Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol

Het algemene doel van deze adaptieve evolutieprocedure is om robuuste stammen van de inheemse xylose-fermenterende scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 af te leiden die sneller de hexose- en pentose-suikers in ontgifte hydrolysaten kunnen fermenteren tot economisch verantwoord ethanol. Deze methode brengt de lignocellulose naar ethanol industrie vooruit door een wegkaart te bieden naar stammen met complexe modificaties, waardoor fermentatie van suikers in hydrolysaten mogelijk wordt die microbiële remmers bevatten. Hier is het belangrijkste voordeel van gerichte evolutie dat robuuste stammen worden gevormd uit een inheemse gist die xylose kan fermenteren, waardoor de noodzaak om industriële saccharomyces-stammen te ontwikkelen wordt geëlimineerd.

We realiseerden ons dat elke enkele giststam waarschijnlijk niet robuust zou zijn in verschillende soorten hydrolysaten, zoals AFEX-voorbehandeld maïsstro of verdund zuur-voorbehandelde switchgrass. Het vermogen van scheffersomyces stipitis om een seksuele reproductieve cyclus te ondergaan, is gunstig voor verdere exploitatie in het huidige werk, omdat de verschillende stammen die worden ontwikkeld, kunnen worden gecombineerd tot een enkele, robuustere stam door stammen met deze verschillende eigenschappen te laten paren. De procedure zal worden gedemonstreerd door co-auteurs Stephanie Thomson en Maureen Shea-Andersh, die biologische wetenschapstechnici zijn in mijn laboratorium.

Voordat u met deze verrijkingsprocedure begint, bereidt u een precultuur van stam NRRL Y-7124 in een 125 milliliter fles en een verdunningsreeks van het enzym gesaccharifieerde ammoniakvezelexpansie voorbehandelde maïsstro hydrolysaat, of AFEX CSH. Gebruik een herhaalpijp om een 96-wells microplaat te vullen met 15 microliter per well, en acht wells per hydrolysaatverdunning. Inoculeer met een paar microliter precultuur per well om een initiële absorptie bij 620 nanometer, of A620 van minimaal 0,1 te laten ontstaan.

Plaats de microplaat in een plastic doos met een natte papieren handdoek voor vochtigheid en incubeer statisch gedurende 24 tot 28 uur bij 25 graden Celsius. Gebruik vervolgens een microplaat-spectrofotometer om de culturen te identificeren die fysiek groeiden tot een A620 groter dan 1,0 in de meest geconcentreerde hydrolysaatverdunning. Verzamel de geïdentificeerde wells in een microfugebuis en verdeel ze over een vulplaat.

Breng één tot vijf microliter over van de vulplaat naar elk well van een nieuwe hydrolysaatverdunningsreeks om een initiële A620 van minimaal 0,1 te bereiken en incubeer de plaat zoals eerder. Controleer de groei van de culturen in de microplaat met een microplaat-spectrofotometer. Bereid regelmatig glycerolvoorraden van aanpassingsculturen.

Verzamel vier wells van de grootste gekoloniseerde hydrolysaatconcentratie in een cryofile en meng één op één met 20% steriel glycerol. Bevries de cellen bij min 80 graden Celsius. Herhaal deze verrijkingsprocedure totdat groei in 12% glucan AFEX CSH consistent zichtbaar is na 24 uur.

Om deze procedure te starten, strekt u geselecteerde glycerolvoorraden van aanpassingsculturen uit naar gist-malt-pepton-dextrose, of YM agar. Gebruik vervolgens strepen om 50 microliter van 3% of 6% glucan AFEX CSH in elk van de drie microplaat-wells te inoculeren. Incubeer de microplaat gedurende 24 uur bij 25 graden Celsius.

Verzamel gerepliceerde gekoloniseerde wells bij de hoogste hydrolysaatsterkte met sterke groei. En verdunplaat naar YM of 6% glucan AFEX CSH agar. Incubeer de platen in een 25 graden Celsius incubator gedurende 24 tot 48 uur.

Kies vijf enkele kolonies van de hoogste verdunningsplaat die groei vertonen om als glycerolvoorraadculturen in te vriezen. Streek elke kolonie naar een YM-plaat en incubeer gedurende 24 uur. Breng met een steriele lus een ontwikkelde streekbui van cellen over naar een klein volume van 10% glycerol gemengd om de cellen op te schorsen en verdeel naar twee tot drie cryofiles voor bevriezing bij min 80 graden Celsius.

Om isolaten in eenvoudige 6% glucan AFEX CSH batchculturen te testen, brengt u cellen over van 48 uur platen die zijn uitgestreken van glycerolvoorraden naar pH 7 kaliumfosfaatbuffer om celsuspensies te bereiden. Na het meten van de optische dichtheid van elke celsuspensie, past u het volume aan met extra buffer om een A620 van tien te bereiken. Gebruik één microliter van elke suspensie om elk van de vier wells van 50 microliter van 3% glucan hydrolysaat te inoculeren tot een initiële A620 van 0,2.

Incubeer de microplaat gedurende 24 uur. Breng vervolgens twee 24 uur microplaat-wells over om 25 milliliter preculturen van 6% glucan AFEX CSH bij pH 5 te inoculeren. Sluit de flessen af met siliconen sponsafsluitingen en incubeer gedurende 24 uur bij 25 graden Celsius en 150 RPM.

Gebruik de 6% glucan AFEX CSH preculturen om vergelijkbare 25 milliliter groeiculturen in duplicaat te inoculeren tot een initiële A620 van 0,1. Incubeer de groeiculturen gedurende 24 uur bij 25 graden Celsius en 150 RPM. Om de dioxic-gebrek van isolaten te testen in batchculturen van optimaal gedefinieerd medium, of ODM, met gemengde suikers, inoculeert u preculturen van 75 milliliter ODM met 150 gram per liter xylose in 125 milliliter flessen met siliconen sponsafsluitingen.

Incubeer gedurende 24 uur bij 25 graden Celsius en 150 RPM. Gebruik de preculturen om te inoculeren naar een A620 van 0,1 vergelijkbare dubbele 75 milliliter testculturen met ODM bevattend 75 gram per liter glucose en 75 gram per liter xylose bij pH 6,5. Schud flessen bij 25 graden Celsius en 150 RPM.

24 uur voorafgaand aan het inoceren van een continue cultuur, bereidt u een precultuur van een representatieve AFEX CSH-tolerante kolonie in ethanol-vrije ODM in een 125 milliliter fles. Gebruik vijf tot tien milliliter van de AFEX CSH-tolerante isola