Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo
15 juli 2016
Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.
Het algemene doel van deze procedure is om de trouw van chromosoomsegregatie tijdens mitose in een levend zebravis embryo te monitoren door gebruik te maken van fluorescerend gelabeld chromatine en celmembraaneiwitten die worden vastgelegd met behulp van hoogwaardige confocale microscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het mitoseveld, zoals hoe mitotische defecten resulteren in een ontwikkelingsdefect of tumorvorming in een levend gewerveld organisme? Het grote voordeel van deze techniek is dat we mitose observeren in een levend gewerveld organisme, waardoor fysiologisch relevante gegevens kunnen worden verzameld.
Na het fokken van volwassen zebravissen en het injecteren van eieren met H2A. F/Z-EGFP en/of pCS2 mCherry-CAAX RNA, ongeveer twee uur voor het beeldvormen, gebruik een fluorescerende dissectiescoop om GFP-positieve embryo's te identificeren. Breng helder groene, GFP-uitdrukkende embryo's over in een nieuwe, 100 bij 15 millimeter Petri-schaal met E3 blauw medium.
Breng een voorraadoplossing van 1%low-melt agarose in E3 blauw aan de kook. Verdeel drie milliliter van de gesmolten agarose in een 17 bij 100 millimeter kweekbuis. Houd de agarose warm door de kweekbuis in een 42-graad Celsius waterbad te plaatsen tot het klaar is om te worden gebruikt.
Verzamel 15-millimolar tricaine, gescreende embryo's, low-melt agarose, E3 blauw en een 35-millimeter glazen deksel-bodem kweekschaal en een dissectieslichtmicroscoop. Verwijder vervolgens met pincet nummer vijf voorzichtig de chorion van drie embryo's en plaats de embryo's in een aparte container om te worden verdoofd. Voeg vervolgens met behulp van een overdrachtpijp drie druppels 15-millimolar tricaine toe aan de schaal met de embryo's en vijf milliliter medium.
Voeg drie tot vier druppels 15-millimolar tricaine oplossing toe aan de buis met 1%gesmolten agarose. Wanneer de embryo's voldoende verdoofd zijn, gebruik een P200 Pipetman, met een centimeter van de pipettentip afgesneden, om de verdoofd embryo's over te brengen naar de schaal met glazen bodem. Verwijder overtollig E3 blauw tricaine oplossing.
Voeg langzaam vijf tot tien microliters low-melt-agarose-tricaine oplossing toe boven de embryo's, waarbij elke druppel gescheiden wordt gehouden, om ervoor te zorgen dat de embryo's niet dicht bij elkaar drijven. Richt vervolgens de embryo's in de agarose in de gewenste positie, zoveel mogelijk in de buurt van het glazen bodem, indien gebruik van een omgekeerde microscoop. Vanwege de verschuivingen die kunnen optreden, kan het nodig zijn om naar elk embryo terug te keren om ervoor te zorgen dat ze in de vereiste positie blijven.
Dit moet mogelijk meerdere keren worden gedaan, totdat de ideale positie is bereikt, terwijl de agar stolt. Na een paar minuten, om te testen of het is ingesteld, gebruik een naald om een klein stukje agarose te breken. Wanneer het kan worden weggetrokken van de druppel, gebruik aanvullende low-melt agarose om een koepel over de ingebedde embryo's te vormen, die het hele glazen bodem bedekt.
Terwijl de agarose stolt, bereid drie milliliter E3 blauw medium met vijf druppels 15-millimolar tricaine voor, om tijdens het beeldvormen over de ingebedde embryo's te worden geplaatst. Om 5D confocale beeldvorming van levende zebravis embryo's uit te voeren, open de beeldvormingssoftware en stel de microscoop in op een 60X numerieke apertuur 1.4 lens. Breng immersieolie aan op de lens en plaats de kweekschaal in de glijhouder op de microscooptafel.
Gebruik de ascontroller om het embryo van belang boven de objectieflens te plaatsen en verhoog de lens om de kweekschaal te ontmoeten. Giet E3 blauw en tricaine oplossing over de agar-ingebedde embryo's. Klik vervolgens op het Eye Port icoon om embryo's door het oogstuk te bekijken.
Schakel de Eye Port selectie uit en kies Beeld, Acquisitiecontroles, A1 Scan Gebied, om het A1 Scan Gebied gereedschap te openen. Selecteer het GFP kanaal, start de scan opnieuw en focus op een gebied van belang dicht bij het glazen bodem. Stop de scan, selecteer de GFP en mCherry kanalen en stel de lijngemiddelde optie in op normaal.
Kies nu Beeld, Acquisitiecontroles, ND Acquisitie, om het A1 ND Acquisitie gereedschap te openen. Begin met scannen. Positioneer vervolgens de embryo's met behulp van de ascontroller, zodat het scangebied zoveel mogelijk van de zebravis bevat.
Stel de Z-stack bovengrens in op het punt waar de cellen niet scherp staan, waardoor er een extra drie micrometer ruimte boven het monster is voor groei en celbeweging. Stel vervolgens de ondergrens in op het punt waar de cellen niet meer zichtbaar zijn en stel de Z-interval stapgrootte in op twee micrometer. Voor de hier getoonde experimenten, pas de beeldvormingslaservermogen, HV of versterking en offset niveaus aan, respectievelijk, zoals hieronder vermeld.
Zodra de parameters zijn ingesteld, schakel de scan uit om onnodige laserblootstelling te voorkomen die fototoxiciteit en fotobleken van het monster kan veroorzaken. Selecteer nu de 2X lijngemiddelde icoon, die de beste beeldkwaliteit en snelste scansnelheid biedt. Selecteer het juiste tijdsinterval en tijdsduur die nodig zijn voor het experiment.
