Name: Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer mitotische deling observeren in levende zebravisembryo's met behulp van fluorescent gelabelde chromatine en celmembraaneiwitten. Deze methode maakt gedetailleerde studie van chromosoomsegregatie en mitotische defecten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Kristen Kwan voor de pCS2-H2A.F/Z-EGFP en pCS2-mCherry-CAAX vectoren. We danken Chris Rodesch voor het begeleiden van ons bij live beeldvorming bij zebravis. We danken Shawn Williams, Erik Malarkey en Brad Yoder voor hun hulp bij confocale beeldvorming bij UAB en het High Resolution Imaging Facility bij UAB. Het High Resolution Imaging Facility wordt ondersteund door de UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) en het Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. wordt ondersteund door het National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), en pilotgrants van American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) en de UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. wordt ondersteund door de Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. In vitro transcriptie <ol><li> Lineariseren pCS2-H2A.F / Z-EGFP en / of pCS2-mCherry CAAX-vectoren door NotI restrictie-enzym digest 31. Gebruik van een RNA in vitro transcriptie kit genereren 5 &#39;afgedekte mRNA uit elke sjabloon, volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Zuiver het capped mRNA met een zuiveringskit. Volg de instructies van de fabrikant. Elueer met RNase-vrij H2O </li><li> Het gehalte aan RNA door absorptie bij 260 nm met een spectrofotometer. (OD 260 x verdunningsfactor x 40 gg / ml). </li><li> Verdun het RNA 100 ng / ul per H2A.F / Z-EGFP en mCherry-CAAX met RNase-vrij H2O Als de RNA-concentratie te laag is, zal de fluorescentie verminderd of afwezig zijn. Brighter monsters zal de bezorgdheid over fototoxiciteit en fotobleken verminderen. Anderzijds kan teveel RNA toxisch zijn en / of kan uit doelwit effecten. Opmerking: Bewaar de overgeblevengezuiverde mRNA in -80 ° C vriezer. </li></ol> 2. zebravis Breeding, Embryo Collection, en mRNA Injection 36-38 <ol><li> Monteer kweekbakken met een barrière om de tank te scheiden in twee regio&#39;s en vul elk kweekbak met aquacultuur systeem water dat gebruikt wordt in de zebravis faciliteit. </li><li> Om voortijdige kweken voor het fokken voorkomen, de nacht plaats twee mannetjesvissen aan één zijde van de barrière en twee vrouwelijke vissen aan de andere kant. </li><li> De volgende dag ontdooien de eerder bereide mRNA mengsel op ijs. Vervang het water in de fokkerij tanks met verse aquacultuur systeem water en verwijder de barrières. Onmiddellijk na de barrières worden getrokken, verwarm een ​​spuitgietmatrijs tot 28,5 ° C en het opzetten van de uitrusting voor micro-injectie. Opmerking: Voor informatie over injectie matrijzen, verwijzen wij u naar Gerlach 36. </li><li> Eieren verzamelen om de 10 - 15 min met behulp van een theezeefje en spoel de eieren in een schone 100 x 15 mm petrischaal met E3 Blue (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% methyleenblauw). E3 Blue wordt gebruikt om schimmelgroei te voorkomen en te zorgen voor een goede ontwikkeling van larvale vis. Voor meer informatie over voortplanting en embryo&#39;s worden verzameld, verwijzen naar Gerlach 36 en Porazinkski 37. </li><li> Embed eencellige embryo opgevoerd in een voorverwarmde spuitgietmatrijs en spuit het RNA in de dooier in de gewenste hoeveelheid embryo (figuur 1A). Account voor natuurlijke embryonale sterfte en onbevruchte embryo&#39;s door het uitvoeren van embryonale injecties op 15% meer embryo&#39;s dan nodig is voor het experiment. Voor aanvullende informatie over de micro-injectie van de zebravis embryo&#39;s, verwijzen wij u naar Gerlach 36 en Porazinkski 37. LET OP: Voor het eerste gebruik van mRNA, het uitvoeren van een dosis-curve analyse om de optimale dosering voor fluorescentie en levensvatbaarheid (gedefinieerd als geen grove defecten in de ontwikkeling tot 5 DPF) voorafgaand aan het uitvoeren 5D beeldvorming te bepalen. 