Isoleren Mesangiogenic Progenitor Cells (MTR) van Human Bone Marrow

Het algemene doel van deze procedure is om mesangiogene voorlopercellen of MPC te isoleren uit het menselijk beenmerg door selectieve kweekcondities. We testen zowel hun mesogeen als angiogeen potentieel. Mesangiogene voorlopercellen worden geïdentificeerd in een laag percentage met een mesen-ki-ma-stro-mo celkweek geoptimaliseerd voor klinische toepassing.

Wanneer FBS wordt vervangen door menselijk serum. Deze techniek is uniek omdat het een zeer consistente isolatie van een groot aantal alli-pol-ified NPC's toestaat, geschikt voor ontluikende angiogenese en een generatie van gesynchroniseerde MSC-kweek. We ontdekten dit toen na trips in de vertering van MCS-kweek in een talgrumserum enkele vriendjesvormige cellen achterbleven, maar gedifferentieerd waren in MC's na FPS-behandeling.

Om menselijke beenmergmononucleaire cellen of MNC te isoleren, begint u met het verdunnen van vijf tot tien milliliter vers beenmerg tot een totaal volume van vijftig milliliter met DPBS en mengt u de celoplossing door omkering. Verdeel vervolgens gelijkmatig 25 milliliter cellen in twee nieuwe 50 milliliter kegelbuisjes en voeg 25 milliliter vers DPBS toe aan elke buis voor een tweede menging door omkering. Laat de cellen vervolgens op kamertemperatuur rusten om de minerale beenfragmenten en vet te scheiden van de oplossing.

Na tien minuten gebruikt u een pasteurpipet om voorzichtig het drijvende vet te verwijderen en de celsuspensies te filteren door individuele 70 micron filters zonder de minerale beenfragmentpelletten te verstoren. Om de MNC-laag te isoleren, plaatst u 20-25 milliliter van de verdunde beenmerg op kamertemperatuur 1,007 gram per milliliter dichtheidsgradiëntmedium in elk van twee 50 milliliter buisjes en scheidt u de cellen door centrifugatie. Gebruik vervolgens een steriele pasteurpipet om de witte cellenringen aan de entergezichten in een nieuw 50 milliliter buisje te verzamelen.

Was de geïsoleerde mononucleaire cellen gedurende vijf minuten bij 400 keer G en kamertemperatuur met vers kweekmedium. Hersuspenseer vervolgens de pellet in vijf tot tien milliliter vers kweekmedium. Om de MPC te isoleren, brengt u hydrofobe T75-kolven in evenwicht met 15 milliliter vers kweekmedium bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide.

Na dertig minuten zaait u vier tot zes keer 10 tot zeven van de menselijke beenmergmononucleaire cellen per kolf voor een 48 uur durende incubatie. Op de tweede dag gooit u het medium en de niet-aangehechte cellen uit de kolven weg en voedt u de cellen met 15 milliliter vers kweekmedium. Plaats de kweek terug in de incubator gedurende zes tot acht dagen.

Aan het einde van de incubatie wast u de aangehechte cellen met vers DMEM. Vervolgens incubeert u de cellen met twee milliliter diervrije proteas-losoplossing gedurende vijf tot vijftien minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen van de bodem van de kolf zijn opgetild, voegt u tien milliliter vers kweekmedium toe om de reactie te stoppen en verzamelt u de cellen door centrifugatie en hersuspensie van de pellet in een tot twee milliliter vers kweekmedium.

Na het tellen van de MPC plateert u tweemaal 10 tot de vierde per vierkante centimeter van de cellen in weefselkweek behandelde T75-kweekkolven en laat u de cellen een nacht lang in 15 milliliter vers kweekmedium in de celkweekincubator aanhechten. De volgende ochtend vervangt u het gekweekte medium met 200 microliter per vierkante centimeter misancolmulstromulcel of MSC-expansiemedium en kweekt u de cellen gedurende nog eens zeven tot tien dagen. Wanneer de kweek confluent is, subcultuur op drie tot vijf keer tien tot de derde cellen per vierkante centimeter totdat u een nieuwe confluëntie van passage twee bij MSC bereikt en voert u vervolgens proteas-vertering uit om de cellen te verzamelen zoals eerder aangetoond.

Plateert u tweemaal tien tot de vierde cellen per vierkante centimeter in weefselkweek behandelde zes-putjes platen en vers expansiemedium. Nadat de kweek weer confluent is, markeert u twee putjes als geen differentiatie en ververst u het expansiemedium. Markeer twee putjes als osteo blasten en vervang het medium met 200 microliter per vierkante centimeter van standaard osteo gene medium specifiek ontworpen voor MSC-differentiatie.

Markeer vervolgens twee putjes als adipo sites en vervang het medium met 200 microliter per vierkante centimeter van standaard adipo gene medium specifiek ontworpen voor MSC-differentiatie. Breng de cellen terug naar de celkweekincubator gedurende twee tot drie weken totdat de cellen zijn gedifferentieerd. Ga vervolgens door naar fluorescente detectie van extracellulaire calciumafzettingen en introcellulaire lipidedruppeltjesophoping.

Om 3D-sferoïden te produceren, zaait u een groot aantal van 20 microliter druppels van vers geïsoleerde MPC-suspensie op het binnenoppervlak van een petrischaaldik. Wanneer alle druppels zijn geplaatst, plaatst u voorzichtig de deksel op een petrischaalbasis met DPBS om verdamping van de hangende druppel te voorkomen en plaatst u de plaat in de celkweekincubator gedurende de nacht. De volgende ochtend voegt u 300 microliter allo-quats van standaard extracellulaire matrixeiwitten toe aan elke put van een 24-putjes kweekplaat bij vier graden Celsius en gelt u de matrixeiwitten bij hun 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Voeg 700 microliter standaard vasculair endotheliaal groeifactorrijk endotheliaal celgroeimedium toe aan de gelde ECM-eiwitten. Wanneer de MPC geaggregeerd zijn tot 3D-sferoïden, keert u voorzichtig de petrischaaldik om en gebruikt u een steriele pasteurpipet om de sferoiden voorzichtig te oogsten. Zaait u vervolgens de sferoiden in de kweekputjes en plaatst u de plaat terug in de incubator.

Morphologisch worden MPC gekenmerkt door hun kenmerkende vriendjesvorm met een dikke kernregio omringd door een vlakke dunne periferie met veel filipodia. Polaire verlenging van de buitenste cellengrens wordt ook vaak waargenomen. MPC-kweek in MSC-expansiemedium resulteert in de snelle maar gedeeltelijke differentiatie in proliferatieve platte en veelvertakte cellen met resterende on