Voor wild-type celdelingen zijn twee minuten tijdsintervallen gedurende een duur van twee uur voldoende voor het bepalen van de mitotische duur. Delingen die de spindelassemblage controlepunt langer dan dertig minuten activeren, zijn geschikter voor vier-tot-vijf-minuten intervallen gedurende vier uur, om de fluorescentie te behouden, zoals hier aangetoond. Om het bestand automatisch op te slaan terwijl het wordt verworven, vink het vakje Opslaan naar bestand aan en geef het bestand een naam.
Controleer tenslotte nogmaals of alle parameters correct zijn ingesteld en druk op Nu uitvoeren. Nadat de acquisitie is voltooid, klik op het Volume Drempel icoon om het bestand in een driedimensionale indeling te bekijken. Deze figuur toont de mogelijkheid om veel celdelingen te observeren met behulp van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode om mitose te visualiseren in levende zebravis-embryo's met behulp van fluorescent gelabeld chromatine en celmembraaneiwitten. De techniek stelt onderzoekers in staat om de trouw van chromosoomsegregatie te bewaken en de implicaties van mitotische defecten op ontwikkeling en tumorvorming te onderzoeken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Mitose is essentieel voor de ontwikkeling van organismen.
- Defectin mitose kunnen leiden tot kanker en ontwikkelingsstoornissen.
- Live beeldtechnieken bieden inzichten in cellulaire processen.
- Zebravissen dienen als waardevol modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkeling van gewervelden.
Doel van het onderzoek
- Om chromosoomsegregatie te bewaken tijdens mitose in levende zebravis-embryo's.
- Om te begrijpen hoe mitotische defecten bijdragen aan ontwikkelingsproblemen.
- Om hoge-resolutie confocale microscopie te gebruiken voor gedetailleerde observatie.
Gebruikte methoden
- Het fokken van volwassen zebravissen en het injecteren van eitjes met fluorescent RNA.
- Het gebruik van een fluorescent dissectiemicroscoop om GFP-positieve embryo's te identificeren.
- Het overbrengen van embryo's naar E3 blauw medium voor beeldvorming.
- Het vastleggen van beelden met behulp van hoge-resolutie confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van mitose in levende zebravis-embryo's.
- Identificatie van defecten in chromosoomsegregatie.
- Inzichten in de relatie tussen mitotische fouten en ontwikkelingsstoornissen.
- Demonstratie van de voordelen van live beeldvorming in fysiologische contexten.
Conclusies
- Deze methode verbetert het begrip van mitotische processen bij gewervelden.
- Het biedt een platform voor toekomstig onderzoek naar kanker en ontwikkelingsstoornissen.
- Live beeldtechnieken zijn cruciaal voor het verzamelen van fysiologisch relevante gegevens.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Observing mitotic dynamics in live vertebrate embryos enables direct assessment of chromosomal segregation fidelity, a critical factor in target validation for oncology and developmental disorder pipelines. This approach provides physiologically relevant data that bridges in vitro findings with in vivo disease mechanisms, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. By quantifying mitotic defects and progression timing in mutant models, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing chromatin dynamics and microtubule-kinetochore interactions in a disease-relevant vertebrate system.
- Operational Value: Supports functional target validation through live imaging of mitotic arrest, cytokinesis failure, and micronuclei formation in auroraB and esco2 mutants.
- Predictive Value: Facilitates statistical quantification of mitotic duration and defect frequency, aiding portfolio triage based on mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (H2A.F/Z-EGFP and mCherry-CAAX labeled embryos) suitable for downstream compound screening and pharmacological perturbation studies.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of mitotic duration, division frequency, and defect rates, providing standardized metrics for assay reproducibility.
- Scalability & Reuse: Optimized embedding and imaging workflow allows repeated use across mutant lines and treatment conditions, supporting platform scalability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models chromosomal outcomes such as aneuploidy, polyploidy, and micronuclei formation linked to cancer and birth defects.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mitotic observations to preclinical validation by enabling longitudinal tracking of cell fate and division fidelity.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying how genetic or pharmacological perturbations affect mitotic progression in a vertebrate context.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, offering a vertebrate-based readout for mitotic fidelity that informs biological de-risking at multiple stages.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and hypothesis testing by visualizing real-time chromosome segregation in auroraB and esco2 mutant embryos.
- Screening: Delivers assay-ready, fluorescently labeled embryos with standardized imaging parameters for compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Provides Z-stacked, time-lapse data enabling quantification of mitotic duration, interval timing, and defect frequency for comparative condition analysis.
- Translational Research: Links mitotic defects to chromosomal outcomes (e.g., micronuclei) with direct relevance to carcinogenic and developmental pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across genetic models, drug treatments, and developmental stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitotic drug target validation through direct observation of chromosomal dynamics.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible imaging workflows with defined parameters for Z-stack, time interval, and laser settings across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing vertebrate-based functional readouts that reduce late-stage biological risk in oncology and developmental disorder programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantified mitotic fidelity in disease-relevant mutant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish breeding, microinjection, and fluorescent embryo screening.
- Dependent on confocal microscopy with 60X/1.4 NA objective, environmental control, and laser tuning expertise to minimize phototoxicity.
- Necessitates standardization of embryo orientation, agarose embedding, and tricaine anesthesia protocols across users.
- Involves adaptation considerations for different mutant lines, pharmacological agents, and developmental timepoints.
- Practical limitations include embryo viability during extended imaging and the need to balance laser exposure with signal quality.