150-200 ng / ulgeïnjecteerd in embryo&#39;s is vaak de optimale concentratie, daarom is het een goed uitgangspunt voor de uiteindelijke concentratie. </li><li> Zorgvuldig te extraheren de geïnjecteerde embryo&#39;s uit de mal met behulp van een gemodificeerde 9 &quot;glazen Pasteur pipet. Om de pipet te wijzigen, smelt het einde met behulp van een bunsenbrander totdat het een bal vormt. </li><li> Plaats de geïnjecteerde embryo&#39;s in een 100 x 15 mm petrischaal in E3 Blue en huis in een 28,5 ° C incubator. </li><li> Zes uur na de injectie, verwijder alle dode of onbevruchte embryo&#39;s uit de platen en voeg schoon E3 Blue. Het huis van de embryo&#39;s bij 28,5 ° C. </li></ol> 3. Voorbereiding and Embedding Live zebravis embryo&#39;s for Imaging (Figuur 1B) <ol><li> Twee uur voor beeldvorming, scherm de geïnjecteerde embryo&#39;s voor GFP met behulp van een fluorescentie stereomicroscoop. Plaats helder groen-GFP tot expressie embryo&#39;s in een nieuwe 100 x 15 mm petrischaal met E3 Blue. </li><li> Kook een voorraad oplossing van 1% low melt agarose door het toevoegen van 1 g low melt agarose tot 100 ml van de E3 Blue. Na gebruik van de agarose, hebben betrekking op de kolf in aluminiumfolie. De voorraad oplossing blijft nuttig voor maximaal een maand. </li><li> Aliquot 3 ml van het gesmolten agar in een cultuur buis 17 x 100 mm. Houd de agarose warm door de cultuurbuis in een 42 ° C waterbad tot aan gebruik. Bereid een 15 mM tricaïne oplossing in gedemineraliseerd water om de zebravis embryo&#39;s 36 verdoven. OPMERKING: Indien beeldvorming in eerdere tijdstippen gewenst, kan de concentratie van agar verminderd zo laag als 0,3% 39. </li><li> Breng de 15 mM tricaïne, gescreend embryo&#39;s, low melt agarose, E3 Blue, en een 35 mm glazen dekglaasje bodem cultuur schotel naar een dissectie lichtmicroscoop. verwijderen chorion de embryo&#39;s zorgvuldig met # 5 pincet. Doe dit voor drie embryo&#39;s. </li><li> Plaats de dechorionated embryo in een afzonderlijke container worden verdoofd. Het deksel van het dekglaasje onderste schaal wordt vaak gebruikt voor dit doel. Met behulp van een overdracht pipet, drie druppels (ongeveer 150 pl)van 15 mM tricaïne de schaal van 5 ml E3 blauw (bij gebruik van het deksel van het dekglaasje onderste schaal) of tot embryo voldoende zijn verdoofd. Bovendien, voeg 3-4 druppels (ongeveer 150-200 pl) van 15 mM tricaïne oplossing van de 1% gesmolten agarose buis. </li><li> Met behulp van een p200 pipet met 1 cm van de pipet tip afgesneden; overdracht van de narcose embryo&#39;s naar de-dekglaasje bodem schotel. Verwijder overtollig E3 Blue: tricaïne oplossing. </li><li> Voeg langzaam 5-10 pl laag smeltpunt agarose: tricaïne oplossing via embryo&#39;s, waarbij elke druppel apart te zorgen voor de embryo&#39;s niet per ongeluk dicht drift elkaar. Waarschuwing: Als de agarose te warm, zal het embryo aantasten. Een goede temperatuur de agar te handhaven op 42 ° C is. </li><li> Onder toepassing van een 21 G 1 ½ naald voorzichtig oriënteren het embryo in de agarose in de gewenste positie. Bij gebruik van een omgekeerde microscoop voor time-lapse imaging, oriënteren het interessegebied (ROI) zo dicht mogelijk bij het dekglaasje possible. Opmerking: Voor algemene doeleinden, het staartgebied vereenvoudigd het oriëntatie en duidelijkheid door de relatief dunne weefsel (Figuur 1A). Andere weefsels, zoals de epitheellaag rond de dooier en vin vouwen, kan worden gebruikt 28,29. Deze weefsels bieden grote helderheid, maar deze gebieden zijn slechts een paar cellagen dik. Ten behoeve van dit protocol is het gunstig om het beeld staartgebied zoveel celdelingen mogelijk te verwerven. </li><li> Laat een paar minuten voor de gedeeltelijke stolling van de agar. Gebruik de naald om elkaar te breken een klein stukje agar om zijn stolling te testen. Wanneer een stuk agar weg van de daling kan worden getrokken, gaat u door naar de volgende stap. </li><li> Bedek de hele dekglaasje met een lage melt agar vorming van een koepel over de embedded embryo&#39;s. Laat de agar te stollen alvorens het gerecht voor confocale beeldvorming (Figuur 1A). </li><li> Tijdens (duurt ongeveer 10 min) de agar stollingsproces, voor te bereiden 3 ml of E3 blauwe oplossing met vijf druppels (ongeveer 250 ui) 15 mM tricaïne via ingesloten embryo&#39;s geplaatst tijdens beeldvorming. </li></ol> 4. 