Name: Isoleren Mesangiogenic Progenitor Cells (MTR) van Human Bone Marrow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Leer een betrouwbaar protocol voor het isoleren van mesodermale progenitorcellen uit menselijk beenmerg met dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode karakteriseert MPC's via flowcytometrie en nestine-expressie voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen vooral graag bedanken Dr. Paolo Parchi, afdeling Chirurgische, Medische en Moleculaire Pathologie en Critical Care Medicine, Universiteit van Pisa, voor het verstrekken van beenmerg samples en zijn expertise in de menselijke osteo-voorlopers

NB: Na schriftelijke toestemming, werden HBM monsters verkregen tijdens orthopedische chirurgie voor heupprothese. Direct na femorale hals osteotomie en voor femorale ruimen een 20 ml spuit met 500 UI heparine, werd gebruikt om vers BM zuigen. Het protocol is breed toepasbaar op elke BM bron worden beschouwd. 1. Isolatie van Human Bone Marrow mononucleaire cellen (HBM-multinationals) <ol><li> Verdun 5-10 ml vers BM 50 ml, toepassing Dulbecco&#39;s fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) en meng door omkeren. Verdeel eveneens 25 ml in twee nieuwe 50 ml conische buizen, voeg 25 ml D-PBS aan elke buis en meng door omkeren. </li><li> Laat de buizen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur staan, voor het scheiden van minerale botfragmenten en vet uit oplossing. </li><li> Verwijder voorzichtig drijvende vet met een steriele Pasteur pipet en filter celsuspensie door middel van 70 micrometer filters zonder verstoring van de mineraal bot fragment pellet. </li> &lt;li&gt; Stel vier 50 ml buizen met 15 ml medium voor discontinue dichtheidsgradiënt centrifugatie (1,077 g / ml). Zorg ervoor dat dit medium bij kamertemperatuur. </li><li> Leg zacht 20-25 ml verdund BM op de top van dichtheidsgradiënt medium. Voer deze operatie zorgvuldig, zodat celsuspensie trickle op de buis muren om het mengen van lagen te voorkomen. </li><li> Voeren dichtheidsgradiënt centrifugatie bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur met rem uitgeschakeld. </li><li> Verzamel de witachtige ring van cellen die zich tussen de twee fasen met een steriel pasteurpipet en overgebracht naar een verse 50 ml buis. </li><li> Was de cellen met vers kweekmedium: fenolrood-vrij, laag glucose (1000 mg / l) Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) samengevoegd humaan type AB serum (PhABS), 2 mM L-glutamine en antibiotica (DMEM / 10% PhABS). Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig supernatant en resuspendeer pellet in 5-10 ml vers DMEM / 10% PhABS. </li><li> Ga verder met celgetal.Bepaal het aantal witte bloedcellen door 1: 1 verdunning in trypan. Breng dit aan de hemocytometer en observeren onder een fasecontrastmicroscoop. Uitsluiten klein en perfect afgeronde erytrocyten en blauw-gekleurde dode cellen van het aantal cellen. LET OP: Het wordt sterk aanbevolen om het scherm PhABS partijen voor hun prestaties in MPC herstel. PhABS uit de VS bronnen hebben het beste resultaat gegeven, terwijl de meeste sera van verschillende afkomst resulteerde in MPC kweken met hogere percentages van MSC-achtige cellen. </li></ol> 2. Isolatie van mediterrane partnerlanden van HBM-multinationals <ol><li> Set hydrofobe T-75 kolven met 15 ml vers DMEM / 10% PhABS en laat pH en temperatuur evenwicht door pre-incubatie bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 30 minuten. </li><li> Seed 4-6 x 10 7 HBM-MDL per kolf en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 48 uur. </li><li> Zuig en gooi middelgrote en niet-hechtende cellen uit flessen. Voeg 15 ml vers DMEM / 10% PhABS en incubeer bij 37 ° Cin 5% CO2. Handhaaf culturen 6-8 dagen, veranderen medium elke 48 uur. Optioneel: MPC opbrengst te verhogen, niet-hechtende cellen van 2,3 opnieuw kunnen worden uitgeplaat in een nieuwe kolf en gehandhaafd zoals beschreven voor de primaire kweken. </li><li> Zuig en gooi medium uit flessen, wassen met verse DMEM en voeg 2 ml van dierlijke vrije protease losmaken oplossing. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 - 15 min (vermijd verlengde incubatie). </li><li> Voeg 10 ml vers DMEM / 10% PhABS, zuigen de celsuspensie en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten </li><li> Zuig en gooi supernatant en resuspendeer pellet in 1-2 ml vers DMEM / 10% PhABS. Ga verder met celgetal zoals beschreven in stap 1.10. LET OP: Gebruik geen trypsine / EDTA als los reagens. MTR zijn trypsine resistent. Morfologische screening van de culturen vóór verzamelen van cellen, wordt sterk aanbevolen om de aanwezigheid van spoelvormige MSC-achtige cellen te evalueren. Bij aanzienlijke hoeveelheid MSC-achtige cellen detected, verhoging van de zuiverheid van het celproduct door het selectief verwijderen van de besmette cellen. Hiervoor trypsine digestie kan worden uitgevoerd voordat MPC oogsten uitgevoerd door toevoeging van 2 ml trypsine / EDTA 0,05% gedurende 2 minuten. Was de cultures tweemaal met 5 ml DMEM / 10% PhABS, ga dan verder met de behandeling zoals hierboven protease. </li></ol> 3. Cell karakterisering <ol><li> flowcytometrie <ol><li> Opgericht duplo monsters van 10 5 vers losgemaakte cellen in wasoplossing: D-PBS aangevuld met 0,5% (v / v) runderserumalbumine (BSA) en 0,02% (w / v) natriumazide. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten. LET OP: Natriumazide is giftig. </li><li> Resuspendeer pellets in 200 pl wasoplossing en voeg anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 en anti-CD31-antilichamen geconjugeerd met fluorescente kleurstoffen ( &quot;test&quot;); parallel opgezet isotype controles ( &quot;CTRL&quot;). LET OP: Bedragen van kleuring antilichamen moet worden bepaald door titratie of According instructies van de fabrikant. </li><li> Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten. Re-schorten cellen in 500 pi wasoplossing en het verwerven van ten minste 5 x 10 4 evenementen op multicolor flowcytometer 7 9 10. </li><li> Analyseer resultaten op dot-plots en gebruik &quot;CTRL&quot; opgenomen gebeurtenissen te kwadranten te stellen. Opmerking: Om de cultuur als MPC cultuur definieert het percentage van CD73 neg neg CD90 CD45 + CD31 + cellen moet meer dan 95%. Voor sommige specifieke toepassingen, dat wil zeggen analyse van genexpressie, het herstel cut-off moet worden verhoogd tot 97-98%. </li></ol></li><li> Nestin detectie en F-actine organisatie analyse <ol><li> Plaat vers geïsoleerde MTR over cultuur kamer dia&#39;s (20.000 / cm2). Sta cellen hechten door overnacht incubatie bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Was de cellen in wasoplossing en fix in 4% (w / v) paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Voor het verwijderen van fixerende toevoegen wasoplossing, incubeer gedurende 2 minuten en giet. </li><li> Herhaal het wassen tweemaal. </li><li> Doorlaatbaar cellen in D-PBS aangevuld met 0,05% (v / v) Triton X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Stop reactie door eiwitvrije signaal versterker (30 min bij kamertemperatuur) of standaard blokkerende oplossing (D-PBS gesupplementeerd met 3% (w / v) BSA). </li><li> Verwijder signaal versterker / blokkeren oplossing. </li><li> Voeg 7 ug / ml (w / v) anti-humaan nestine primair antilichaam en incuberen bij 4 ° C geïncubeerd in een bevochtigde kamer. Daarnaast gebruiken isotype controle antilichamen niet specifiek fluorescentiesignalen evalueren. </li><li> Was de dia&#39;s door het toevoegen van D-PBS, laat gedurende 2 minuten en giet. Herhaal dit twee keer. </li><li> Voeg 2 ug / ml (w / v) van fluorescente kleurstof geconjugeerd secundair antilichaam en incuberen bij 4 ° C gedurende 1 uur in het donker. </li><li> Was de dia&#39;s zoals hierboven. </li><li> Voeg fluorescerende Phalloidin (5 UI / ml), vertrekken bij KT 30 min in het donker en was 3 maal in D-PBS. </li><li> Verwijder de kamerwanden en dia monteren montage waterig medium aangevuld met antifade reagens en 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) voor detectie kernen. Ga verder met het afbeelden van 7 9 10. </li></ol></li></ol> 4. Mesengenic Differentiatie van MTR <ol><li> Plaat 2 x 10 4 / cm 2 vers geïsoleerde MPL in TC behandelde T75 kweekflessen en laat cellen zich overnacht in DMEM / 10% PhABS bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Vervang DMEM / 10% PhABS met standaard gereduceerd serum medium, ongeveer 200 pl / cm2, ontworpen voor mesenchymale stromale cellen expansie (MSC-RS gemiddeld). Cellen groeien tot confluentie (P1-MSC&#39;s), kenmerkend van 7 tot 10 dagen na de inductie. Vernieuwen medium om de 2 dagen. </li><li> Zuig en gooi medium uit flessen, wassen met verse MSC-RS medium en voeg 2 ml van dierlijke vrije protease losmaken oplossing. Incubeer bij 3776; C gedurende 5 - 15 min (vermijd langdurige incubatie). </li><li> Voeg 10 ml van verse MSC-RS medium, zuigen de celsuspensie en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten </li><li> Zuig supernatant en resuspendeer pellet in 1-2 ml vers MSC-RS medium. Ga verder met celgetal zoals beschreven in stap 1.10 </li><li> Ga verder met subcultuur hen door zaaien 3-5 x 10 3 cellen / cm2. Cellen groeien tot confluentie (P2-MSC&#39;s). </li><li> Oogst cellen door protease spijsvertering zoals beschreven van stap 4,3 naar stap 4.5 en ga verder met de karakterisering zoals beschreven in paragraaf 3. LET OP: Een percentage van CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg cellen lager is dan 95% zou slechts een gedeeltelijke differentiatie aan te geven en om een aanvullend cultuur passage. </li><li> Plaat P2-MSC&#39;s bij 2 x 10 4 / cm 2 in zes goed TC-behandelde platen en te groeien tot confluentie in MSC-RS medium. </li><li> Mark twee putten als &quot;No Diff&quot; en vernieuwen MSC-RS medium. </li><li> Mark twee goeds als &quot;Osteo&quot; en medium te vervangen door 200 ul / cm2 standaard osteogene medium, speciaal ontworpen voor MSC differentiatie. </li><li> Mark twee putten als &quot;Adipo&quot; en medium te vervangen door 200 ul / cm2 standaard adipogenic medium, speciaal ontworpen voor MSC differentiatie. </li><li> Handhaaf kweken bij 37 ° C in 5% CO 2 door het veranderen van het gehele medium elke 48 uur. LET OP: Het wordt sterk aangeraden om standaard in de handel verkrijgbare differentiëren media te gebruiken voor de test reproduceerbaarheid. Na 2/3 weken onder differentiërende omstandigheden, kalkafzettingen verschijnen in osteogene geïnduceerde kweken, terwijl intracellulaire vetdruppels accumulatie is duidelijk in adipogenic geïnduceerde cellen. </li><li> Aspireren en gooi kweekmedium daarna wassen met D-PBS. </li><li> Bevestig de kweken door toevoegen van 1 ml 4% (w / v) paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voor het verwijderen van fixatief toevoegen D-PBS, incubeer gedurende 2 minuten en giet. Herhaal het wassentwee keer. </li><li> Vlekken op een &quot;No Diff&quot; samen met de twee &quot;Osteo&quot; gemarkeerd putten in hydroxyapatiet specifieke tl-oplossing en een &quot;No Diff&quot; samen met de twee &quot;Adipo&quot; putten in 200 nm Nile Rode oplossing gemarkeerd. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur 11,12. </li><li> Verwijder vlekken oplossingen en wassen in D-PBS twee keer. </li><li> Verwijder D-PBS, voeg D-PBS gesupplementeerd met 50% (v / v) glycerol en ga naar grafische 7 9 10. </li></ol> 5. MPC Sferoïde Sprouting Assay <ol><li> 3D sferoïden produceren lag 20 ul druppels vers geïsoleerde MPC suspensie (1,5 x 10 4 cellen / drop) op het binnenoppervlak van een petrischaal deksel. LET OP: Als handling druppels zou kunnen leiden tot hun breuk, is het zeer aan te bevelen om ze lag in overmaat. </li><li> Gebruik het deksel voorzichtig naar een petrischaal met D-PBS om te voorkomen dat hangende druppels verdampen recapituleren. Incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2&#39;s nachts om cellen te aggregeren in 3D bolletjes. </li><li> Stel een dikke gel van muizen extracellulaire matrix (ECM) eiwitten door toevoeging van 300 ul aliquots van standaard ECM eiwitten in een voorgekoelde 24 putjes kweekplaat, en incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> tip voorzichtig over de petrischaal deksel en voorzichtig pak de bolletjes met behulp van een steriele Pasteur pipet. </li><li> Leg sferoïden op de ECM eiwitgel, voeg 700 ul aliquots van standaard VEGF-rijke endotheliale celgroei medium en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Na 24 uur en 7 dagen cultuur, nemen foto&#39;s van de 3D kweken bij 4X vergrotingsfactor. Evalueer ontspruit uit bolletjes toepassing van beeldanalyse software door het meten van de radiale afstand tussen de laatste invasie cel en de bolvormige rand. Herhaal maatregelen langs ten minste 20 verschillende richtingen. De gemiddelde afstand wordt beschouwd als positief als 50 urn of meer. </li></ol>

<ol><li>Stoltz, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+and+Regenerative+Medicine%3A+Myth+or+Reality+of+the+21th+Century%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century.</a> Stem Cells Int. 2015, 734731(2015).</li>
<li>Pacini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+and+stochastic+approaches+in+the+clinical+application+of+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs).</a> Front Cell Dev Biol. 2, 50(2014).</li>
<li>Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cell-based+medicinal+product%3A+regulatory+structures+in+the+European+Union%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union.</a> Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).</li>
<li>Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+in+the+development+of+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Risk factors in the development of stem cell therapy.</a> J Transl Med. 9, 29(2011).</li>
<li>Petrini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+mesodermal+progenitor+cells+from+human+adult+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).</li>
<li>Trombi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+culture+of+mesodermal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Selective culture of mesodermal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).</li>
<li>Pacini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+pluripotency-associated+genes+in+mesodermal+progenitor+cells+%28MPCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs).</a> PLoS One. 5 (3), 9861(2010).</li>
<li>Pacini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+integrin+expression+is+associated+with+podosome-like+structures+on+mesodermal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).</li>
<li>Fazzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+progenitor+cells+%28MPCs%29+differentiate+into+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+by+activation+of+Wnt5%2Fcalmodulin+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway.</a> PLoS One. 6 (9), 25600(2011).</li>
<li>Tormin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146+expression+on+primary+nonhematopoietic+bone+marrow+stem+cells+is+correlated+with+in+situ+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization.</a> Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).</li>
<li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+red%3A+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li>
<li>Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+mineralized+nodule+formation+in+living+osteoblastic+cultures+using+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes.</a> Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).</li>
<li>Horwitz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarification+of+the+nomenclature+for+MSC%3A+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).</li>
<li>Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of mesenchymal stem cells.</a> J Hematol Oncol. 5, 19(2012).</li>
<li>Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSCs%3A+Biological+characteristics%2C+clinical+applications+and+their+outstanding+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns.</a> Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).</li>
<li>Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+expression+and+immunologic+properties+of+differentiated+and+undifferentiated+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells.</a> Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).</li>
<li>Phinney, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cell+populations%3A+clues+to+their+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy.</a> Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).</li>
<li>Phinney, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells%3A+implications+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy.</a> J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).</li>
<li>Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+hitting+the+right+spot+with+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells.</a> Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).</li>
<li>Corselli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tunica+adventitia+of+human+arteries+and+veins+as+a+source+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).</li>
<li>Bieback, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alternatives+to+fetal+bovine+serum+for+the+expansion+of+mesenchymal+stromal+cells+from+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow.</a> Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).</li>
<li>Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+isolation+to+implantation%3A+a+concise+review+of+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+bone+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51(2014).</li>
<li>Pacini, S., Petrini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+MSCs+angiogenic+cells%3F+New+insights+on+human+nestin-positive+bone+marrow-derived+multipotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells.</a> Front Cell Dev Biol. 2, 20(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

