Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Het algemene doel van deze procedure is om de getrouwheid van chromosoomsegregatie tijdens de mitose in een levend zebravisembryo te monitoren door gebruik te maken van fluorescentielabelled chromatine en celmembraaneiwitten, die worden vastgelegd met behulp van confocal microscopie met een hoge resolutie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de mitose, zoals hoe mitotische defecten leiden tot een ontwikkelingsdefect of tumorvorming in een levend gewerveld organisme? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de mitose observeren in een levend gewerveld organisme, waardoor fysiologisch relevante gegevens kunnen worden verzameld.

Na het kruisen van volwassen zebravissen en het injecteren van de eitjes met H2A. F/Z-EGFP en/of pCS2 mCherry-CAAX RNA, ongeveer twee uur vóór de beeldvorming, wordt een fluorescent dissectiemicroscoop gebruikt om GFP-positieve embryo's te identificeren. Breng de heldergroene, GFP-expresserende embryo's over naar een nieuwe Petri-schaal van 100 bij 15 millimeter met E3-blauw medium.

Kook een voorraadoplossing van 1% low-melt agarose in E3 blue. Verdeel drie milliliter van de gesmolten agarose over een kweekbuis van 17 bij 100 millimeter. Houd de agarose warm door de kweekbuis in een waterbad van 42 °C te plaatsen totdat deze klaar is voor gebruik.

Zorg voor 15-millimolair tricaine, gescreende embryo's, low-melt agarose, E3 blue, een glazen kweekschaal van 35 millimeter met dekglasbodem en een dissectiemicroscoop. Verwijder vervolgens met een pincet (nummer vijf) voorzichtig de chorions van drie embryo's en plaats de embryo's in een aparte houder om te worden geanestheseerd. Voeg daarna met een transferpipet drie druppels 15-millimolair tricaine toe aan de schaal met de embryo's en vijf milliliter medium.

Voeg drie tot vier druppels van een 15-millimolaire tricaine-oplossing toe aan de buis met 1% gesmolten agarose. Wanneer de embryo's voldoende zijn verdoofd, worden de verdoofde embryo's met een P200 Pipetman, waarvan één centimeter van de pipetpunt is afgesneden, overgebracht naar de schaaltje met dekglasbodem. Verwijder alle overtollige E3 blue tricaine-oplossing.

Voeg langzaam vijf tot 10 µL van de low-melt-agarose-tricaine-oplossing boven de embryo's toe, waarbij elke druppel gescheiden wordt gehouden om te voorkomen dat de embryo's naar elkaar toe drijven. Gebruik vervolgens een 21-gauge naald van anderhalf inch om de embryo's in de agarose voorzichtig in de gewenste positie te brengen; richt het gebied van interesse zo dicht mogelijk bij het dekglas als er een omgekeerde microscoop wordt gebruikt. Vanwege mogelijke verschuivingen kan het nodig zijn om elk embryo opnieuw te controleren om er zeker van te zijn dat ze in de vereiste positie blijven.

Dit moet mogelijk meerdere keren worden herhaald tot de ideale positie is bereikt terwijl de agar stolt. Gebruik na enkele minuten een naald om een klein stukje agarose kapot te maken om te testen of het gestold is. Wanneer dit van de druppel kan worden weggetrokken, gebruik dan extra low-melt agarose om een koepel over de ingebedde embryo's te vormen, zodat het gehele dekglas wordt bedekt.

Terwijl de agarose stolt, bereidt u drie milliliter E3 blue medium met vijf druppels 15-millimolaire tricaine, om over de ingebedde embryo's te plaatsen tijdens de beeldvorming. Om 5D confocale beeldvorming van levende zebravissenembryo's uit te voeren, opent u de software voor beeldvorming en stelt u de microscoop in op een 60X lens met een numerieke apertuur van 1,4. Breng immersieolie aan op de lens en plaats de kweekschaal in de objectglashouder op de microscooptafel.

Centreer met de asbesturing het embryo van belang boven de objectieflens en breng de lens omhoog tot deze de kweekschaal raakt. Giet E3 blue en tricaine-oplossing over de in agar ingebedde embryo's. Klik vervolgens op het icoon van de oculairpoort om de embryo's via het oculair te bekijken.

Schakel de selectie voor de Eye Port uit en kies View, Acquisition Controls, A1 Scan Area om de tool A1 Scan Area te openen. Selecteer het GFP-kanaal, start de scan opnieuw en focus op een interessegebied dicht bij het dekglas. Stop de scan, selecteer de GFP- en mCherry-kanalen en stel de optie voor lijnmiddeling in op normaal.

