Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol

Het algemene doel van deze procedure voor adaptieve evolutie is het verkrijgen van robuuste stammen van de inheemse xylose-fermenterende gist scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 die de hexose- en pentosesugers in niet-gedetoxificeerde hydrolyzaten sneller kunnen fermenteren tot economisch winbare ethanol. Deze methode brengt de lignocellulose-naar-ethanolindustrie vooruit door een routekaart te bieden naar stammen met complexe modificaties, waardoor fermentatie van suikers in hydrolyzaten mogelijk wordt die microbiële inhibitoren bevatten. Hier is het belangrijkste voordeel van gerichte evolutie dat robuuste stammen worden gevormd uit een inheemse gist die in staat is xylose te fermenteren, waardoor het niet langer nodig is om industriële saccharomyces-stammen genetisch te modificeren.

We stelden vast dat het onwaarschijnlijk was dat een enkele giststam robuust zou zijn in verschillende soorten hydrolysaten, zoals AFEX-voorbehandelde maïsstengels of met verdund zuur voorbehandeld switchgrass. Het vermogen van scheffersomyces stipitis om een seksuele reproductiecyclus te doorlopen is gunstig voor verdere exploitatie in het huidige werk, omdat de verschillende ontwikkelde stammen gecombineerd kunnen worden tot één meer robuuste stam door middel van paring van stammen met deze verschillende eigenschappen. De procedure zal worden gedemonstreerd door co-auteurs Stephanie Thomson en Maureen Shea-Andersh, die biologisch wetenschappelijk technici zijn in mijn laboratorium.

Bereid vóór het starten van deze verrijkingsprocedure een precultuur van stam NRRL Y-7124 voor in een kolf van 125 milliliter en een verdunningsreeks van het enzymatisch gesacharificeerde ammonia fiber expansion pretreated corn stover hydrolysaat, of AFEX CSH. Gebruik een multistep-pipet om een microtiterplaat met 96 wells te vullen met 15 µL per well, en acht wells per hydrolysaatverdunning. Inoculeer met enkele µL precultuur per well om een initiële absorptie bij 620 nanometer, of A620, van groter dan of gelijk aan 0,1 te verkrijgen.

Plaats de microplaat in een plastic doos met een nat vel keukenpapier voor de vochtigheid en incubeer deze statisch gedurende 24 tot 28 uur bij 25 graden Celsius. Gebruik vervolgens een spectrophotometer voor microplaten om de culturen te identificeren die fysiek zijn gegroeid tot een A620 groter dan 1,0 in de meest geconcentreerde hydrolysaatverdunning. Voeg de geïdentificeerde wells samen in een microcentrifugebuis en verdeel deze over een vulplaat.

Breng één tot vijf µL over van de vulplaat naar elke put van een nieuwe verdunningsreeks van het hydrolysaat om een initiële A620 van groter dan of gelijk aan 0,1 te bereiken en incubeer de plaat zoals voorheen. Monitor de groei van de culturen in de microplaat met een microplaat-spectrofotometer. Maak regelmatig glycerolvoorraden van de adaptatieculturen.

Combine vier wells met de hoogste hydrolysaatconcentratie die gekoloniseerd zijn in een cryofile, en meng deze in een verhouding van één op één met 20% steriele glycerol. Vries de cellen in bij minus 80 graden Celsius. Herhaal deze verrijkingsprocedure totdat groei in 12% glucaan AFEX CSH consistent zichtbaar is na 24 uur.

Om deze procedure te starten, worden geselecteerde glycerolstocks van adaptatieculturen uitgestreken op gistmaltpepton-dextrose-agar, of YM-agar. Gebruik na de groei de strepen om drie microplate-wells te inoculeren met elk 50 µL van 3% of 6% glucaan AFEX CSH. Incubeer de microplate gedurende 24 uur bij 25 °C.

Voeg de gekoloniseerde wells met de hoogste hydrolysaatsterkte en sterke groei samen. Maak verdunningsplaten op YM- of 6% glucaan AFEX CSH-agar. Incubeer de platen in een incubator van 25 degree Celsius gedurende 24 tot 48 uur.

Selecteer vijf enkelvoudige kolonies van de plaat met de hoogste verdunning die groei vertoont om deze als glycerolstockculturen te invriezen. Ent elke kolonie uit op een YM-plaat en incubeer deze gedurende 24 uur. Breng met een steriele lus een volgroeid uitstrijkje cellen over naar een klein volume 10% glycerol om de cellen te suspenderen en verdeel dit over twee tot drie cryovials voor invriezing bij minus 80 graden Celsius.