In de afgelopen decennia zijn MSC's uitgebreid onderzocht en pre-klinisch geëvalueerd voor mogelijke toepassing bij de behandeling van verschillende bot-/articulaire, immunologische, neurologische, cardiovasculaire, gastro-intestinale en hematologische aandoeningen14,15. Het gemakkelijke en goedkope isoleren van multipotente MSC's, uit vele verschillende weefsels, samen met hun gebrek aan significante immunogeniciteit16, draagt ertoe bij dat deze cellen een van de meest interessante celpopulaties zijn om te worden toegepast in celgebaseerde therapieën. Niettemin vertegenwoordigt de zeer lage frequentie in het oorspronkelijke weefsel een grote beperking voor de toepassing van MSC's in de kliniek, waardoor de expansie van deze cellen wordt gedwongen, in vitro, vóór de infusie of transplantatie. 
Uitgebreide MSC-culturen hebben een hoge mate van heterogeniteit en variabiliteit17-19 aangetoond, waardoor het moeilijk is om een consensus te bereiken over protocollen voor MSC-productie en -karakterisering. Bovendien suggereerden recente onderzoeken de aanwezigheid van meerdere in vivo MSC-voorouders in een breed scala aan weefsels, die bijdragen aan cultuurheterogeniteit10,20. In feite is voorgesteld dat specifieke kweekcondities mogelijk specifieke subpopulaties van MSC-voorlopers selecteren of eenvoudigweg bevorderen die aanwezig zijn in verschillende percentages in "ruwe" en onbewerkte monsters zoals beenmerg (hBM-MNCs) of vetweefsel (stromale vasculaire fractie)2. Dus, de variabiliteit in MSC-initiërende celpopulaties samen met het grote aantal verschillende verrijking/isolatie en kweekprotocollen die worden toegepast, vormen een groot obstakel voor de definitie van haalbare MSC-gebaseerde therapieën.
Een cruciale factor die de heterogeniteit van MSC-culturen beïnvloedt, is serumsuppletie21. In onze handen leidde de vervanging van FBS door PhABS in primaire culturen van hBM-MNCs, gecombineerd met hoog dichtheidszaaien op hydrofobe kunststoffen, tot de isolatie van een nieuwe zeer hechtende celpopulatie met verschillende biologische kenmerken genaamd MPCs5,6. We observeerden dat de toevoeging van kleine percentages van PhABS aan primaire culturen van FBS ook MPC-isolatie toestond, wat duidt op de aanwezigheid van MPC-inducerende agentia in het menselijk serum6. Op dit moment is het MPC-isolatie/karakteriseringsprotocol een unieke methode die beschikbaar is om bijna pure MPC's te verkrijgen. Het protocol is zorgvuldig aangepast en is zeer reproduceerbaar voor kwaliteitsscreening van MPC-preparaten vóór verdere toepassingen.
MPC's kunnen worden gebruikt als bron voor MSC-productie, waardoor de variabiliteit die wordt geïntroduceerd door het gebruik van niet-gefractioneerd uitgangsmateriaal wordt beperkt. De precieze definitie van de meerdere stappen die de mesengenetische differentiatie van MPC rapporteren9 zou gesynchroniseerde mesenchymale celexpansie mogelijk maken. Niettemin kan deze laatste voorwaarde uitsluitend worden gerealiseerd door toepassing van een hoog gezuiverde MPC-populatie, als gevolg hiervan zijn de karakterisering van de celproducten die worden verkregen door het hier beschreven protocol, van cruciaal belang. Deze isolatiemethode heeft aangetoond dat MPC-herstel met een zuiverheid van over het algemeen ongeveer 95% mogelijk is. Echter, donor/patiëntvariabiliteit samen met de variabiliteit gerelateerd aan de verschillende batches van menselijk gepoold serum die worden toegepast, kan leiden tot een significant percentage van MSC-achtige cellen dat samen met MPC's wordt meegeïsoleerd, onder selectieve omstandigheden.
Het is niet duidelijk of deze "contaminante" MSC-achtige cellen kunnen voortkomen uit de andere verschillende in vivo voorlopers die in beenmerg zijn beschreven22 of uit ongecontroleerde en spontane MPC-differentiatie. In elk geval vernietigt een consistent percentage van MSC-achtige cellen in de MPC-producten de mogelijkheid om deze cellen toe te passen als homogene uitgangsstof voor de MSC-expansie. Dus hier is een eenvoudige en goedkope methode voorgesteld, gebaseerd op de MPC-resistentie tegen trypsine-digestie, waardoor de zuiverheid van de MPC-producten wordt verhoogd. Soortgelijke of zelfs betere resultaten bij het zuiveren van MPC-culturen kunnen worden bereikt door middel van fluorescente of magnetische celsortering door CD73 en/of CD90-depletion, maar waardoor het procestijd aanzienlijk wordt verlengd en de kosten toenemen.
Bovendien vertoonden MPC's expressie van pluripotentie-geassocieerde markeren en Nestin, die allemaal snel verloren gaan tijdens mesengenetische differentiatie7. Sprouting-assay onthulde MPC-capaciteit om muis ECM-eiwitgel te invaderen. Alles bij elkaar genomen geven deze resultaten aan dat MPC's moeten worden beschouwd als een meer onvolwassen voorloper, die angiogeen potentieel behoudt. Niettemin neemt de initiële enthousiasme over het mesodermale differentiatiepotentieel van MPC's daadwerkelijk af. In feite, na meer dan 7 jaar onderzoek naar MPC's, zijn mesengenetisch en angiogeen potentieel uitgebreid beschreven5-9, maar differentiatie naar andere cellen van mesodermale oorsprong ontbreekt nog steeds. Dus, hier stellen we een nieuwe, en meer rigoureuze, definitie van deze cellen voor als "Mesangiogene Voorloper Cellen", met behoud van de afkorting MPC's.
We geloven ook dat de meeste controverses over het angiogeen potentieel van MSC's kunnen worden gerelateerd aan de heterogene samenstelling van uitgebreide culturen die bestaan uit subpopulaties van MPC's en MSC's in variabele percentages23.
Ten slotte kunnen MPC's ook een cruciale rol spelen voor de implementatie van CBMP's die toepasbaar zijn voor weefselreconstructie, aangezien deze cellen ook de neo-vasculatisatie kunnen ondersteunen. In feite, toekomstig onderzoek naar regeneratie zou in aanmerking moeten nemen dat de groei van nieuw gevormd weefsel moet

