Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie

Het algemene doel van deze fluorescentie in situ hybridisatietechniek is om het aantal en de lengte van telomeren in C.Elegans beknopt te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over tumorregeneratie, alternatieve verlenging van telomeren en cellulaire senescentie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de procedures beknopt zijn en de telomeren in minder dan 24 uur gevisualiseerd en gekwantificeerd kunnen worden.

Verzamel de drachtige volwassen wormen samen met een kleine hoeveelheid vloeibaar medium zonder debris in een buis van 15 milliliter. Was de wormen nu drie keer als volgt. Voeg M9-buffer toe tot een totaal volume van 15 milliliters.

Centrifuge de buis vervolgens 3 minuten bij 300 G en verwijder de vloeistof boven het pellet met wormen. Herhaal dit proces vervolgens. Als de wormen na de centrifugatie blijven drijven, verminder dan de rem van de centrifuge.

Laat de wormen na de derde wasbeurt in 5 milliliters M9 achter. Voeg vervolgens 6,5 milliliters gedestilleerd water, twee milliliters hypochloriet en één milliliter vijf molar kaliumhydroxide toe. Laat de wormen drie minuten incuberen in deze bleekoplossing bij een agitatie van 50 RPM. Vortex de wormen vervolgens om ze open te scheuren en de eieren vrij te maken.

Zoek onder een dissectiemicroscoop naar de vrijgekomen eitjes. Als ze nog niet zijn vrijgekomen, zet de incubatie dan voort tot maximaal acht minuten. Als de wormen grotendeels zijn opgelost en de eitjes vrij zijn, vul de buis dan aan tot 15 milliliters met M9 en was de eitjes drie keer op dezelfde manier als de wormen eerder zijn gewassen.

Vul het volume van de gewassen eieren, waarvan het grootste deel van het M9 is verwijderd, aan tot 500 microliters met PBST, en voeg vervolgens 500 microliters 4% PFA toe. Breng nu aliquoten van 40 microliter eieren in 2% PFA aan in de putjes van met polylysine gecoate glaasjes. Plaats de glaasjes vervolgens in een bevochtigingskamer en laat ze 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur.

Zorg voor dit protocol dat een aluminiumblok op droogijs is bewaard bij -80 °C. Zorg daarnaast dat methanol en aceton zijn bewaard bij -20 °C. Nadat de fixatiestap is voltooid, wordt het grootste deel van de PFA-oplossing van de objectglazen verwijderd, waarbij ongeveer 5 µL achterblijft.

Plaats vervolgens een tweede met polylysine gecoate objectglas over elk monsterglas, zodat de twee gecoate oppervlakken aan elkaar hechten en de weefsels in het putje worden ingesloten. Als er teveel fixatief aanwezig is, dep dit dan op met een tissue. Vries de objectglazen nu in door ze gedurende ten minste 15 minuten op het koude aluminiumblok te plaatsen.

Bereid ondertussen methanol- en acetonbaden op ijs voor de objectglazen. Zodra de objectglazen bevroren zijn, wordt een objectglas gedraaid om het monster door vriesbreuk los te maken. Gooi het bovenste objectglas weg en laat het onderste objectglas vijf minuten weken in ijskoude methanol.

Voer dit uit voor alle monsters. Bevriezingsbreuk maakt de penetratie van probes en antilichamen door de harde eierschaal mogelijk. Als de eieren succesvol zijn gebroken door bevriezing, zouden de eieren op beide objectglazen zichtbaar moeten zijn.

Na ten minste vijf minuten in methanol, verplaats de coupes naar koude aceton voor vijf minuten. Na nog eens vijf minuten worden de monsters drie keer gedurende vijf minuten per bad geweekt in PBST. Na de PBST-wasstappen kunnen de coupes enkele dagen worden bewaard in 100% ethanol bij vier graden celsius.

Voeg ter voortzetting 20 µL RNase-oplossing toe aan de monsterputjes en incubeer deze gedurende een uur bij 37 °C in een bevochtigde kamer. Was de objectglazen vervolgens twee keer gedurende 15 minuten per wasbeurt in 2x SSCT. Voeg na de twee wasbeurten 20 µL hybridisatie-oplossing toe aan de monsters en incubeer deze gedurende een uur bij 37 °C in een bevochtigde kamer.

Bereid ondertussen de probe voor een dubbelstrengs DNA-probe voor. Denatureer deze gedurende vijf minuten bij 95 °C en koel hem vervolgens kort op ijs af. Na een uur wordt de hybridisatieoplossing geaspireerd en wordt de probeloplossing toegevoegd.

Bescherm vanaf deze stap het monster tegen licht. Dek de monsters na het toevoegen van de probe af met glazen dekglasjes. Maak vervolgens een bevochtigingskamer op een warmteblok van 80 °C.

Wanneer het warmteblok weer is gestabiliseerd op 80 °C, plaatst u de objectglazen met de monsters in de verwarmde kamer en laat u deze drie minuten denatureren. Incubeer vervolgens alle bewerkte objectglazen gedurende de nacht in een bevochtigde kamer bij 37 °C. Was de monsters na de incubatie overnacht vijf minuten in PBST bij kamertemperatuur.

Verwarm ter voorbereiding de hybridisatieoplossing één uur vóór het wassen tot 37 °C. Plaats vervolgens de objectglazen in een pot met hybridisatiewasoplossing en incubeer deze 30 minuten bij 37 °C. Om de hybridisatieoplossing te verwijderen, worden de monsters 15 minuten gewassen met PBST bij kamertemperatuur.

Voer deze handeling drie keer uit. Na het afzuigen van de laatste PBST-wasstap, voegt u 20 µL blokkeeroplossing toe aan elk monster en incubeert u deze in bevochtigde kamers bij kamertemperatuur gedurende één uur in het donker. Zuig vervolgens de blokkeeroplossing af en vervang deze door FITC-geconjugeerde anti-digoxigenine antilichaamoplossing in een verdunning van 1:200.

Dek de objectglazen af en incubeer deze gedurende drie uur bij kamertemperatuur in het donker. Was de monsters na de antilichaamkleuring twee keer met PBST gedurende 15 minuten per wasbeurt in het donker. Aspireer vervolgens de PBST en vervang deze door 10 µL monteermiddel met DAPI.

Plaats een dekglas en absorbeer alle overtollige oplossing. Seal tot slot de randen van het dekglas met nagellak en observeer de monsters onder een fluorescentiemicroscoop. Met behulp van de PNA-probe werden de telomeren van dieren die een telomeer-voldoende mutatie overleefden, geobserveerd.

In de gonaden is het aantal telomeren per nucleus kwantificeerbaar. Het telomeersignaal colocaliseerde met een TALT1-signaal, wat de opvatting ondersteunt dat TALT1 verantwoordelijk is voor overleving zonder telomeren. De intensiteit van het telomeersignaal werd vergeleken met behulp van software.

Het signaal was sterker in de ALT-overlevers dan in de ouderstammen die werden gebruikt om de telomeer-deficiënte mutanten te genereren. Vergeet niet dat werken met paraformaldehyde en formamide uiterst gevaarlijk kan zijn, en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen.