Name: Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Leer een beknopte FISH-techniek om telomeerlengte en -aantal te analyseren in Caenorhabditis elegans. Deze methode visualiseert en kwantificeert telomeerherhalingen binnen 24 uur voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mutatiestam van wormen werden vriendelijk ter beschikking gesteld door het Caenorhabditis Genetics Center. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het Ministerie van Volksgezondheid & Welzijn, Republiek Korea (subsidienummer: HI14C1277).

1. Labeling Probes met digoxigenine-dUTP door PCR <ol><li> Voer PCR labeling met 10x dNTP mengsel dat digoxigenine-dUTP zoals eerder beschreven 13. </li><li> Zuiver PCR product met spin kolomzuivering volgens de instructies van de fabrikant. <ol><li> Als de probe korter dan 200 bp, verwijdert vrije digoxigenine-dUTP spin-kolomchromatografie uit het reactiemengsel plaats van spin-kolomzuivering. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiden polylysine gecoate glaasjes Opmerking: De gehele procedure duurt ongeveer 2 uur. Meeste stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur met uitzondering van de droogstap. <ol><li> Het schoonmaken van de slides <ol><li> Plaats de objectglaasjes in een plastic container en spoel de glaasjes kort in gedestilleerd water (DW). Verwijder het water en de houder te vullen met DW bevattende 1% glasreiniger. </li><li> Schud de objectglaasjes gedurende 15 minuten bij 50 rpm bij kamertemperatuur (RT). Was de dia&#39;s met DW 3tijden gedurende 5 minuten elk bij kamertemperatuur. </li><li> Was de dia&#39;s met 70% ethanol gedurende 15 min onder roeren. Gooi 70% ethanol en plaats de dia&#39;s op een 65 ° C droge blok en de lucht drogen gedurende 15 min. </li></ol></li><li> Polylysine coating van multiwell-objectglaasjes Opmerking: polylysine coating objecthouder is een belangrijke stap, aangezien het de hechting monster gedurende de kleuringsprocedure. Slecht beklede slide zal resulteren in het verlies van het monster. <ol><li> Verdun de polylysine voorraadoplossing tot 0,01% (w / v) in gedestilleerd water. Voeg 20 ul van de verdunde 0,01% (w / v) polylysine aan de putjes van een schone glasplaatje. </li><li> Incubeer het objectglaasje gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats de dia&#39;s op een 65 ° C droge blok en de lucht drogen gedurende 1 uur. </li><li> Bewaar de polylysine dia&#39;s in de stofvrije doos. </li></ol></li></ol> 3. Fixatie van Worms op de Slide Glass (figuur 1) <ol><li> De voorbereiding van embryo&#39;s voor FISH Opmerking: Harvest wormen voordat alle tHij bacteriële voedsel wordt verbruikt door het kijken naar de groei van de media onder de microscoop. Verhongering vermindert de productie van eieren van volwassen wormen en verhoogt ei uitbroeden. Methoden worden beschreven in 14,15. <ol><li> Groeien de wormen in 50 mm Petri-schaal volgens standaardwerkwijzen 14. </li><li> Na al het bacteriële voedsel wordt geconsumeerd, snijd de agar media in het kwartaal af met een spatel. Steriliseer de spatel voor het snijden om besmetting te voorkomen. </li><li> Zet al het stukje agar op de 100 mm nematode groei media (NGM) plaat. Draai het agar stuk op zijn kop voor de wormen aan de verse bacteriële voedsel te bereiken. </li><li> Na 48 tot 72 uur, het verzamelen van de wormen met M9 buffer. Voeg 3-5 ml M9 buffer op de NGM plaat. Pipetteer M9 buffer op het oppervlak van de NGM wormen wassen. </li><li> Verzamel de vloeistof met wormen en toe te voegen aan een 15 ml buis. Opmerking: Als er agar puin na de oogst, centrifuge de wormen in een 30% sucrose-oplossing. Terwijl afval gepelleteerd, wormen drijvenhet oppervlak. </li><li> Voeg M9 buffer om het volume op 15 ml. Pellet de wormen door centrifugeren bij 300 xg gedurende 3 minuten en verwijder het grootste deel van de M9 buffer. Herhaal deze stap nog 2 keer. Opmerking: Als de wormen nog steeds drijven na het centrifugeren, zet de rem niveau van de centrifuge naar waarde = 1. </li><li> Zuig M9 buffer. Voeg bleekoplossing de wormen. Per 0,5 ml wormen, voeg 6,5 ml van DW, 2 ml hypochloriet, 1 ml 5 M KOH. </li><li> Incubeer de wormen schommelen bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten bij 50 rpm. Vortex wormen gedurende 15 seconden voor het mechanisch afschuiven de wormen en bloot de eieren. </li><li> Houd u aan de buis onder een dissectie microscoop tijdens het bleken. Zorg ervoor dat de wormen in de helft worden gesneden en eieren worden vrijgegeven. Wanneer het grootste deel van de volwassen lichaam is opgelost, voeg M9 buffer om het volume op 15 ml. </li><li> Centrifugeren bij 300 g gedurende 3 min. Zuig het grootste deel van de M9 en voeg verse M9 buffer om het volume op 15 ml. Herhaal wassen stap 3 keer. Notitie:Vermijd het gebruik van overmatige hoeveelheid wormen, omdat ze het bleken proces belemmeren. Houd de totale reactietijd van minder dan 8 min, totdat het wassen. Over-gebleekte eieren produceren sterke autofluorescentie. </li><li> Voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing met polysorbaat-20 (PBST) tot 200 pl en 200 pl 4% paraformaldehyde (PFA) tot 2% PFA maken. Let op: Omdat PFA is kankerverwekkend, dragen beschermende kleding, handschoenen en een schild voor het gebruik van PFA. </li><li> Voeg 40 ul van de eieren in 2% PFA op de bron van polylysine gecoate slide. </li><li> Plaats de objectglaasjes in een vochtige kamer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Sluit de vochtige kamer direct na de dia&#39;s binnen zijn geplaatst. Opmerking: De eieren naar de bodem van de slede terwijl vast. </li></ol></li><li> De voorbereiding van ontleed geslachtsklieren voor FISH <ol><li> Harvest volwassen wormen gekweekt op 50 mm NGM plaat door pipetteren 1 ml M9 buffer. Harvest wormen voordat bacteriële voedsel is uitgeput. </li><li> Was de wormen van alle bacteriën with M9 buffer, 2 keer. Opmerking: Resterende bacteriën kan beïnvloeden ontleed gonaden plakken aan polylysine gecoate glaasjes. </li><li> Pellet de wormen door centrifugatie bij 300 x g. Verwijder M9 en de wormen naar de lege NGM plaat overzetten door micropipet. </li><li> Voeg 30 pl M9 buffer bevattende 2 mM levamisol op een bron van polylysine behandeld slide. </li><li> Voeg 500 pl buffer M9 een 1 ml buis. Met deze buffer om de wormen te dragen via de mond pipet. </li><li> Vul het uiteinde van