5D Confocale beeldvorming van live zebravis embryo&#39;s 40,41 OPMERKING: Zie Ariga 40 en O&#39;Brien 41 voor meer informatie over het 5D beeldvorming uit te voeren met behulp van andere confocale systemen. Voor Z-interval, Z-stack, Z-diepte, tijd interval, en 5D definities zie figuur 1C. <ol><li> Open de imaging software en zet de microscoop om 60X NA 1.4 objectief. Solliciteer immersie olie aan de doelstelling lens en plaats de cultuur schotel in de dia houder op de microscoop podium. Met de asbesturing Centreer de embryo plaats boven de objectieflens en breng de objectieflens omhoog om de kweekschaal voldoen. </li><li> Klik op het oog stuk en over te schakelen naar het GFP-filter op de microscoop. Focus op de ROI. Focussen op het weefsel dichtst bij het dekglaasje zal offer de beste beeldvormende resultaten. </li><li> Verwijder de interlock. Selecteer de GFP en mCherry kanalen (vooraf ingestelde golflengten in software) en zet de lijn van gemiddeld optie om normaal. </li><li> Gebruik &quot;View / Acquisition Controls / A1 Scan Area&quot; commando om het gereedschap A1 Scangebied openen. </li><li> Te beginnen met scannen. Met de as controller plaatst het embryo waardoor het scangebied is gevuld met zoveel van de zebravis mogelijk. Het laservermogen hoeft niet optimaal op dit moment te zijn. Verlaag het laservermogen om onnodige fotobleken te voorkomen. </li><li> Gebruik de &quot;View / Acquisition Controls / ND overname&quot; commando om de ND overname bedieningspaneel te openen. </li><li> Beginnen met scannen naar de Z-stack parameters. Stel de Z-stack bovengrens waarbij de cellen niet in focus en ondergrens waarbij cellen niet meer toegankelijk. Zorgen voor een 3 urn ruimte boven het monster voor groei en cel beweging, die kan uitzetten in het beeldveld. De Z-stack voor de in deze pro cijferstocol onder een Z-diepte van 40 urn in het embryo staart. </li><li> Stel de Z-interval stapgrootte tot 2 urn. Gemiddeld een cel 10 micrometer in doorsnede; derhalve 2 urn produceert vijf intervallen van beeldgegevens te analyseren voor elke cel. OPMERKING: De diepte van de afbeelding kunnen worden verkregen afhankelijk van de Z interval. Z-resolutie wordt opgeofferd aan de totale diepte in de Z-dimensie te krijgen met het oog op het zo veel cellen ondergaan mitose mogelijk (grote Z-diepte). Het omgekeerde is waar, in dat, door de stap omvang afneemt, Z resolutie wordt verkregen, terwijl Z diepte wordt opgeofferd (kleine Z-diepte). </li><li> Pas de afbeelding laservermogen, HV, en offset niveaus. Voor de experimenten toonden in dit protocol, gebruikt u de volgende laservermogen, HV, en offset in te stellen op de overeenkomstige niveaus, respectievelijk voor het GFP-kanaal; 2-5, 120-140 en -9 tot -11. Voor de mCherry kanaal, gebruikt u de volgende laservermogen, HV, en offset niveaus, respectievelijk; 3-6, 120-140 en -3 naar-8. Zodra de parameters zijn ingesteld, schakelt u de scan om onnodige laser blootstelling die fototoxiciteit en fotobleken van het monster kan veroorzaken te voorkomen. </li><li> Selecteer de middeling icoon 2x lijn. &quot;No middeling&quot; produceert een korrelige afbeelding terwijl &quot;4x lijn van gemiddeld&quot; drastisch verhoogt de scantijd. Het gebruik van 2x lijn middeling biedt de beste beeldkwaliteit en de snelste scantijd. </li><li> Selecteer de juiste tijd interval en de tijdsduur die nodig is voor het experiment. Voor wildtype divisies, twee-minuten intervallen gedurende 2 uur is het beste voor het bepalen mitotische duur (gebruikt in figuren 1, 2, 3A en 3B). Scheidingen die de spileenheid checkpoint activeren langer dan 30 minuten zijn meer geschikt voor vijf minuten herhaald gedurende vier uur om fluorescentie te behouden zoals getoond in Figuur 3C. </li><li> Vink het vakje &quot;opslaan naar bestand&quot; en de naam van het bestand om het bestand automatisch op te slaan als het wordt overgenomen. Double check alle parameters correct zijn ingesteld en druk op &quot;start run&quot;. </li><li> Na de overname is voltooid, wordt het bestand in een driedimensionaal formaat bekijken, klik op het icoon volume drempel. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Gebruik van deze werkwijze kan men kernenvelop afbraak vorming van metafase plaat van microtubule-kinetochore attachments en scheiding van zusterchromatiden afleiden twee nieuwe cellen in vivo en in een tijdsafhankelijke wijze te vormen. Het vermogen om mitose observeren zebravis is voordelig ten opzichte van vaste monsters en celkweek systemen omdat de cellen worden afgebeeld in de natuurlijke fysiologie, het weefsel is transparant waardoor voor fluorescerende eiwitten voor gebruik, ontwikkelen zij relatief sn...

