Name: Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Leer adaptieve evolutietechnieken om robuuste Scheffersomyces stipitis-stammen te ontwikkelen voor efficiënte fermentatie van hexose- en pentose-sugars in lignocellulosische hydrolysaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen onze oprechte dank betuigen aan Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell en Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE voor hun vriendelijke levering van switchgrass voor dit project. We danken ook het Amerikaanse Department of Energy voor de financiering aan VB via de DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.

<ol><li>Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerlack%2C+RD+%22Billion-Ton+Update%3A+Biomass+Supply+for+a+Bioenergy+and+Bioproducts+Industry%22">Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry</a>. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).</li>
<li>Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentation+of+D-xylose+by+the+yeasts+Candida+shehatae+and+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis.</a> Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).</li>
<li>Kurtzman, C. P., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+ascomycete+yeasts+that+form+coenzyme+Q-9+and+the+proposal+of+the+new+genera+Babjeviella%2C+Meyerozyma%2C+Millerozyma%2C+Priceomyces+and+Scheffersomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Mcoscience%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces.</a> Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).</li>
<li>Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+ethanol+production+by+xylose-fermenting+yeasts+presented+high+xylose+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations.</a> Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).</li>
<li>Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimum+pH+and+temperature+conditions+for+xylose+fermentation+by+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis.</a> Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).</li>
<li>Slininger, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+kinetics+of+xylose+fermentation+by+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+NY+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis.</a> Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).</li>
<li>Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+source+and+mineral+optimization+enhance+D-xylose+conversion+to+ethanol+by+the+yeast+Pichia+stipitis+NRRL+Y-7124%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).</li>
<li>Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+xylose-specific+enzymes+by+ethanol+in+Scheffersomyces+%28Pichia%29+stipitis+and+utility+of+repitching+xylose-grown+populations+to+eliminat+diauxic+lag%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).</li>
<li>Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+nutrition+and+physiology+impact+inhibitor+tolerance+of+the+yeast+Pichia+stipitis+NRRL+Y-7124%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124.</a> Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).</li>
<li>Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulosic+ethanol+production+using+the+naturally+occurring+xylose-fermenting+yeast%2C+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis.</a> Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).</li>
<li>Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignocellulosic+pretreatment+using+AFEX%5BTitle%5D)+AND+%22Biofuels%3A+Methods+and+protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lignocellulosic pretreatment using AFEX.</a> Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 61-77 (2009).</li>
<li>Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+integrated+biological+process+for+cellulosic+ethanol+production+featuring+high+ethanol+productivity%2C+enzyme+recycling%2C+and+yeast+cells+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Energ.+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse.</a> Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).</li>
<li>Nigam, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+xylose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis+for+ethanol+production+through+adaptation+on+hardwood+hemicellulose+acid+prehydrolysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate.</a> J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).</li>
<li>Nigam, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+production+from+wheat+straw+hemicellulose+hydrolysate+by+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis.</a> J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).</li>
<li>Hughes, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+UV-C+mutagenesis+of+Scheffersomyces+%28formerly+Pichia%29+stipitis+NRRL+Y-7124+to+improve+anaerobic+growth+on+lignocellulosic+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).</li>
<li>Bajwa, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutants+of+the+pentose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis+with+improved+tolerance+to+inhibitors+in+hardwood+spent+sulfite+liquor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor.</a> Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).</li>
<li>Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+improvement+of+the+pentose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis+by+genome+shuffling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling.</a> J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).</li>
<li>Slininger, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+strains+of+Scheffersomyces+stipitis+achieving+high+ethanol+productivity+on+acid-+and+base-pretreated+biomass+hydrolyzate+at+high+solids+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading.</a> Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).</li>
<li>Jeffries, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+lignocellulosic-bioconverting+and+xylose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis.</a> Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).</li>
<li>Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentation+media+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trader%27s+Guide+to+Fermentation+Media+Formulation%22%5BJournal%5D)">Fermentation media formulation.</a> Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).</li>
<li>Syzbalski, W., Bryson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+on+microbial+cross+resistance+to+toxic+agents.+I.+Cross+resistance+of+Escherichia+coli+to+fifteen+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics.</a> J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).</li>
<li>Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ethanol-producing+yeast+and+bacteria+by+degradation+products+produced+during+pre-treatment+of+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).</li>
<li>Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+effects+of+furaldehydes+and+impacts+on+biotechnological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).</li>
<li>Allen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Furfural+induces+reactive+oxygen+species+accumulation+and+cellular+damage+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).</li>
<li>Weisburger, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic%2C+carcinogenic%2C+and+chemopreventive+effects+of+phenols+and+catechols%3A+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms.</a> ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).</li>
<li>Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+kinetic+model+for+computer+simulation+of+growth+and+fermentation+by+Scheffersomyces+%28Pichia%29+stipitis+fed+D-xylose%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metabolic+profiling+revealed+limitations+in+xylose-fermenting+yeast+during+co-fermentation+of+glucose+and+xylose+in+the+presence+of+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).</li>
<li>Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth%2C+death%2C+and+oxygen+uptake+kinetics+of+Pichia+stipitis+on+xylose%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose.</a> Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Verschillende stappen waren cruciaal voor het succes van het evolutieproces. Ten eerste is het belangrijk passende selectiedrukken kiezen om de populatie evolutie drijven naar de gewenste fenotypen die nodig zijn voor een succesvolle toepassing. De volgende selectieve spanningen werden gekozen voor S. stipitis ontwikkeling en toegepast op geschikte tijdstippen verrijking leidraad voor de gewenste fenotypen: toenemende sterkte van 12% glucan AFEX CSH (die de groei en fermentatie van verschillende suikers dwingt ...