de mond pipet met M9 buffer door een capillair in 1 ml buis met het M9 buffer. </li><li> Onder ontleden microscoop, zet de punt van de mond pipet vlak voor het hoofd van de volwassen worm en sleep de mond pipet, zodat de kop van wormen komt in de mond pipet. Zodra het hoofd van wormen komt de tip, zal het hele lichaam van de worm worden getrokken in de tip. </li><li> Breng de wormen aan de polylysine gecoate dia met behulp van de mond pipet. </li><li> Met behulp van een scheermes, afsnijdenf het hoofd of het puntje van de staart van wormen op de dia. Als de worm wordt gesneden, zal de geslachtsklieren eruit springt. Geslachtsklieren zal vasthouden aan de dia&#39;s. <ol><li> Maak minstens 30 wormen in een putje. Meer putjes kan worden gebruikt voor een andere 30 wormen. </li></ol></li><li> Plaats de dia in de vochtige kamer en zuig bij de M9 buffer met de mond pipet. </li><li> Bevestig het monster door het toevoegen van 20 pl 2% PFA bij kamertemperatuur gedurende 15 min in vochtige kamer. </li></ol></li></ol> 4. Fixatie en Permeabilisatie <ol><li> Plaats een aluminium blok op droog ijs en op te slaan in een diepvriezer (-80 ° C). WINKEL methanol en aceton bij -20 ° C. </li><li> Na PFA fixatie stap 3.1.15 of 3.2.11, verwijder fixeermiddel met behulp micropipet verlaten ~ 5 ui van het fixeermiddel. </li><li> Zet een andere polylysine gecoate dia op het monster dia. Verwijder het fixeermiddel met een papieren handdoek als de oplossing buitensporig. Laat de dia&#39;s niet verplaatsen als ze eenmaal aan elkaar geplakt zitten. </li><li> Bevries de slidesop het aluminium blok ten minste 15 min. Opmerking: De monsters kunnen worden bewaard gedurende minstens 2 - 3 dagen. </li><li> Terwijl de dia&#39;s worden ingevroren, zet de potten met koude methanol en aceton op ijs. </li><li> Neem de dia&#39;s uit en draai ze te bevriezen-barst het monster. Gooi de bovenste slede. Onmiddellijk genieten van de dia in de ijskoude methanol gedurende 5 minuten. </li><li> Breng de objectglaasjes ijskoude aceton gedurende 5 minuten. </li><li> Was de dia 3 maal met PBST gedurende 5 minuten om resterende fixeermiddel verwijderen. Naar de volgende stap of de objectglaasjes in 100% ethanol bewaren bij 4 ° C. Opmerking: De monsters kunnen worden bewaard gedurende minstens 2 - 3 dagen. </li></ol> 5. Hybridisatie van gefixeerde cellen <ol><li> Voeg 20 gl RNase-oplossing (PBST dat 10 ug / ml RNase A). Incubeer de schuif in de vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Was de dia tweemaal in 2x zoutoplossing en natriumcitraat met polysorbaat-20 (2x SSCT) gedurende 15 minuten elk. </li><li> Voeg 20ul hybridisatieoplossing en zet de vochtige kamer in de 37 ° C incubator. Na 1 uur, verwijder de hybridisatie-oplossing door pipetteren. </li><li> Voor het verwijderen van hybridisatie-oplossing, de voorbereiding van de sonde. Als de sonde wordt dubbele DNA denatureren de probes door verwarming bij 95 ° C gedurende 5 min op een droog blok. Na verwarmen, koelen van de sonde op het ijs in het kort. </li><li> Voeg 10 ul hybridisatieoplossing bevattende probes aan het monster. Voor PNA probe gebruiksconcentratie in een verhouding van 1: 2000 en dig-gelabelde probe, gebruiksconcentratie in een verhouding van 1: 200. Bedek het monster met deksel glas. </li><li> Plaats een papieren handdoek gedrenkt in water op het verwarmingsblok (80 ° C). Zet een plastic deksel op het verwarmingsblok de vochtigheid en temperatuur te behouden. </li><li> Nadat de temperatuur van het verwarmingsblok gestabiliseerd (bij 80 ° C), plaats het monster dia op de verwarmde keukenpapier en bedekken de monsters met kunststof deksel. Denatureren van het monster voor 3 min. </li><li> IncUbate de objectglaasjes in een vochtige kamer gedurende de nacht bij 37 ° C. </li></ol> 6. Wast en immunofluorescentie <ol><li> Warm de hybridisatie- wasoplossing (2 x SSC, 50% formamide) bij 37 ° C. </li><li> Was het monster in PBST tweemaal bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het deksel glas. </li><li> Was het monster in hybridisatie- wasoplossing bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Was het monster dia in PBST 3 maal bij kamertemperatuur. Opmerking: Voer alle volgende stappen in vochtige kamer bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 20 ul van blokkeeroplossing en incubeer 1 uur bij KT in de vochtige kamer. </li><li> Verwijderen blokkeeroplossing en voeg FITC geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaamoplossing (1: 200) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li></ol> 7. Montage en Observation <ol><li> Was het monster dia met PBST 2 keer voor 15 minuten elk. </li><li> Voeg 10 ul van bevestigingsoplossing met DAPI. Leg het deksel glas en druk zachtjes. Verwijder eventuele overtollige oplossingmet een papieren handdoek. </li><li> Verdamping van bevestigingsoplossing voorkomen, sluit de randen van het dekglaasje met nagellak. </li><li> Observeer onder confocale microscoop. Uitsluiten embryo&#39;s met een hoge achtergrond. Focus op een veld met 4-20 kernen. </li><li> Maak opnamen volgens de instructies van de fabrikant met 100X objectief. Opmerking: Excite monster met 405 nm laser voor DAPI, met 555 nm laser voor Cy3, met 488 nm laser voor FITC. </li></ol> 8. Kwantificering van Telomere Signal Opmerking: Kwantificering werd uitgevoerd zoals eerder 16 beschreven. Alle beelden die moeten worden vergeleken geboden bij dezelfde instelling zoals belichtingstijd en lichtbron. <ol><li> Exporteer de afbeelding in .tif-formaat. </li><li> Download en installeer de software voor beeldanalyse. </li><li> Voer de beeldanalyse-software en klik op de knop eens. </li><li> Klik op te drukken. Open de beelden met telomeer FISH door te dubbelklikken op het beeldbestand. </li><li> Klik[Bewerken] - [select verwerking regio], selecteer gebied van belang door links te klikken en te slepen. Uitsluiten alle niet-specifieke kleuring. </li><li> Klik [maatregel] - [spot extincties], selecteer het kanaal met een telomeer signaal en voer de bestandsnaam om de resultaten in .txt bestand op te slaan. Opmerking: De kolom resultaten zijn in de volgende volgorde: Fluorescentie spot, achtergrondintensiteit spot en gebied van vlek. </li><li> Kopieer de waarden en aftrekken achtergrond intensiteit van de spot van de fluorescentie van spot. De waarden kunnen nu statistisch geanalyseerd. </li></ol>