Mitose is een kritische cellulaire proces dat cruciaal is voor groei, differentiatie en regeneratie in een levend organisme. Bij nauwkeurige opstelling en replicatie van DNA in interfase wordt de cel klaargemaakt splitsen. De eerste fase van mitose, profase, geïnitieerd door activering van cycline B / Cdk1. Profase wordt gekenmerkt door condensatie van chromatine materiaal in chromosomen. Kernenvelop doorslag optreedt bij de overgang tussen profase en prometaphase. In prometafase, centrosomes, het kiemvormende centrum voor spindle vorming, beginnen te migreren naar tegengestelde polen terwijl de uitbreiding van microtubuli op zoek kinetochoor gehechtheid. Na bevestiging, conversies tot eind-on attachment microtubuli en trekkrachten oriënteren de chromosomen vormen van een metafaseplaat 1. Als alle chromosomen correct zijn aangesloten, wordt de spil montage checkpoint tevreden, cohesin ringen die de zusterchromatiden samen worden gesplitst, en microtubules in te korten om zus te trekkenchromatiden naar tegengestelde polen tijdens anafase 2,3. De eindfase telofase, omvat verlenging van de cel en hervorming van de kern envelop rond de twee nieuwe kernen. Cytokinese het splitsingsproces door het scheiden van het cytoplasma van de twee nieuwe dochtercellen 4-6 voltooid. Wijziging van de belangrijkste mitotische trajecten (dat wil zeggen, assemblage van de spoel checkpoint, centrosome duplicatie, zuster-cohesie, enz.) Kan leiden tot metafase arrestatie, missegregation van de chromosomen en genomische instabiliteit 7-10. Uiteindelijk defecten in trajecten beheersen van mitose kunnen ontwikkelingsstoornissen en kanker, noodzakelijk visualisatie van mitose en de gebreken in een live, gewerveld dier, meercellig organisme 10-16 veroorzaken. Zebravis embryo&#39;s dienen als een grote modelorganisme voor live-imaging als gevolg van de transparante weefsel, het gemak van micro-injectie, en een snelle ontwikkeling. Met behulp van de zebravis, de algemene doelstelling van dit manuscript is ombeschrijven een werkwijze voor levende 5D (afmetingen X, Y, Z, tijd en golflengte) beeldvorming van mitose 17 (figuur 1C). Het gebruik van mutante zebravis defectief in verschillende mitotische paden tonen de gevolgen van dergelijke defecten. Voor dit protocol, werden Aurora B en Esco2 mutanten gekozen om deze gebreken te illustreren. Aurora B is een kinase die deel uitmaakt van het chromosoom passagier complex (CPC) betrokken bij de vorming en spindel microtubuli bevestiging. Het is ook vereist voor splitsing furrow formatie in cytokinese 18,19. In de zebravis, Aurora B-deficiëntie leidt tot defecten in vore inductie, cytokinese, en chromosoom segregatie 20. Esco2, daarentegen, is een acetyltransferase dat essentieel is voor zuster-cohesie 21,22. Het acetyleert cohesin op de SMC3 gedeelte van de ring dus cohesin stabiliseren om een goede chromosoom segregatie te verzekeren bij de metafase-anafase transitie 23. Verlies van Esco2 in de zebravis leidt tot chromosome missegregation, voortijdige zusterchromatide scheiding, genomische instabiliteit, en p53-afhankelijke en onafhankelijke apoptose 24,25. Door de beschikbaarheid, auroraB hi1045 en esco2 hi2865 mutante zebravis (hierna aurB m / m en esco2 m / m, respectievelijk) gebruikt deze techniek 25-27 illustreren. Koppeling confocale microscopie met TL-gelabelde cel machines heeft de onderzoekers in staat om te visualiseren chromatine en celmembraan dynamiek tijdens de mitose 25,28,29. Fluorescent-gemerkte histonen van oudsher gebruikt om chromatine te visualiseren. Histonen kerneiwitten uit vier paren (H2A, H2B, H3 en H4) die van het nucleosoom structuur die chromosomen 30 samenstelt zijn. Terwijl H2B is misschien wel de meest gebruikte histone voor fluorescerende eiwitten inmuis en celkweek, het gebruik van histon 2A, Familie Z (H2A.F / Z) heeft goed gebleken voor gebruik in de zebravis 31,32. Concanavaline A en