Mesenchymale stromacellen (MSC&#39;s) zijn van relevante klinische waarde voor de multi-lijn differentiatie vermogen en hun vermogen om hemopoiesis ondersteunen, groeifactoren / cytokinen uitscheiden en een rol spelen bij immuunregulatie 1. In de definitie van MSC-gebaseerde therapieën cel productie en toepassing zijn het voorwerp van uitgebreide klinische en pre-klinisch onderzoek 2 geweest, met bijzondere aandacht voor specifieke internationale regelgeving voor de veiligheid en de werkzaamheid van cellen gebaseerde geneesmiddelen (CBMP) behandelingen 3. Menselijke MSCs zijn uitvoerig gekweekt in media die supplementen en reagentia van dierlijke oorsprong, zoals foetaal runderserum (FBS) en runder trypsine. Daarom opzij met besmettelijke risico&#39;s celmanipulatie patiënten ook te prion blootstelling en immunologische risico&#39;s van eiwitten, peptiden of andere biomoleculen van dierlijke oorsprong die kunnen blijven bestaan ​​na verzamelen van cellen en Transplantatie 4. Om het probleem te omzeilen, gekweekt we humaan beenmerg (HBM) afgeleide MSC&#39;s in dier-vrij medium, ter vervanging van FBS met gepoolde humaan type AB serum (PhABS). Onder deze omstandigheden Daarnaast groeit MSCs identificeerden we een nieuwe celpopulatie. Deze cellen waren morfologisch en fenotypische verschillen van MSC&#39;s en toonde een opvallende genexpressieprofiel evenals kenmerkende teelt / hechting. Ze behield zowel mesengenic en angiogene potentieel en daarom werden genoemd mesodermale Progenitor Cells (MTR) 5. Vervolgens waren we in staat om selectieve en reproduceerbare kweekomstandigheden definiëren mediterrane partnerlanden bij hoge graad van zuiverheid 6 te genereren. We verder onderzocht de morfologische en biologische eigenschappen van de mediterrane partnerlanden. De mediterrane partnerlanden toonde nestin-positief, langzaam in de wielersport te zijn, Ki-67-negatief, en met chromosomen gekenmerkt door lange telomeren 5. Zij spraken pluripotency-geassocieerde transcriptiefactoren Oct-4 en Nanog plaats van MSC meester toezichthouders Runx2 en SOX9 7. Fenotypisch, mediterrane partnerlanden uitgedrukt endoglin (CD105) op een lager niveau dan MSC&#39;s, terwijl ontbreekt mesenchymale markers CD73, CD90, CD166. MPL toonde ook een kenmerkend patroon van adhesiemoleculen gekenmerkt door consistente expressie van PECAM (CD31), integrines aL (CD 11), αM (CD11b), ax (CD 11 c) en integrine β2 (CD18) die specifiek ondersteunt de voetjes structuren 8 . In standaard MSC expansie media, MTR prompt gedifferentieerd in MSC&#39;s via een tussenstap met de activering van Wnt5 / Calmodulin cell signaling 9. Mediterrane partnerlanden ook behouden angiogene eigenschappen, zoals aangetoond door hun vermogen om te ontkiemen van sferoïden in muizen extracellulaire matrix (ECM) eiwitten 3D culturen. De angiogene potentiële werd snel verloren na MPC differentiatie langs de mesengenic lineage. Hier presenteren we proprotocollen geoptimaliseerd om te isoleren en zeer gezuiverd mediterrane partnerlanden van HBM bloedmonsters te karakteriseren. Reproduceerbare protocollen voor MPC mesengenic en angiogene differentiatie beschreven.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD Bioscience (San Jose, CA-USA)</td><td>354230</td><td>Murine ECM proteins Stock Concentratie: 100% (9 - 12 mg/ml) Eindconcentratie: 100%</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m Filters</td><td>Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM&nbsp;</td><td>GE Healthcare (Uppsala, Sweden)</td><td>17-5442-03</td><td>medium voor discontinu densiteitsgradientcentrifugering</td></tr><tr><td>Pooled human AB type serum (PhABS)</td><td>LONZA (Walkersville MD-USA)</td><td>14-490E</td><td>Eindconcentratie: 10%</td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA USA)</td><td>35050-038</td><td>Gestabiliseerde L-Glutamine Stock Concentratie: 100x Eindconcentratie: 2 mM</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>A8412</td><td>Stock Concentratie: 7,5% Eindconcentratie: 0,5%</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>S8032</td><td>Eindconcentratie: 0,02%</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (Pen Strep)</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td>Antibiotica Stock Concentratie: 5.000 UI/ml penicilline, 5.000 &#956;g/ml Streptomycine Eindconcentratie: 50 UI/ml penicilline, 50 &#956;g/ml Streptomycine</td></tr><tr><td>T-75 kweekkolf voor suspensiekweek</td><td>Greiner Bio-one&nbsp; (Frickenhausen, Germany)</td><td>658 190</td><td></td></tr><tr><td>T-75 kweekkolf TC behandeld</td><td>Greiner Bio-one&nbsp; (Frickenhausen, Germany)</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA USA)</td><td>12563-011</td><td>Diervrije proteases losmaakmiddel Stock Concentratie: 1x Eindconcentratie: 1x</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA USA)</td><td>15400-054</td><td>Fenol rood vrij Stock Concentratie: 0,5% Eindconcentratie: 0,25%</td></tr><tr><td>anti-CD90 APC antilichaam&nbsp; (CD90)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-095-402</td><td>Eindconcentratie: 1:40</td></tr><tr><td>anti-CD45 APC-Vio770 antilichaam (CD45)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-096-609</td><td>Eindconcentratie: 1:40</td></tr><tr><td>anti-CD73 PE antilichaam (CD73)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-095-182</td><td>Eindconcentratie: 1:40</td></tr><tr><td>anti-CD31 PE Vio-770 antilichaam (CD31)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-105-260</td><td>Eindconcentratie: 1:40</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 APC antilichaam</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-098-846</td><td>Eindconcentratie: 1:40</td></tr><tr><td>Mouse IgG2a APC Vio770 antilichaam</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-096-637</td><td>Eindconcentratie: 1:40</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 PE antilichaam</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-098-845</td><td>Eindconcentratie: 1:40</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 PE Vio-770 antilichaam</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-098-563</td><td>Eindconcentratie: 1:40</td></tr><tr><td>Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium&nbsp; (DMEM)</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA USA)</td><td>13-1331-82</td><td>Fenol rood vrij minimaal essentieel medium Stock Concentratie: 1.000 mg/L glucose</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp; (FBS)</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA USA)</td><td>10500</td><td>Stock Concentratie:0,2 mg/ml Eindconcentratie: 2 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagens met 4&rsquo;,6-diamidino-2-fenylindole</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp; USA)</td><td>P-36931</td><td>Waterige montagemedium + DAPI Eindconcentratie: 1x</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>P6148</td><td>Fixeermiddel Eindconcentratie: 4%</td></tr><tr><td>LAB-TEK tweekamerkamer slides</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>C6682</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin antilichaam [clone 10C2]</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>ab2035</td><td>Stock Concentratie: 1 mg/ml Eindconcentratie: 7 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Phalloidin</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA USA)</td><td>A34055</td><td>Stock Concentratie: 200 UI/ml Eindconcentratie: 5 UI/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Euroclone (Milan, Italy)</td><td>EMR237500</td><td>Eindconcentratie: 0,05%</td></tr><tr><td>MesenPRO RS Medium&nbsp; (MSC-RS medium)</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA USA)</td><td>12746-012</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-muis SFX kit</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA USA)</td><td>A31619</td><td>Geit anti-muis secundair antilichaam + Signaalversterker Stock Concentratie: 2 mg/ml Eindconcentratie: 2 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Kartell Labware&nbsp; (Noviglio (MI), ITALY )</td><td>329</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS AdipoDiff&nbsp; Media</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-091-679</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS OsteoDiff&nbsp; Media</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-091-67

isoleren mesangiogenic progenitor cells (mtr) van human bone marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In een onderzoeksstudie gericht op het isoleren van van menselijk beenmerg (hBM) afgeleide mesenchymale stromale cellen (MSCs) voor klinische toepassingen, identificeerden we een nieuwe celpopulatie specifiek geselecteerd voor groei in met menselijk serum aangevuld medium. Deze cellen worden gekenmerkt door morfologische, fenotypische en moleculaire kenmerken die verschillen van MSCs en we noemden ze Mesodermale Voorlopercellen (MPCs). MPCs zijn rond, met een dikke, sterk lichtbrekende kernregio; ze vertonen een sterke, trypsine-resistente hechting aan plastic. Het falen om MPCs direct te laten groeien, toonde aan dat ze langzaam in de celcyclus zijn. Dit wordt ook gesuggereerd door Ki-67-negativiteit. Aan de andere kant, het kweken van MPCs in standaard medium ontworpen voor MSC-expansie, gaf aanleiding tot een populatie van exponentieel groeiende MSC-achtige cellen. Naast het vertonen van mesenchymatische differentiatiecapaciteit, behielden MPCs angiogeen potentieel, wat hun meervoudige lijn voorlopercellen-natuur bevestigt. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, zeer reproduceerbaar protocol om hBM-MPCs te isoleren en te karakteriseren door middel van flowcytometrie (CD73, CD90, CD31 en CD45), nestine-expressie en F-actine organisatie. Protocollen voor mesengene en angiogeen differentiatie van MPCs worden ook verstrekt. Hier suggereren we ook een meer geschikte nomenclatuur voor deze cellen, die zijn hernoemd als "Mesangiogene Voorlopercellen".