<ol><li>Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+cells+with+no+detectable+telomerase+activity.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-Moscow%22%5BJournal%5D)">Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review.</a> Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).</li>
<li>Seo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+maintenance+through+recruitment+of+internal+genomic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions.</a> Nat Commun. 6, 8189(2015).</li>
<li>Cesare, A. J., Reddel, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+lengthening+of+telomeres%3A+models%2C+mechanisms+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications.</a> Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).</li>
<li>Meier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((trt-1+is+the+Caenorhabditis+elegans+catalytic+subunit+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase.</a> Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).</li>
<li>Cawthon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+measurement+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere measurement by quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 30, 47(2002).</li>
<li>Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+longevity+and+telomere+length+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans.</a> PLoS Genet. 1, 30(2005).</li>
<li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Specific+Sequences+among+DNA+Fragments+Separated+by+Gel-Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98, 503(1975).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+extension+by+telomerase+and+ALT+generates+variant+repeats+by+mechanistically+distinct+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes.</a> Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).</li>
<li>Cheung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+telomere+length+revealed+by+single+telomere+length+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).</li>
<li>Shtessel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+POT-1+and+POT-2+repress+telomere+maintenance+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways.</a> G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).</li>
<li>Duerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook+%28The+C.+elegans+Research+Community%29%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry.</a> WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).</li>
<li>Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhillips%2C+CM+%22Meiosis%3A+Volume+2%2C+Cytological+Methods%22">Meiosis: Volume 2, Cytological Methods</a>. , Springer. 171-195 (2009).</li>
<li>Emanuel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+system+for+synthesis+of+non-radioactive+nucleic+acid+hybridization+probes+using+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR.</a> Nucleic acids research. 19, 2790(1991).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J Vis Exp. , e4019(2012).</li>
<li>Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurements+using+digital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy.</a> Cytometry. 36, 267-278 (1999).</li>
<li>Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shelterin+protein+POT-1+anchors+Caenorhabditis+elegans+telomeres+through+SUN-1+at+the+nuclear+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery.</a> J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).</li>
<li>Lee, M. H., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+in+situ+hybridization+of+dissected+gonads%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">RNA in situ hybridization of dissected gonads.</a> WormBook. , 1-7 (2006).</li>
<li>Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-well+version+of+in+situ+hybridization+on+whole+mount+embryos+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH).</a> Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14(2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het belangrijkste voordeel van ons protocol is de eenvoud van de procedure zonder merkbare schade aan de morfologie van celstructuur. Verschillende stappen werden geoptimaliseerd voor C. elegans FISH in dit protocol. De kritische stappen voor een succesvolle vissen omvatten etikettering van probes, fixatie van embryo&#39;s en penetratie. Digoxigenine-dUTP labeling methode biedt een eenvoudig te gebruiken methode labeling met behulp van PCR of nick-translatie. Om lange doelsequentie te labelen, is nick-translati...