caseïne kinase 1-gamma bijvoorbeeld lokaliseren aan het celmembraan en eerder zijn effectief in het visualiseren van de celmembraan in zee-egels en Drosophila 33,34 weergegeven. Andere studies hebben aangetoond dat de CAAX fluorescerend gemerkt eiwit labelt de celmembraan en succesvol in zebravis 31 was. CAAX is een motief dat door post-translationeel modificerende enzymen zoals farnesyltransferases en geranylgeranyltransferases wordt herkend. Wijzigingen van deze enzymen veroorzaken eiwitten membraangebonden lopen, waarbij het ​​labelen van de celmembraan 35. Door de voorgebruik met zebravis dit protocol kozen H2A.F / Z en CAAX om chromatine en het celmembraan label. Toepassing van deze methode kan de onderzoeker mitose controleren op individueel celniveau individuele chromosoom observerendynamiek, evenals gelijktijdig volgen meerdere celdelingen die invloed weefseldifferentiatie en ontwikkeling. Dit artikel zal zich richten op de beeldvorming van de dynamiek van chromosoom segregatie tijdens de mitose op het individuele celniveau. Binnen dit manuscript wordt de mogelijkheid om meerdere mitotische delingen waarnemen, berekenen divisie tijd, en het ontcijferen van de mitotische fenotypes worden geïllustreerd en besproken. Door deze parameters, fysiologisch relevante gegevens kunnen worden verzameld en toegepast op verscheidene ziektetoestanden die door mitotische afwijkingen.

<table><tbody><tr><td>pCS2 vectors</td><td>Gift from K. Kwan</td><td></td><td>Voor plasmide van belang</td></tr><tr><td>NotI-HF restrictie-enzym</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>Voor restrictiedigestie van plasmide</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>Voor in vitro transcriptie</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Voor het zuiveren van mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri schotels</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Voor het huisvesten van embryo's</td></tr><tr><td>microinjectievorm</td><td>zelfgemaakt</td><td></td><td>Voor het vasthouden van embryo's tijdens micro-injectie</td></tr><tr><td>Agarose II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>Voor het insluiten van embryo's</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>Voor het anestheseren van embryo's</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Voor embryowater (E3 Blue), opgelost in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>Voor embryowater (E3 Blue), opgelost in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Calciumchloride dihydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>Voor embryowater (E3 Blue), opgelost in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>Voor embryowater (E3 Blue), opgelost in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Methyleenblauw hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>Voor embryowater (E3 Blue), opgelost in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>100 mm kweekbuis</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>Voor gesmolten agar</td></tr><tr><td>35 mm glazen dekglasbodemkweekschaal</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C</td><td>Nr. 0, 20 mm glas, Voor het insluiten van embryo's</td></tr><tr><td>#5 pincetten</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>Voor het ontdoppen van embryo's</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 gauge naald</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Voor het positioneren van embryo's in agar</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>Voor het screenen en insluiten van embryo's, elke dissectiemicroscoop doet het</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>Voor time-lapse beeldvorming</td></tr><tr><td>Confocale software</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>Voor beeldverwerving en verwerking</td></tr></tbody></table>

observeren mitotische deling en dynamiek in een live zebravis embryo