Kies nu View, Acquisition Controls, ND Acquisition, om de A1 ND Acquisition-tool te openen. Start het scannen. Positioneer vervolgens de embryo's met de ascontroller zodanig dat het scangebied zoveel mogelijk door de zebravis wordt gevuld.

Stel de bovenste limiet van de Z-stack in op het punt waar de cellen buiten focus raken, waarbij een extra ruimte van drie micrometers boven het monster wordt gelaten voor groei en celbeweging. Stel vervolgens de onderste limiet in op het punt waar de cellen niet langer zichtbaar zijn, en stel de Z-interval stapgrootte in op twee micrometers. Pas voor de hier gedemonstreerde experimenten het vermogen van de imaginglaser, de HV of gain, en de offset-niveaus respectievelijk aan zoals hieronder vermeld.

Zodra de parameters zijn ingesteld, schakelt u de scan uit om onnodige laserblootstelling te voorkomen, wat kan leiden tot fototoxiciteit en fotobleken van het monster. Selecteer nu het icoon voor 2X lijnmiddeling, wat de beste beeldkwaliteit en de snelste scantijd oplevert. Selecteer het juiste tijdsinterval en de tijdsduur die nodig zijn voor het experiment.

Voor celdelingen van het wildtype zijn tijdsintervallen van twee minuten gedurende een periode van twee uur adequaat om de mitotische duur te bepalen. Delingen die het spoelfiguur-controlepunt (spindle assembly checkpoint) langer dan dertig minuten activeren, zijn geschikter voor intervallen van vier tot vijf minuten gedurende vier uur, om de fluorescentie te behouden, zoals hier wordt aangetoond. Om het bestand automatisch op te slaan terwijl het wordt verworven, vinkt u het vakje Opslaan naar bestand aan en geeft u het bestand een naam.

Controleer ten slotte of alle parameters correct zijn ingesteld en klik op Run Now. Nadat de acquisitie is voltooid, klikt u op het Volume Threshold-pictogram om het bestand in een driedimensionaal formaat te bekijken. Deze figuur demonstreert de mogelijkheid om vele celdelingen waar te nemen met een breed gezichtsveld van een AB wild-type zebravisstaart.

De celdelingen zijn aangeduid met asterisken. De overeenkomstige video wordt hier getoond. Gemiddeld werden 50 delende cellen in AB en 30 delende cellen in de aurora B-mutant waargenomen.

Om rekening te houden met het verminderde aantal mitotische cellen dat is afgebeeld in het aurora B-mutante embryo, werd de ratio van mitotische cellen ten opzichte van het aantal afgebeelde cellen berekend; dit suggereert dat er in de aurora B-mutante embryo's niet minder cellen door de mitose gaan, maar dat er simpelweg een kleiner totaal aantal cellen is afgebeeld. Om de mitotische duur te kwantificeren, wordt het aantal tijdsintervallen dat één celdeling beslaat vermenigvuldigd met het tijdsinterval tussen elke Z-stack. Zoals in deze grafiek blijkt, is de gemiddelde delingstijd van het AB wild-type 25 minuten, en 58 minuten voor de aurora B-mutant.

Zoals te zien is in wild-type embryo's, kan elke mitotische fase worden onderscheiden. Er worden echter mitotische defecten waargenomen in het aurora B mutant embryo, waaronder mitotische arrestatie en mislukte cytokinese, wat resulteert in een binucleaire cel en de daaropvolgende vorming van micronuclei, wat de toegenomen delingstijd die in deze mutant is gemeten, ondersteunt. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één uur worden uitgevoerd, vanaf het screenen van de embryo's tot het instellen van de parameters van de confocale microscoop.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de context van het betreffende experiment, met name wat betreft het interessegebied, de tijdsduur, het tijdsinterval en de Z-diepte. Dit helpt om de efficiëntie te maximaliseren en fotobleking en fototoxiciteit te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals chromosoomspreidingen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de oorzaak van de waargenomen mitotische defecten, of kan een behandeling met een geneesmiddel worden toegepast om de effecten op de mitotische progressie, duur of het lot van de cel te bepalen.

Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de biologie om mitose in de context van ontwikkelingsbiologie en kankerbiologie te bestuderen met behulp van zebravisjes. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u zebravisembryo's kunt inbedden, live beelden van mitose kunt vastleggen en de mitotische frequentie, duur en het lot van de cellen kunt analyseren. Vergeet niet dat werken met krachtige lasers en fluorescent licht schadelijk kan zijn voor de ogen; neem daarom altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het vermijden van direct oogcontact met de lasers, tijdens het uitvoeren van deze procedure.