Telomeer beschermt chromosomale uiteinden van afwijkende fusion en degradatie. Zoogdieren telomeer is samengesteld uit G-rijke hexamere herhalingen, TTAGGG en shelterin complexen. De telomere repeat sequentie van de nematode is vergelijkbaar met die van zoogdieren (TTAGGC). De meeste eukaryoten gebruik maken van telomerase aan telomeer herhalingen toe te voegen aan hun chromosomale uiteinden. Echter, 10-15% van kankercellen gebruik telomerase onafhankelijk mechanisme, bekend als alternatieve Verlenging van Telomeren (ALT) 3. Eerder hebben we gemeld dat telomeer herhalingen en de bijbehorende sequenties, genoemd als Talt, werden versterkt in de telomeren van telomerase mutant lijnen die kritische steriliteit 2 overleefd. Telomeerlengte werd gemeten door middel van kwantitatieve PCR of Southern blot, dat de gemiddelde lengte van telomeren totale 4,5,6,7 biedt. Lees telling van telomeer repeat in whole genome sequencing data is ook een indicator van de totale inhoud van telomeren 8. Hoewel Single telomeerlengte Analyse (STELA) kan over een lengte van een telomeer, kan geen ruimtelijke informatie telomeren 9 verschaffen. Terwijl POT-1 :: mCherry reportergen bevat de ruimtelijke informatie van telomeren in vivo, kan niet stukken dubbelstrengs telomeren vertegenwoordigen als POT-1 is een enkelstrengs telomeer eiwit 10. Terwijl genoemde werkwijzen de gemiddelde informatie van repetitieve sequenties, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) maakt het mogelijk om de hoeveelheid en ruimtelijke patroon van afzonderlijke sequenties van belang mbt een chromosomaal gebied. In plaats van zuivering van DNA, weefsels of cellen gefixeerd met de natuurlijke ruimtelijke informatie in FISH behouden. Zo FISH is een zowel kwantitatieve als kwalitatieve tool voor het observeren van de individuele herhaalde sequenties, zoals telomeer herhalingen. Dit protocol verschaft een efficiënte werkwijze voor het gelijktijdig detecteren van zowel telolouter en andere repeats gebaseerd op verbeteringen van eerder beschreven methoden 11,12. C. elegans larven of volwassenen zijn meercellig organisme met zeer gedifferentieerde cellen. De heterogeniteit van cellen belemmert op de kwantitatieve analyse van een groot aantal telomere spots. Om het aantal geanalyseerde cellen te maximaliseren, embryo geïsoleerd en uitgespreid op de-polylysine gecoate glaasjes voor FISH. Bovendien kan dit protocol ook worden gecombineerd met immunofluorescentie. Als bewijs dat het protocol werkt, wordt aangetoond dat het mogelijk is om te observeren en te kwantificeren twee verschillende repetitieve sequenties. DNA-probe tegen TALT1 werd gegenereerd met PCR eenvoudige integratie digoxigenine-dUTP. Dan is deze TALT1 probe en fluorescentie-gemerkte telomere PNA probe werden gelijktijdig gehybridiseerd. Vervolgens werd digoxigenine gedetecteerd door immunofluorescentie canonieke werkwijzen. Wij presenteren hier de vertegenwoordiger van de beelden, waar TALT1 colocalized met de telomeer in TRT-1 </em&gt; overlevenden.