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitose is essentieel voor groei en differentiatie organismal. Het proces is zeer dynamisch en vereist besteld gebeurtenissen om een ​​goede chromatine condensatie, microtubule-kinetochoor gehechtheid, chromosoom segregatie en cytokinese bereiken in een klein tijdsbestek. Fouten in het delicate proces kan leiden tot menselijke ziekte, geboorteafwijkingen en kanker. Traditionele benaderingen onderzoek naar menselijke mitotische ziektebeelden zijn vaak afhankelijk van celkweek systemen, die de natuurlijke fysiologie en ontwikkelingsstoornissen / weefsel-specifieke context voordelig ontbreekt bij het bestuderen van ziekten bij de mens. Dit protocol overwint vele hindernissen door het verstrekken van een manier om te visualiseren, met een hoge resolutie, chromosoom dynamiek in een gewervelde systeem, de zebravis. Dit protocol zal detail een aanpak die kan worden gebruikt om dynamische beelden van delende cellen, waaronder verkrijgen: in vitro transcriptie, zebravis fokken / verzamelen, embryo inbedding en time-lapse imaging. Optimalisatie en modifnicatieorganisatie van dit protocol worden ook onderzocht. Met behulp van H2A.F / Z-EGFP (labels chromatine) en mCherry-CAAX (labels celmembraan)-mRNA geïnjecteerde embryo&#39;s, mitose in AB wild-type, auroraB hi1045 en esco2 hi2865 mutant zebravis wordt gevisualiseerd. Hoge resolutie live-imaging in de zebravis maakt het mogelijk om meerdere mitoses observeren om statistisch kwantificeren mitotische defecten en de timing van de progressie van de mitose. Bovendien, de observatie van kwalitatieve aspecten die oneigenlijk mitotische processen (dat wil zeggen, congression gebreken, missegregation chromosomen, etc.) en oneigenlijk chromosomale uitkomsten (dwz, aneuploïdie, polyploïdie, micronuclei, etc.) definiëren in acht worden genomen. Deze test kan worden toegepast voor de waarneming van weefseldifferentiatie / ontwikkeling en vatbaar is voor het gebruik van mutante zebravis en farmacologische middelen. Visualisatie van de manier waarop defecten in mitose leiden tot kanker en ontwikkelingsstoornissen zal sterkverbeteren begrip van de pathogenese van de ziekte.

Figuur 2 toont het vermogen om vele celdelingen behulp van een breed gezichtsveld van een AB wild-type zebravis staart observeren. Meer dan zeven mitotische cellen worden afgebeeld in een 14 min tijdsbestek (Film 1). Binnen de twee hr tijdsverloop, werden meer dan 40 mitotische gebeurtenissen vastgelegd. Gemiddeld werden 50 delende cellen waargenomen in de AB en 30 delende cellen in aur B m / m embryo (figuur 2B).</st...

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Het algemene doel van deze procedure is om de getrouwheid van chromosoomsegregatie tijdens de mitose in een levend zebravisembryo te monitoren door gebruik te maken van fluorescentielabelled chromatine en celmembraaneiwitten, die worden vastgelegd met behulp van confocal microscopie met een hoge resolutie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de mitose, zoals hoe mitotische defecten leiden tot een ontwikkelingsdefect of tumorvorming in een levend gewerveld organisme? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de mitose observeren in een levend gewerveld organisme, waardoor fysiologisch relevante gegevens kunnen worden verzameld.Na het kruisen van volwassen zebravissen en het injecteren van de eitjes met H2A. F/Z-EGFP en/of pCS2 mCherry-CAAX RNA, ongeveer twee uur vóór de beeldvorming, wordt een fluorescent dissectiemicroscoop gebruikt om GFP-positieve embryo's te identificeren. Breng de heldergroene, GFP-expresserende embryo's over naar een nieuwe Petri-schaal van 100 bij 15 millimeter met E3-blauw medium.Kook een voorraadoplossing van 1% low-melt agarose in E3 blue. Verdeel drie milliliter van de gesmolten agarose over een kweekbuis van 17 bij 100 millimeter. Houd de agarose warm door de kweekbuis in een waterbad van 42 °C te plaatsen totdat deze klaar is voor gebruik.Zorg voor 15-millimolair tricaine, gescreende embryo's, low-melt agarose, E3 blue, een glazen kweekschaal van 35 millimeter met dekglasbodem en een dissectiemicroscoop. Verwijder vervolgens met een pincet (nummer vijf) voorzichtig de chorions van drie embryo's en plaats de embryo's in een aparte houder om te worden geanestheseerd. Voeg daarna met een transferpipet drie druppels 15-millimolair tricaine toe aan de schaal met de embryo's en vijf milliliter medium.Voeg drie tot vier druppels van een 15-millimolaire tricaine-oplossing toe aan de buis met 1% gesmolten agarose. Wanneer de embryo's voldoende zijn verdoofd, worden de verdoofde embryo's met een P200 Pipetman, waarvan één centimeter van de pipetpunt is afgesneden, overgebracht naar de schaaltje met dekglasbodem. Verwijder alle overtollige E3 blue tricaine-oplossing.Voeg langzaam vijf tot 10 µL van de low-melt-agarose-tricaine-oplossing boven de embryo's toe, waarbij elke druppel gescheiden wordt gehouden om te voorkomen dat de embryo's naar elkaar toe drijven. Gebruik vervolgens een 21-gauge naald van anderhalf inch om de embryo's in de agarose voorzichtig in de gewenste positie te brengen; richt het gebied van interesse zo dicht mogelijk bij het dekglas als er een omgekeerde microscoop wordt gebruikt. Vanwege mogelijke verschuivingen kan het nodig zijn om elk embryo opnieuw te controleren om er zeker van te zijn dat ze in de vereiste positie blijven.Dit moet mogelijk meerdere keren worden herhaald tot de ideale positie is bereikt terwijl de agar stolt. Gebruik na enkele minuten een naald om een klein stukje agarose kapot te maken om te testen of het gestold is. Wanneer dit van de druppel kan worden weggetrokken, gebruik dan extra low-melt agarose om een koepel over de ingebedde embryo's te vormen, zodat het gehele dekglas wordt bedekt.Terwijl de agarose stolt, bereidt u drie milliliter E3 blue medium met vijf druppels 15-millimolaire tricaine, om over de ingebedde embryo's te plaatsen tijdens de beeldvorming. Om 5D confocale beeldvorming van levende zebravissenembryo's uit te voeren, opent u de software voor beeldvorming en stelt u de microscoop in op een 60X lens met een numerieke apertuur van 1,4. Breng immersieolie aan op de lens en plaats de kweekschaal in de objectglashouder op de microscooptafel.Centreer met de asbesturing het embryo van belang boven de objectieflens en breng de lens omhoog tot deze de kweekschaal raakt. Giet E3 blue en tricaine-oplossing over de in agar ingebedde embryo's. Klik vervolgens op het icoon van de oculairpoort om de embryo's via het oculair te bekijken.Schakel de selectie voor de Eye Port uit en kies View, Acquisition Controls, A1 Scan Area om de tool A1 Scan Area te openen. Selecteer het GFP-kanaal, start de scan opnieuw en focus op een interessegebied dicht bij het dekglas. Stop de scan, selecteer de GFP- en mCherry-kanalen en stel de optie voor lijnmiddeling in op normaal.Kies nu View, Acquisition Controls, ND Acquisition, om de A1 ND Acquisition-tool te openen. Start het scannen. Positioneer vervolgens de embryo's met de ascontroller zodanig dat het scangebied zoveel mogelijk door de zebravis wordt gevuld.Stel de bovenste limiet van de Z-stack in op het punt waar de cellen buiten focus raken, waarbij een extra ruimte van drie micrometers boven het monster wordt gelaten voor groei en celbeweging. Stel vervolgens de onderste limiet in op het punt waar de cellen niet langer zichtbaar zijn, en stel de Z-interval stapgrootte in op twee micrometers. Pas voor de hier gedemonstreerde experimenten het vermogen van de imaginglaser, de HV of gain, en de offset-niveaus respectievelijk aan zoals hieronder vermeld.Zodra de parameters zijn ingesteld, schakelt u de scan uit om onnodige laserblootstelling te voorkomen, wat kan leiden tot fototoxiciteit en fotobleken van het monster. Selecteer nu het icoon voor 2X lijnmiddeling, wat de beste beeldkwaliteit en de snelste scantijd oplevert. Selecteer het juiste tijdsinterval en de tijdsduur die nodig zijn voor het experiment.Voor celdelingen van het wildtype zijn tijdsintervallen van twee minuten gedurende een periode van twee uur adequaat om de mitotische duur te bepalen. Delingen die het spoelfiguur-controlepunt (spindle assembly checkpoint) langer dan dertig minuten activeren, zijn geschikter voor intervallen van vier tot vijf minuten gedurende vier uur, om de fluorescentie te behouden, zoals hier wordt aangetoond. Om het bestand automatisch op te slaan terwijl het wordt verworven, vinkt u het vakje Opslaan naar bestand aan en geeft u het bestand een naam.Controleer ten slotte of alle parameters correct zijn ingesteld en klik op Run Now. Nadat de acquisitie is voltooid, klikt u op het Volume Threshold-pictogram om het bestand in een driedimensionaal formaat te bekijken. Deze figuur demonstreert de mogelijkheid om vele celdelingen waar te nemen met een breed