De hier beschreven selectieve kweekomstandigheden hebben de isolatie van een nieuw hechtende en bijna monomorphic celpopulatie toegelaten 1,0% van de HBM-multinationals (0,5-2,0 x 10 6 HBM-multinationals 5-10 ml vers BM monsters) 5,6 . We identificeerden deze grote (40 - 60 micrometer in diameter), afgerond, rustige, Ki-67-negatieve cellen als MTR 5. Morfologisch, worden ze gekenmerkt door een opvallende gebakken ei-vorm met een dikke kerngebied omgeven door een vlakke dunne periferie blijkt veel filopodia bij een hogere vergrotingsfactor (witte pijlen in figuur 1 A.1). Polaire verlenging van de buitenste celbegrenzing wordt vaak waargenomen (zwarte pijlen in figuur 1 A.1). Dergelijke morfologie duidelijk verschilt van de typische spoelvormige mesenchymale stromale cel verschijning gerapporteerd in standaard MSC-culturen. Flowcytometrie toonde meer dan 95% van de vers geïsoleerde mediterrane partnerlanden aan CD31 en CD45, terwijl m uitdrukkenesenchymal geassocieerde merkers CD90 en CD73 13 niet detecteerbaar (Figuur 1 A.2). Wij beschouwen deze beperkte set van vier antigenen als indicatief voor MTR. Verdere onderscheidende kenmerken van MPL zijn bezaaid F-actine distributie onthullen een aantal van de voetjes structuren (rood in figuur 1 A.3) en intense expressie van nestin (groen in figuur 1 A.3), die niet gedetecteerd in de cellen gekleurd met isotype controle antilichaam (gegevens niet getoond). Het kweken van MTR in standaard RS medium ontworpen voor MSC expansie resulteert in een snelle differentiatie in exponentieel groeiende MSC-achtige cellen (Figuur 1 B.1). Na twee passages cellen uiteindelijk schakelen hun fenotype van CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + aan CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg (figuur 1 B.2). In het proces, MTR re-organize F-actine in stress-vezels terwijl nestin expressie beperkt wordt tot enkele zeldzame cellen (figuur 1 B.3). MPC mesengenic differentiatie tot een bepaalde MSC-fenotype ontstaat door twee afzonderlijke stappen blijkt uit andere cel morfologie. Na een week in MSC RS medium een resterende populatie van MPC-achtige cellen is nog steeds waarneembaar binnen een confluente laag van platte, veelhoekige multi-vertakte cellen (P1-MSC&#39;s in figuur 2 A). Een verdere doorgang moet bijna monomorfisch cultuur van spoelvormige MSC-achtige cellen te verkrijgen (P2-MSC in figuur 2 A). Deze exponentieel groeiende cellen kan gemakkelijk differentiëren tot osteoblasten of adipocyten wanneer overgebracht in selectief medium gedurende ten minste 2 weken, waardoor hun MSC aard bevestigd. In osteogene geïnduceerde kweken, kan kalkaanslag worden gedetecteerd door ofwel colorimetrisch alizarine-S vlek of specifieke fluorescente kleurstoffen (groen in figuur 2 B). Na adipogenic inductie cellentonen lipide droplet accumulatie blijkt uit ofwel colorimetrisch of fluorescent Oil Red Nile Red kleuring (rood in figuur 2 B). MPC typering werd bevestigd door kiemen angiogenese assay. Mediterrane partnerlanden toonden hun vermogen om binnenvallen (meer dan 50 micrometer) muizen ECM eiwit gel van 3D bolletjes na 24 hr VEGF-stimulus (figuur 2 C). Na één week binnendringende cellen werden gedetecteerd bij 300-600 urn afstand. Omgekeerd werd invasie capaciteit verloren in P2-MSC&#39;s na mesengenic differentiatie (figuur 2 D). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig1.jpg" /> Aanleiding tot een populatie van rustende MTR (A) gemakkelijk te onderscheiden van MSC&#39;s (B) Figuur 1. vers geïsoleerde MTR hebben onderscheidende kenmerken. Het kweken HBM-multinationals in DMEM / 10% PhABS zeven dagen geeft </strong&gt; op het vlak van de morfologie (A.1, B.1, schaal bars = 100 pm), fenotype (A.2, B.2), F-actine distributie (rood in A.3, B.3), en nestin expressie (groen in A.3, B.3, schaal bars = 20 pm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54225/54225fig1large.jpg" target="_blank">klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig2.jpg" /> Figuur 2. mediterrane partnerlanden differentiëren naar Standard MSC&#39;s en Show Kiemen Angiogenese in vitro. Vervanging van DMEM / PhABS met commercieel verkrijgbare RS medium ontworpen voor MSC expansie triggers mesengenic inductie van de mediterrane partnerlanden. Na een week in de cultuur paar resterende MTR nog aantoonbaar (P1-MSC&#39;s), terwijl een verdere passage in MSC-RS medium leidt tot een populatie van confluente MSC-achtige cellen (P2-MSC, A schaal bars = 100 pm). P2-MSC&#39;s terminaal differentiëren in osteocytes of adipocyten onder de juiste stimuli zoals blijkt uit calcium afzetting (groen in B) en lipide-druppel accumulatie (rood in B, schaal bars = 200 pm), respectievelijk. Mediterrane partnerlanden tonen consistente ontspruit uit sferoïden in muizen ECM eiwit gel (C) bij een verschil met P2-MSC&#39;s (D, schaal bars = 1,0 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54225/54225fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, zeer reproduceerbaar protocol om Mesodermale Voorlopercellen (MPCs) te isoleren uit menselijk beenmerg (hBM). MPCs werden gekenmerkt door middel van flowcytometrie en nestine-expressie. Ze toonden het vermogen om aanleiding te geven tot exponentieel groeiende MSC-achtige celculturen terwijl ze hun angiogenesepotentieel behielden.