<table><tbody><tr><td>PNA probe</td><td>PANAGENE</td><td>custom order</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11207741910</td><td>gebruik 1:200 verdund in PBST</td></tr><tr><td>Digoxigenin-dUTP</td><td>Roche</td><td>11573152910</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-6148</td><td>bereid 4% paraformaldehyde door te verwarmen in DW met een paar druppels NaOH. voeg 0,1 volume van 10x PBS toe.</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisatieoplossing</td><td></td><td></td><td>3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextransulfaat, 50 &#956;g/ml heparine, 100 &#956;g/ml gist-tRNA, 100 &#956;g/ml gesoniceerde zalmsperma-DNA</td></tr><tr><td>Hybridisatiewasoplossing</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 50% formamide</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>BIONEER</td><td>C-9012</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>maak 10 mg/ml voor voorraadoplossing</td></tr><tr><td>Dextraansulfaat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>67578</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td>Voor 1 L DW : 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27 g Na2HPO4&#8226;7H2O, 2,4 g KH2PO</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1% tween-20</td></tr><tr><td>Polysorbaat 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-2287</td><td>Commerciële naam is Tween-20</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine oplossing (0,1% w/v)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8920</td><td>bereid vers 0,01% w/v oplossing voor gebruik</td></tr><tr><td>M9</td><td></td><td></td><td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O tot 1 L</td></tr><tr><td>Bleekoplossing</td><td></td><td></td><td>20% natriumhypochloriet, 0,5 M KOH</td></tr><tr><td>Antilichaambuffer</td><td></td><td></td><td>1x PBST, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,05% Natriumazide (toxisch)</td></tr><tr><td>Blockingoplossing</td><td></td><td></td><td>Antilichaambuffer met 5% bovien serumalbumine (BSA)</td></tr><tr><td>illustra Microspin G-50</td><td>GE healthcare</td><td>27-53310-01</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td></td><td></td><td>Om 1 L te maken, 175,3 g NaCl, 88,2 g natriumcitraat, H2O tot 1 L, breng pH op 7,0</td></tr><tr><td>2x SSCT</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 0,1% tween-20</td></tr><tr><td>10x digoxigenine-dUTP mix</td><td></td><td></td><td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM DIG-11-dUTP</td></tr><tr><td>PCR zuiveringskolommen</td><td>Cosmo genetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>Glasreiniger / ULTRA CLEAN</td><td>Dukssan pure chemicals</td><td>8AV721</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well glazen plaatje</td><td>MP biomedicals</td><td>96041205</td><td></td></tr><tr><td>Nematode groeimedia</td><td></td><td></td><td>Om 1 L te maken, 3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g pepton, H2O tot 974 ml. Autoclaveer en koel de flacon. Voeg 1 ml 1 M CaCl2 toe, 1 ml 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml 1 M MgSO4, 25 ml 1 M KPO4.</td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>196142</td><td></td></tr><tr><td>Vuilnismes</td><td>Feather</td><td>mesje Nr. 11</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Enzynomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscoop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>EC Plan-Neofluar 100X werd gebruikt als objectieflens.</td></tr><tr><td>Vochtigheidskamer</td><td></td><td></td><td>Kunststof doos gevuld met papieren handdoek gedrenkt in DW</td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware&nbsp;</td><td>Dr. Peter Landsdorp</td><td>TFL-telo</td><td><a href="http://www.flintbox.com/public/project/502">http://www.flintbox.com/public/project/502</a></td></tr></tbody></table>

observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie (fish) met pna probes in<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomeer is een ribonucleoproteïnestructuur die chromosomale uiteinden beschermt tegen abnormale fusie en afbraak. Telomeerlengte wordt gehandhaafd door telomerase of een alternatieve route, bekend als alternatieve verlenging van telomeren (ALT)1. Onlangs is C. elegans opgekomen als een multicellulair modelorganisme voor de studie van telomeren en ALT2. Visualisatie van repetitieve sequenties in het genoom is cruciaal voor het begrijpen van de biologie van telomeren. Terwijl telomeerlengte kan worden gemeten door telomeer restrictiefragment assay of kwantitatieve PCR, geven deze methoden alleen de gemiddelde telomeerlengte. Daarentegen kan fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) de informatie van de individuele telomeren in cellen leveren. Hier bieden we protocollen en representatieve resultaten van de methode om telomeerlengte van C. elegans te bepalen door middel van fluorescente in situ hybridisatie. Deze methode biedt een eenvoudige, maar krachtige, in situ procedure die geen merkbare schade aan de morfologie veroorzaakt. Door gebruik te maken van fluorescerend gelabelde peptidenucleïnezuur (PNA) en digoxigenine-dUTP-gelabelde sonde, waren we in staat om twee verschillende repetitieve sequenties te visualiseren: telomeer herhalingen en sjabloon van ALT (TALT) in C. elegans embryo's en gonaden.

Eerder werd gemeld dat de ALT overlevende kan ontstaan ​​uit telomerase-deficiënte mutant, TRT-1 (ok410), in een lage frequentie door het repliceren van intern gelokaliseerde &#39;Template van ALT&#39; (Talt) sequenties voor telomeren onderhoud 2. Gebruik PNA probe, konden we telomeren in ontleed geslachtsklieren (Figuur 2A) te visualiseren. De zwakke telomeer signaal werd waargenomen zowel in TRT-1 (ok410) en ALT overlevende. De fuzzy signaa...

We rapporteren een beknopte procedure van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) in de geslachtsklieren en embryo's van Caenorhabditis elegans voor het observeren en kwantificeren van repetitieve sequenties. We hebben met succes twee verschillende repetitieve sequenties waargenomen en gekwantificeerd, telomeer herhalingen en sjabloon van alternatieve verlenging van telomeren (TALT).

Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Het algemene doel van deze fluorescentie in situ hybridisatietechniek is om het aantal en de lengte van telomeren in C.Elegans beknopt te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over tumorregeneratie, alternatieve verlenging van telomeren en cellulaire senescentie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de procedures beknopt zijn en de telomeren in minder dan 24 uur gevisualiseerd en gekwantificeerd kunnen worden.Verzamel de drachtige volwassen wormen samen met een kleine hoeveelheid vloeibaar medium zonder debris in een buis van 15 milliliter. Was de wormen nu drie keer als volgt. Voeg M9-buffer toe tot een totaal volume van 15 milliliters.Centrifuge de buis vervolgens 3 minuten bij 300 G en verwijder de vloeistof boven het pellet met wormen. Herhaal dit proces vervolgens. Als de wormen na de centrifugatie blijven drijven, verminder dan de rem van de centrifuge.Laat de wormen na de derde wasbeurt in 5 milliliters M9 achter. Voeg vervolgens 6,5 milliliters gedestilleerd water, twee milliliters hypochloriet en één milliliter vijf molar kaliumhydroxide toe. Laat de wormen drie minuten incuberen in deze bleekoplossing bij een agitatie van 50 RPM. Vortex de wormen vervolgens om ze open te scheuren en de eieren vrij te maken.Zoek onder een dissectiemicroscoop naar de vrijgekomen eitjes. Als ze nog niet zijn vrijgekomen, zet de incubatie dan voort tot maximaal acht minuten. Als de wormen grotendeels zijn opgelost en de eitjes vrij zijn, vul de buis dan aan tot 15 milliliters met M9 en was de eitjes drie keer op dezelfde manier als de wormen eerder zijn gewassen.Vul het volume van de gewassen eieren, waarvan het grootste deel van het M9 is verwijderd, aan tot 500 microliters met PBST, en voeg vervolgens 500 microliters 4% PFA toe. Breng nu aliquoten van 40 microliter eieren in 2% PFA aan in de putjes van met polylysine gecoate glaasjes. Plaats de glaasjes vervolgens in een bevochtigingskamer en laat ze 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur.Zorg voor dit protocol dat een aluminiumblok op droogijs is bewaard bij -80 °C. Zorg daarnaast dat methanol en aceton zijn bewaard bij -20 °C. Nadat de fixatiestap is voltooid, wordt het grootste deel van de PFA-oplossing van de objectglazen verwijderd, waarbij ongeveer 5 µL achterblijft.Plaats vervolgens een tweede met polylysine gecoate objectglas over elk monsterglas, zodat de twee gecoate oppervlakken aan elkaar hechten en de weefsels in het putje worden ingesloten. Als er teveel fixatief aanwezig is, dep dit dan op met een tissue. Vries de objectglazen nu in door ze gedurende ten minste 15 minuten op het koude aluminiumblok te plaatsen.Bereid ondertussen methanol- en acetonbaden op ijs voor de objectglazen. Zodra de objectglazen bevroren zijn, wordt een objectglas gedraaid om het monster door vriesbreuk los te maken. Gooi het bovenste objectglas weg en laat het onderste objectglas vijf minuten weken in ijskoude methanol.Voer dit uit voor alle monsters. Bevriezingsbreuk maakt de penetratie van probes en antilichamen door de harde eierschaal mogelijk. Als de eieren succesvol zijn gebroken door bevriezing, zouden de eieren op beide objectglazen zichtbaar moeten zijn.Na ten minste vijf minuten in methanol, verplaats de coupes naar koude aceton voor vijf minuten. Na nog eens vijf minuten worden de monsters drie keer gedurende vijf minuten per bad geweekt in PBST. Na de PBST-wasstappen kunnen de coupes enkele dagen worden bewaard in 100% ethanol bij vier graden celsius.Voeg ter voortzetting 20 µL RNase-oplossing toe aan de monsterputjes en incubeer deze gedurende een uur bij 37 °C in een bevochtigde kamer. Was de objectglazen vervolgens twee keer gedurende 15 minuten per wasbeurt in 2x SSCT. Voeg na de twee wasbeurten 20 µL hybridisatie-oplossing toe aan de monsters en incubeer deze gedurende een uur bij 37 °C in een bevochtigde kamer.Bereid ondertussen de probe voor een dubbelstrengs DNA-probe voor. Denatureer deze gedurende vijf minuten bij 95 °C en koel hem vervolgens kort op ijs af. Na een uur wordt de hybridisatieoplossing geaspireerd en wordt de probeloplossing toegevoegd.Bescherm vanaf deze stap het monster tegen licht. Dek de monsters na het toevoegen van de probe af met glazen dekglasjes. Maak vervolgens een bevochtigingskamer op een warmteblok van 80 °C.Wanneer het warmteblok weer is gestabiliseerd op 80 °C, plaatst u de objectglazen met de monsters in de verwarmde kamer en laat u deze drie minuten denatureren. Incubeer vervolgens alle bewerkte objectglazen gedurende de nacht in een bevochtigde kamer bij 37 °C. Was de monsters na de incubatie overnacht vijf minuten in PBST bij kamertemperatuur.Verwarm ter voorbereiding de hybridisatieoplossing één uur vóór het wassen tot 37 °C. Plaats vervolgens de objectglazen in een pot met hybridisatiewasoplossing en incubeer deze 30 minuten bij 37 °C. Om de hybridisatieoplossing te verwijderen, worden de monsters 15 minuten gewassen met PBST bij kamertemperatuur.Voer deze handeling drie keer uit. Na het afzuigen van de laatste PBST-wasstap, voegt u 20 µL blokkeeroplossing toe aan elk monster en incubeert u deze in bevochtigde kamers bij kamertemperatuur gedurende één uur in het donker. Zuig vervolgens de blokkeeroplossing af en vervang deze door FITC-geconjugeerde anti-digoxigenine antilichaamoplossing in een verdunning van 1:200.Dek de objectglazen af en incubeer deze gedurende drie uur bij kamertemperatuur in het donker. Was de monsters na de antilichaamkleuring twee keer met PBST gedurende 15 minuten per wasbeurt in het donker. Aspireer vervolgens de PBST en vervang deze door 10 µL monteermiddel met DAPI.Plaats een dekglas en absorbeer alle overtollige oplossing. Seal tot slot de randen van het dekglas met nagellak en observeer de monsters onder een fluorescentiemicroscoop. Met behulp van de PNA-probe werden de telomeren van dieren die een telomeer-voldoende mutatie overleefden, geobserveerd.In de gonaden is het aantal telomeren per nucleus kwantificeerbaar. Het telomeersignaal colocaliseerde met een TALT1-signaal, wat de opvatting ondersteunt dat TALT1 verantwoordelijk is voor overleving zonder telomeren. De intensiteit van het telomeersignaal werd vergeleken met behulp van software.Het signaal was sterker in de ALT-overlevers dan in de ouderstammen die werden gebruikt om de telomeer-deficiënte mutanten te genereren. Vergeet niet dat werken met paraformaldehyde en formamide uiterst gevaarlijk kan zijn, en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen.