Om isolaten te testen in eenvoudige 6%glucan AFEX CSH batchculturen, worden cellen van 48 uur oude platen, uitgestreken vanuit glycerolstocks, overgebracht naar pH 7 kaliumfosfaatbuffer om celsuspensies te bereiden. Na het meten van de optische dichtheid van elke celsuspensie wordt het volume met extra buffer aangepast om een A620 van tien te bereiken. Gebruik één µL van elke suspensie om elk van vier wells met 50 µL 3%glucan hydrolysaat te inoculeren tot een initiële A620 van 0,2.

Incubeer de microplaat gedurende 24 uur. Draag vervolgens de inhoud van twee wells van de 24 uur oude microplaat over om preculturen van 25 milliliter 6% glucaan AFEX CSH bij pH 5 te inoculeren. Sluit de kolven met siliconen sponsdoppen en incubeer gedurende 24 uur bij 25 °C en 150 RPM.

Gebruik de 6%glucan AFEX CSH-voorkleuren om soortgelijke groeiculturen van 25 milliliter in dubbelvoud te inoculeren tot een initiële A620 van 0,1. Incubeer de groeiculturen gedurende 24 uur bij 25 graden Celsius en 150 RPM. Om het dioxische gebrek aan isolaten in batchculturen van optimaal gedefinieerd medium, of ODM, met gemengde suikers te testen, inoculeer voorkleuren van 75 milliliter ODM met 150 gram per liter xylose in kolven van 125 milliliter met siliconensponsdoppen.

Incubeer gedurende 24 uur bij 25 °C en 150 RPM. Gebruik de preculturen om twee soortgelijke 75 milliliter testculturen te inoculeren tot een A620 van 0,1 in ODM met 75 gram per liter glucose en 75 gram per liter xylose bij pH 6,5. Schud de erlenmeyers bij 25 °C en 150 RPM.

Bereid 24 uur vóór het inoculeren van een continue cultuur een precultuur van een representatieve AFEX CSH-tolerante kolonie in ethanolvrije ODM voor in een fles van 125 milliliter. Gebruik vijf tot 10 milliliter van de precultuur van het AFEX CSH-tolerante isolaat om 100 milliliter ODM in een gejaakte spinner-fles van 100 milliliter te inoculeren om een initiële A620 van 0,5 te verkrijgen. Houd het cultuurvolume op 25 graden Celsius.

Roer het mengsel bij 200 RPM en rust het uit met een steriliseerbare pH-elektrode, een pH-regelaar en een temperatuurgecontroleerd circulerend waterbad. Omdat de celgroei in het begin traag zal zijn door de blootstelling aan ethanol, dient er een pH-gestuurde pomp te worden ingesteld zodat, wanneer de cultuurfermentatie de pH verlaagt tot 5,4, de pomp pH 6,3 ODM met 100 g/L xylose en 50 g/L ethanol toevoegt om verdere pH-dalingen te stoppen. Handhaaf het volume op 100 milliliter met een effluentpomp die continu het cultivoppervlak afstroomt.

Meet het opgevangen effluentvolume en neem elke 48 tot 72 uur monsters van de continue culturen voor analyse van de levensvatbare celconcentratie, producten en substraten zoals beschreven in het manuscript. Bewaar regelmatig glycerolstocks door koloniën te isoleren van levensvatbaarheidplaten van gebufferde monsterverdunningen die 30 tot 100 koloniën vormen, wat de meest prevalente robuuste koloniën op dat moment in de verrijking vertegenwoordigt. Overstroom de platen met vijf milliliter 10%glycerol om de bereiding van dubbele cryofiles mogelijk te maken.

Indien culturen gestaag kunnen groeien bij specifieke groeisnelheden van meer dan 0,01 per uur op xylose in de aanwezigheid van meer dan 25 gram per liter ethanol, start dan de continue cultuurvoeding bij een lage verdunningssnelheid van ongeveer 0,01 per uur in het houdevolume van 100 milliliter. Verhoog na verloop van tijd de hoeveelheid ethanol in de voeding richting 50 gram per liter. Ultraviolette bestraling van inocula voor het herstarten van continue culturen is een optie om de mutatiesnelheid te versnellen.

Sla geavanceerde populaties op in glycerolstocks. Voordat enkelvoudige celkolonies worden geïsoleerd, worden glycerolstockpopulaties met een verbeterde xylosefermentatie in aanwezigheid van ethanol geïdentificeerd zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik deze superieure populaties om platen uit te strijken.