gezichtsveld van een AB wild-type zebravisstaart.De celdelingen zijn aangeduid met asterisken. De overeenkomstige video wordt hier getoond. Gemiddeld werden 50 delende cellen in AB en 30 delende cellen in de aurora B-mutant waargenomen.Om rekening te houden met het verminderde aantal mitotische cellen dat is afgebeeld in het aurora B-mutante embryo, werd de ratio van mitotische cellen ten opzichte van het aantal afgebeelde cellen berekend; dit suggereert dat er in de aurora B-mutante embryo's niet minder cellen door de mitose gaan, maar dat er simpelweg een kleiner totaal aantal cellen is afgebeeld. Om de mitotische duur te kwantificeren, wordt het aantal tijdsintervallen dat één celdeling beslaat vermenigvuldigd met het tijdsinterval tussen elke Z-stack. Zoals in deze grafiek blijkt, is de gemiddelde delingstijd van het AB wild-type 25 minuten, en 58 minuten voor de aurora B-mutant.Zoals te zien is in wild-type embryo's, kan elke mitotische fase worden onderscheiden. Er worden echter mitotische defecten waargenomen in het aurora B mutant embryo, waaronder mitotische arrestatie en mislukte cytokinese, wat resulteert in een binucleaire cel en de daaropvolgende vorming van micronuclei, wat de toegenomen delingstijd die in deze mutant is gemeten, ondersteunt. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één uur worden uitgevoerd, vanaf het screenen van de embryo's tot het instellen van de parameters van de confocale microscoop.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de context van het betreffende experiment, met name wat betreft het interessegebied, de tijdsduur, het tijdsinterval en de Z-diepte. Dit helpt om de efficiëntie te maximaliseren en fotobleking en fototoxiciteit te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals chromosoomspreidingen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de oorzaak van de waargenomen mitotische defecten, of kan een behandeling met een geneesmiddel worden toegepast om de effecten op de mitotische progressie, duur of het lot van de cel te bepalen.Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de biologie om mitose in de context van ontwikkelingsbiologie en kankerbiologie te bestuderen met behulp van zebravisjes. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u zebravisembryo's kunt inbedden, live beelden van mitose kunt vastleggen en de mitotische frequentie, duur en het lot van de cellen kunt analyseren. Vergeet niet dat werken met krachtige lasers en fluorescent licht schadelijk kan zijn voor de ogen; neem daarom altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het vermijden van direct oogcontact met de lasers, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Processen als proliferatie, patroon, differentiatie en axon begeleiding kan gemakkelijk worden gemodelleerd in de zebravis ruggenmerg. In dit artikel beschrijven we een montageprocedure voor zebravis embryo's die visualisatie van deze gebeurtenissen optimaliseert.

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: Analyse van Spinal Cord Development

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Hier presenteren we een veelzijdige montagemethode die langetermijn tijds-gelaps beeldvorming mogelijk maakt van de ontwikkeling van het achterste lichaam van levende zebravisembryo's zonder de normale ontwikkeling te verstoren.

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Hier, laten we het proces van het creëren van een cellulaire elektrische spanning verslaggever zebrafish lijn om te visualiseren van embryonale ontwikkeling, beweging, en vis tumor cellen in vivo.

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

We demonstreren een methode die gebruik maakt van snelle confocale scanscopie om live beeldvorming uit te voeren van microgliacellen in het zich ontwikkelende optische tectum van zebravissen, waardoor de dynamiek van deze cellen in vivo kan worden geanalyseerd.

Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

Leer mitotische deling observeren in levende zebravisembryo's met behulp van fluorescent gelabelde chromatine en celmembraaneiwitten. Deze methode maakt gedetailleerde studie van chromosoomsegregatie en mitotische defecten mogelijk.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Meer video's verkennen