observation-quantification-telomere-repetitive-sequences-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Het gemak van het behoud en het uitdragen van de...

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Hier beschrijven we een techniek die wordt gebruikt om genomisch DNA te visualiseren in vaste, intacte nematoden. De video bevat een voorbeeldprotocol om chromatine te tellen in onbevruchte C. elegans-oöcyten.

Ethanolfixatie en DAPI-kleuring: een methode om DNA in C. elegans te visualiseren

Source: Pigazzini, M. L., et. al. Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the use of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to assess polyQ protein aggregation in C. elegans neurons, comparing control and chaperone protein-deficient worms. Increased aggregation in chaperone-deficient worms promotes energy transfer between clustered fluorophores, reducing fluorescence lifetime.

Fluorescence Lifetime Imaging of PolyQ Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans Neurons

Hier wordt getoond hoe ontwikkelingsprocessen in C. elegans kunnen worden gevolgd en gekwantificeerd. De gepresenteerde methoden zijn gebaseerd op open-source tools die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd. Het wordt gedemonstreerd hoe 3D-celvormmodellen kunnen worden gereconstrueerd, hoe subcellulaire structuren handmatig kunnen worden gevolgd en hoe corticaal contractiele stroom kan worden geanalyseerd.

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Hier beschrijven we protocollen die specifiek zijn ontworpen om morfogenetische defecten te monitoren die optreden tijdens de vroege en late fasen van embryonale verlenging van de rondworm Caenorhabditis elegans. Uiteindelijk zijn deze protocollen ontworpen om genen te identificeren die deze fasen reguleren en om hun differentiële vereisten langs de antero-posterior as van het embryo te karakteriseren.

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hier introduceren en beschrijven we een niet-radioactieve en niet-invasieve methode om de novo-eiwitsynthese in vivo te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de nematode Caenorhabditis elegans en fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Deze methode kan worden gecombineerd met genetische en/of farmacologische schermen om nieuwe modulatoren van eiwitsynthese te identificeren.

Beoordeling van de novo Eiwit synthese tarieven in Caenorhabditis elegans

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

Dit protocol beschrijft een RNA-interferentie en ChIP-test om de epigenetische overerving van RNAi-geïnduceerde uitschakeling en geassocieerde chromatinemodificaties in C. elegans te bestuderen.

Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

Hier geven we instructies voor het effectief gebruik van SegElegans, een deep learning-systeem dat we hebben ontwikkeld voor de geautomatiseerde segmentatie van individuele wormen in breedveldmicroscopiebeelden, voor later gebruik in beeldanalysesoftware zoals ImageJ. We bieden manieren om het systeem zowel online als offline te gebruiken.

Geautomatiseerde analyse van C. elegans fluorescentiebeelden met behulp van SegElegans

Leer een beknopte FISH-techniek om telomeerlengte en -aantal te analyseren in Caenorhabditis elegans. Deze methode visualiseert en kwantificeert telomeerherhalingen binnen 24 uur voor kankeronderzoek.

Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal

Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie

Meer video's verkennen