondria zijn cruciaal voor energieproductie in cellen.
- Begrip van mitochondriale veranderingen kan inzichten geven in hersenaandoeningen.
- Traditionele beeldtechnieken geven mogelijk geen gedetailleerde mitochondriale structuren weer.
- SBFSEM biedt een nieuwe benadering om deze organellen in 3D te visualiseren.
Doel van het onderzoek
- Om mitochondriale morfologie, structuur en distributie in muizenhersenen te analyseren.
- Om de rol van mitochondria in neurodegeneratieve en neurodevelopmentele stoornissen te onderzoeken.
- Om het beeldvormingsproces te automatiseren voor efficiëntie en nauwkeurigheid.
Gebruikte methoden
- Bereiding van glutaraldehyde-gefixeerde hersenweefsels.
- Wassen van weefsels in cacodylaatbuffer.
- Nabewerking met tanninezuur voor verbeterde beeldvorming.
- Gebruik van een aangepaste ultramicrotoom in de SBFSEM-opstelling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle 3D-reconstructie van mitochondriale structuren.
- Inzichten in de distributie en het volume van mitochondriën in hersengebieden.
- Mogelijke correlaties tussen mitochondriale veranderingen en hersaandoeningen.
- Demonstratie van de voordelen van SBFSEM boven traditionele methoden.
Conclusies
- SBFSEM is een krachtig hulpmiddel voor mitochondriale analyse in de neurowetenschappen.
- Begrip van mitochondriale morfologie kan helpen bij neurobiologisch onderzoek.
- Deze techniek kan leiden tot nieuwe inzichten in de pathofysiologie van hersaandoeningen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) enables high-resolution, quantitative analysis of mitochondrial morphology and distribution in brain tissue, addressing a critical gap in neurodegenerative and neurodevelopmental disease research. This capability supports mechanistic de-risking and target validation by providing precise structural data on organelles implicated in disease pathogenesis. Integrating SBFSEM-derived insights at the discovery stage enhances predictive confidence for portfolio decisions involving mitochondrial targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial structural changes linked to disease mechanisms.
- Supports functional target validation by quantifying organelle number, volume, and distribution.
- Facilitates mechanistic de-risking for mitochondrial involvement in neurological disorders.
- Provides high-resolution data to inform predictive confidence in early-stage programs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D datasets for downstream quantitative analysis of mitochondrial phenotypes.
- Standardizes imaging outputs for reproducibility across multiple samples and conditions.
- Enables scalable, automated acquisition of ultrastructural data for assay development.
- Supports reliable evaluation of compound effects on mitochondrial morphology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial structural phenotypes with disease-relevant biomarkers in preclinical models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-sample comparisons.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in neurodegeneration and neurodevelopment portfolios.
- Delivers predictive de-risking for mitochondrial dysfunction as a therapeutic target.
Pipeline & Workflow Integration
SBFSEM integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling quantitative, high-resolution analysis of mitochondrial structure in defined brain regions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mitochondrial involvement in disease mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides volumetric and distributional measurements to distinguish phenotypic differences.
- Translational Research: Links ultrastructural mitochondrial data to disease-relevant endpoints in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable imaging platform for repeated use across neurobiology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Automates and standardizes high-resolution imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial targets in neurodegenerative and neurodevelopmental pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron microscopy and image analysis software.
- Demands access to SBFSEM instrumentation and computational infrastructure for 3D reconstruction.
- Necessitates standardized tissue preparation and staining protocols for cross-team reproducibility.
- Adaptation may be needed for different brain regions or disease models.
- Imaging throughput and data processing time should be considered for large-scale studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Brain Tissue Preparation
3:32
SBFSEM Imaging
4:15
Analyzing the Imaging Dataset
5:43
Results: Analysis of Brain Mitochondrial Morphology, Distribution, Abundance and Ultrastructure Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy
7:04
Conclusion