Isoleren Mesangiogenic Progenitor Cells (MTR) van Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Het algemene doel van deze procedure is om mesangiogene progenitorcellen of MPC's uit het menselijk beenmerg te isoleren door middel van selectieve kweekcondities. We testen zowel hun mesogene als angiogene potentieel. Mesangiogene progenitorcellen worden in een laag percentage geïdentificeerd met een mesenchymale stromale celkweek die is geoptimaliseerd voor klinische toepassing.Wanneer FBS wordt vervangen door menselijk serum. Deze techniek is uniek; in feite maakt het een zeer consistente isolatie mogelijk van een groot aantal alli-pol-ified NPC's die geschikt zijn voor sprouting angiogenese en het genereren van gesynchroniseerde MSC-culturen. We ontdekten dit toen er, na trips in de digestie van MCS-culturen in een talgrum serum, enkele cellen in de vorm van gebakken eieren gehecht bleven, maar differentieerden naar MC's na FPS-behandeling.Om menselijke mononucleaire cellen uit het beenmerg (MNC's) te isoleren, begint u met het verdunnen van vijf tot 10 milliliters vers beenmerg tot een totaalvolume van 50 milliliters met DPBS en mengt u de celoplossing door omkering. Verdeel vervolgens 25 milliliters cellen gelijkmatig over twee nieuwe conische buizen van 50 milliliter en voeg aan elke buis 25 milliliters verse DPBS toe voor een tweede menging door omkering. Laat de cellen daarna rusten bij kamertemperatuur om de minerale botfragmenten en het vet te laten scheiden van de oplossing.Verwijder na 10 minuten voorzichtig het drijvende vet met een Pasteurpipet en filter de cel-suspensies door individuele filters van 70 micron zonder de pellets van de minerale botfragmenten te verstoren. Om de MNC-laag te isoleren, worden 20-25 milliliter van het verdunde beenmerg bovenop een densiteitsgradiëntmedium van 1,007 gram per milliliter op kamertemperatuur geplaatst in elk van twee buizen van 50 milliliter, waarna de cellen door centrifugatie worden gescheiden. Gebruik vervolgens een steriele Pasteurpipet om de witachtige cellenringen op de interfaces te verzamelen in een nieuwe buis van 50 milliliter.Was de geïsoleerde mononucleaire cellen gedurende vijf minuten bij 400 ×g en kamertemperatuur met vers kweekmedium. Resuspendeer de pellet vervolgens in 5 tot 10 mL vers kweekmedium. Om de MPC te isoleren, worden hydrofobe T75-flessen geëquilibreerd met 15 mL vers kweekmedium bij 37 °C en 5% CO2.Zaai na 30 minuten vier tot zes keer 10⁷ menselijke beenmerg mononucleaire cellen per kolf voor een incubatie van 48 uur. Verwijder op de tweede dag het medium en de niet-adherente cellen uit de kolven en voeg 15 ml vers cultuurmedium toe aan de cellen. Plaats de culturen voor zes tot acht dagen terug in de incubator.Was na afloop van de incubatie de adherente cellen met vers DMEM. Incubeer de cellen vervolgens gedurende vijf tot 15 minuten bij 37 °C met twee milliliter diervrije proteas-detacheringsoplossing. Wanneer de cellen zijn losgelaten van de bodem van de kolf, voeg dan 10 milliliter vers kweekmedium toe om de reactie te stoppen en verzamel de cellen door middel van centrifugatie, waarbij de pellet wordt geresuspendeerd in één tot twee milliliter vers kweekmedium.Nadat de MPC-plaat is geteld, worden 2 x 10⁴ cellen per vierkante centimeter overgebracht naar T75-kweekflessen die zijn behandeld voor weefselkweek; laat de cellen vervolgens gedurende de nacht hechten in 15 milliliter vers kweekmedium in de cellenkweekincubator. Vervang de volgende ochtend het kweekmedium door 200 microliter per vierkante centimeter MSC-expansiemedium en kweek de cellen nog eens zeven tot 10 dagen. Wanneer de culturen confluentie hebben bereikt, worden ze gesubcultiveerd op 3 tot 5 x 10³ cellen per vierkante centimeter totdat passage 2 van de MSC's een nieuwe confluentie bereikt, waarna proteasedigestie wordt uitgevoerd om de cellen te oogsten zoals eerder gedemonstreerd.Zaai 2 × 10⁴ cellen per vierkante centimeter uit in met weefselkweek behandelde zeswellplaten met vers expansiemedium. Nadat de culturen opnieuw tot confluentie zijn gegroeid, markeer twee wells als 'geen differentiatie' en ververs het expansiemedium. Markeer twee wells als 'osteoblasten' en vervang het medium door 200 µL per vierkante centimeter standaard osteogeen medium, specifiek ontwikkeld voor MSC-differentiatie.Markeer vervolgens twee wells als adipogene sites en vervang het medium door 200 µL per vierkante centimeter standaard adipogeen medium, specifiek ontworpen voor MSC-differentiatie. Plaats de cellen gedurende twee tot drie weken terug in de celcultuurincubator totdat de cellen gedifferentieerd zijn. Ga vervolgens over tot fluorescentiedetectie van extracellulaire calciumafzettingen en intracellulaire accumulatie van lipidedruppels.Om 3D-sferoïden te produceren, worden een groot aantal druppels van 20 µL vers geïsoleerde MPC-suspensie gezaaid op het binnenoppervlak van het deksel van een petrischaal. Wanneer alle druppels zijn geplaatst, wordt het deksel voorzichtig op de bodem van een petrischaal geplaatst die DPBS bevat om verdamping van de hangende druppels te voorkomen, waarna de plaat overnacht in de celkweekincubator wordt geplaatst. De volgende ochtend worden aliquots van 300 µL standaard extracellulaire matrixeiwitten toegevoegd aan elke put van een 24-wells kweekplaat bij 4 °C, waarna de matrixeiwitten 30 minuten bij 37 °C laten geleren.Voeg 700 µL standaard vasculair endotheliale groeifactor-rijk endotheliale celgroeimedium toe aan de gegelde ECM-eiwitten. Wanneer de MPC zijn geaggregeerd tot 3D-sferoïden, wordt het deksel van de petrischaal voorzichtig omgedraaid en wordt een steriele pasteurpijpet gebruikt om de sferoïden voorzichtig te oogsten. Zaai tot slot de sferoïden uit in de kweekputjes en plaats de plaat terug in de incubator.Morfologisch worden MPC's gekenmerkt door hun kenmerkende vorm als een gebakken ei, met een dikke kernregio omringd door een platte, dunne periferie met veel filopodia. Polaire verlenging van de buitenste celgrens wordt ook vaak waargenomen. MPC-cultuur in MSC-expansiemedium resulteert in een snelle maar gedeeltelijke differentiatie naar prolifererende, platte en vertakte cellen, waarbij residuele ongedifferentieerde MPC's nog steeds detecteerbaar zijn.Na een verdere passage resulteren de culturen in een monolaag van exponentieel groeiende MSC-achtige cellen. Tijdens dit proces reorganiseren de MPC's hun F-actine tot stressvezels, terwijl de Nestin-expressie beperkt blijft tot enkele zeldzame cellen. Flowcytometrie van vers geïsoleerde MPC's laat zien dat meer dan 95% van de cellen CD31 en CD45 tot expressie brengt, maar de mesenchymale geassocieerde antigenen CD90 en CD73 mist.Deze laatste antigenen worden sterk tot expressie gebracht pas na een volledige differentiatie tot MSC. Om hun mesenchymale aard te bevestigen, kunnen deze cellen, wanneer ze gedurende ten minste twee weken met differentiatiemedium worden gevoed, gemakkelijk worden geïnduceerd tot osteoblasten, zoals aangegeven door hun calciumafzettingen, of tot adipocyten, zoals blijkt uit de accumulatie van lipidedruppels. Hiermee wordt de MSC-aard van de predifferentieerde celculturen bevestigd.De MPC-typering wordt verder bevestigd in een sprouting angiogenesis-assay, waarbij de cellen het vermogen vertonen om na 24 uur stimulatie met vasculaire endotheliale groeifactor vanuit 3D-sferoïden een myrian extracellulaire matrixproteïnegel binnen te dringen. Na een week migreren de invaderende cellen over een nog grotere afstand; een invasiecapaciteit die in MSC's in de tweede passage na mesengene differentiatie verloren gaat. Eenmaal beheerst kunnen de MSC-culturen in één uur worden opgezet indien dit correct wordt aangepakt, wat binnen minder dan een week tussen één en twee miljoen MPC's oplevert.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de prestaties van menselijke CR-batches te evalueren voordat ze in culturen worden gebruikt. Op dit moment is ons MPC-isolatieprotocol de enige methode om een reproduceerbare, nagenoeg zuivere MC-cultuur te verkrijgen voor verdere downstream-toepassingen. Na de ontwikkeling van deze techniek heeft deze de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van celgebaseerde therapieën om de mogelijkheid te verkennen om MPC toe te passen bij skeletweefselregeneratie.