De uitgestreken platen worden gebruikt om dichte gebufferde cel-suspensies te bereiden met een A620 gelijk aan vijf. Vervolgens worden de cel-suspensies gebruikt om preculturen in 96-wells deepwellplaten te inoculeren. Incubeer gedurende 48 uur bij 25 °C, 400 RPM en een orbit van één inch.

Verrijk vervolgens de tolerante kolonies door elke precultuur te gebruiken voor het inoculeren van 16 replica-culturen van één milliliter tot een initiële A620 van 0,5 in zuur voorbehandeld switchgrass-hydrolysaat, één-op-één gemengd met ODM plus 50 g/L xylose, en voldoende ethanol om een ethanolconcentratie van 20, 30 of 40 g/L te verkrijgen. Incubeer gedurende 48 uur bij 25 °C, 400 RPM en een orbit van één inch. Oogst voor elke verschillende glycerolstock de cultuurputjes met de hoogste ethanolconcentratie waarbij groei en xyloseverbruik mogelijk waren.

Plate elke cellijn op YM-agar om dominante enkelvoudige kolonies te verkrijgen voor bewaring in glycerol. Selecteer 10 kolonies per cellijn en strijk deze uit op een YM-agarplaat voor de bereiding van glycerolstocks. Na adaptatie op AFEX CSH laat een vergelijking van de fermentatieprestaties in ODM tussen de ouderstam en de geadapteerde populaties zien dat de geadapteerde populaties xylose efficiënter gebruiken om ethanol sneller en in grotere hoeveelheden te produceren.

Een hydrolysaat-tolerante kolonie werd verder ontwikkeld voor verbeterde ethanoltolerantie door middel van continue cultuurselectie op ODM met xylose en hoge concentraties ethanol. Alle aangepaste populaties overtroffen de ouderstam in het vermogen om het xylosemetabolisme te induceren in de aanwezigheid van 40 gram per liter ethanol. Deze grafieken vatten de prestaties samen van superieure tolerante isolaten, beoordeeld op basis van xylose-opnamesnelheden en ethanolopbrengsten ten opzichte van de ouderstam voor elke formulering van PSGHL.

De beste stammen die waren geselecteerd uit de primaire screening op xylose-rijke PSGHL werden vervolgens gescreend op drie volledige hydrolysaten, waarbij de relatieve prestatie-index, of RPI, werd berekend voor de fermentatie van elk isolaat binnen elk hydrolysaat. Vervolgens werden de gecombineerde totale prestatie-indices voor elk isolaat berekend. Vijf isolaten, 3, 14, 27, 28 en 33, hadden totale RPI's boven de 60, waardoor zij werden geclassificeerd als het meest robuust voor alle variaties van hydrolysaat en nutriëntcondities gecombineerd.

Na het bekijken van deze video zou u weten hoe u een xylose-fermenterende gist, zoals scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, kunt onderwerpen aan een gericht evolutieproces, en hoe u robuustere derivaten kunt verrijken, isoleren en evalueren die gemengde suikers in niet-gedetoxificeerde hydrolysaten effectiever fermenteren. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze worden toegepast met een dagelijkse tijdsinvestering van gemiddeld ongeveer een uur per dag. Significante veranderingen in het evolutieproces kunnen in slechts vier maanden worden gedocumenteerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voortschrijdende populaties regelmatig te bewaren door glycerolstocks te bereiden voor invriezing bij -80 °C. Dit maakt herstel van de populatie, periodieke evaluatie, isolatie of het opnieuw starten van het evolutieproces mogelijk. Om verschillende mutaties te beheren, dient men eraan te denken de gist regelmatig te screenen onder procespecifieke condities voor een reeks fenotypes.

De berekening van algemene dimensieloze relatieve prestatie-indexen, of RPI's, op basis van kinetische parameters, maakt het mogelijk om de rangorde van stammen en de robuustheid tegen variaties in fermentatieomstandigheden, zoals het type hydrolysaat en nutriëntensuppletie, te beoordelen. Superieure giststammen die voortkomen uit elke fase van het evolutieproces zijn kandidaten voor genoomsequencing, zodat de aard van de verbeteringen, zoals een verminderde tolerantie voor inhibitoren en een verkorte dioxische lag-fase, begrepen kan worden en kan worden gebruikt voor het ontwerp van biocatalytische stammen van de volgende generatie.