isolating-mesangiogenic-progenitor-cells-mpcs-from-human-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

Bloedvaten in de menselijke skeletspier haven diverse multi-lineage voorloper populaties die ideaal is voor regeneratieve toepassingen zijn. Deze isolatie methode maakt gelijktijdige zuivering van drie multipotente precursor celpopulaties respectievelijk uit drie structurele lagen van de bloedvaten: myogene endotheelcellen van de intima, pericytes van media en adventitia cellen van adventitia.

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 + CD34 - pericyten en CD34 + CD146 - adventitia-cellen van de menselijke hartspier.

Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

Het kweken van menselijke mesenchymale stromale cellen (hMSCs) met autologe serum, vermindert het risico op afwijzing door xenogene materiaal en andere negatieve effecten. Het staat ook voor het herstel van een subset van mesodermale voorlopercellen, die een frisse hMSCs kan leveren. Inbedding hMSCs in een autoloog fibrinestolsel maakt een eenvoudige bediening en effectieve chirurgische implantatie.

Mesenchymale stromale Cell Cultuur en Levering in autologe Voorwaarden: een slimme aanpak voor orthopedische toepassingen

Hier presenteren we een nieuwe klinische rang isolatie en cultuur methode voor nieren gerelateerde stromale cellen (kPSCs) op basis van hele orgel perfusie met spijsverteringsenzymen en NG2-cel verrijking. Met deze methode is het mogelijk om het verwerven van voldoende cel nummers voor cellulaire therapie.

Een nieuwe klinische Grade isolatie methode voor menselijke nieren gerelateerde stromale cellen

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Hier presenteren we een protocol om te isoleren en te cultiveren lymfkliertest peritoneale mestcellen. Ook beschrijven we twee protocollen voor hun functionele karakterisering: een fluorescerende beeldvorming van intracellulaire gratis Ca2 + concentratie en een degranulatie kwantitatieve analyse gebaseerd op colorimetrische kwantificering van de vrijgegeven β-hexosaminidase.

Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests

We presenteren technieken voor het isoleren, kweken, karakteriseren en differentiëren van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc's) verkregen uit skeletspieren biopsie weefsel.  hmpc's verkregen en gekenmerkt door middel van deze methoden kunnen worden gebruikt om vervolgens onderzoek vragen met betrekking tot menselijke myogenese en skeletspier regeneratie aan te pakken.

Isolatie, cultuur, karakterisering, en differentiatie van menselijke spier voorlopercellen van de skeletspier biopsie procedure

Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia's en bekkenbotten.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Het huidige protocol beschrijft een kosteneffectieve methode om zeer homogene beenmergmesenchymale stamcellen (BMSC's) van muizen te zuiveren, uit te breiden en te karakteriseren. Deze aanpak vergemakkelijkt de verwerving van grote hoeveelheden BMSC's met een hoog proliferatie- en differentiatiepotentieel, het ondersteunen van muismodellen en het bevorderen van preklinisch onderzoek.

Zuivering, expansie en op flowcytometrie gebaseerde fenotypering van van muizen afgeleide beenmergmesenchymale stamcellen

Leer een betrouwbaar protocol voor het isoleren van mesodermale progenitorcellen uit menselijk beenmerg met dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode karakteriseert MPC's via flowcytometrie en nestine-expressie voor regeneratieve geneeskunde.

Isoleren Mesangiogenic Progenitor Cells (MTR) van Human Bone Marrow

Meer video's verkennen