Naar schatting jaarlijks 1,3 miljard droge ton lignocellulose kunnen ondersteunen de productie van ethanol en laat de VS om zijn verbruik van aardolie te verminderen met 30%. 1 Hoewel plantaardige biomassa hydrolyse opbrengst suiker mengsels rijk aan glucose en xylose, fermentatie-remmers worden gegenereerd door de chemische voorbehandeling nodig af te breken hemicellulose en bloot cellulose voor enzymatische aanval. Azijnzuur, furfural en hydroxymethylfurfural (HMF) wordt gedacht dat de belangrijkste onderdelen van de vele remmers die zich vormen tijdens de voorbehandeling zijn. Om de lignocellulosische ethylalcoholindustrie vooruit, onderzoek en procedures voor de ontwikkeling van giststammen staat te overleven en goed functionerende zowel hexose en pentose suikers in aanwezigheid van dergelijke remmende verbindingen nodig mogelijk. Een aanzienlijke extra zwakke traditionele industriële giststammen zoals Saccharomyces cerevisiae, is het onvermogen om efficiënt ferment de xylose in hydrolysaten van plantaardige biomassa. Pichia stipitis type stam NRRL Y-7124 (CBS 5773), onlangs omgedoopt tot Scheffersomyces stipitis, is een inwoner pentose gistende gist die bekend is om xylose fermenteren tot ethanol. 2,3 De evolutie van de stam NRRL Y-7124 werd hier voortgezet omdat het is gedocumenteerd hebben het grootste potentieel van de inheemse giststammen economisch realiseerbare ethanol accumuleren van meer dan 40 g / l met weinig xylitol bijproduct. 4,5,6 bij optimale media, S. stipitis NRRL Y-7124 produceert 70 g / l ethanol in 40 uur (1,75 g / l / uur) Opbrengst 0,41 ± 0,06 g / g in hoge celdichtheid cultures (6 g / L-cellen). 7,8 Resistance gisting remmers ethanol, furfural, HMF en is ook gemeld, 9 en S. stipitis is gerangschikt onder de meest veelbelovende inheemse pentose-fermenteren gisten beschikbaar voor commerciële schaal ethanol production uit lignocellulose. 10 Ons doel was om diverse undetoxified lignocellulose hydrolysaten en ethanol selectie druk van toepassing zijn op de evolutie te dwingen in de richting van een meer robuuste derivaat van stam NRRL Y-7124 geschikt voor industriële toepassingen. Key onder zocht verbeterde functies waren sneller suiker opnamesnelheden in geconcentreerde hydrolysaten, verminderd diauxy efficiënter gemengd gebruik suiker, en hogere toleranties van ethanol en remmers. De toepassing van S. stipitis om undetoxified hydrolysaten was een belangrijk aandachtspunt van het onderzoek naar de toegevoegde operationele kosten in verband met hydrolysaat detoxificatie processen, zoals overliming elimineren. Twee industrieel veelbelovende hydrolysaten werden toegepast op de evolutie van kracht:. Enzym versuikerde ammoniak fiber-uitbreiding voorbehandelde maïsstro hydrolysaat (AFEX CSH) en verdunde zuur voorbehandeld switchgrass hydrolysaat drank (PSGHL) 11,12 AFEX voorbehandeling technologie wordt ontwikkeld omhet minimaliseren van de productie van fermentatie-remmers, terwijl verdund zuur voorbehandeling vertegenwoordigt de huidige laagste kosten-technologie het meest beoefend om cellulosehoudende biomassa bloot voor enzymatische versuikering. PSGHL kan worden gescheiden van de na voorbehandeling cellulose en is karakteristiek rijk aan xylose uit de gehydrolyseerde hemicellulose, maar weinig glucose. AFEX CSH en PSGHL composities van elkaar verschillen op essentiële aspecten die werden benut om de evolutie te beheren. AFEX CSH is lager in furan aldehyden en azijnzuur inhibitoren maar hoger in aminozuren en ammoniak stikstofbronnen opzichte PSGHL (tabel 1). PSGHL presenteert de extra uitdaging van xylose zijn de belangrijkste suiker beschikbaar. Aldus is PSGHL geschikt specifiek verrijken verbeterde xylose gebruik bij hydrolysaten, zwakte voorkomen commercieel gebruik van beschikbare gist. Zelfs onder autochtone pentose gisting gisten, de afhankelijkheid van de suboptimale xylo suikerse celgroei ondersteunen en reparatie wordt nog grotere uitdaging in hydrolysaten vanwege verschillende redenen. voedingsdeficiënties, remmers die grote schade aan structurele integriteit en verstoring metabolisme cel door redox onbalans 9 Stikstof suppletie, vooral in de vorm van aminozuren, kan een aanzienlijke bedrijfskosten voor fermentaties vertegenwoordigen. De impact van stikstof suppletie op isolate screening en ranking werd onderzocht met switchgrass hydrolysaten. Verbeterde individuen werden verrijkt in een zich ontwikkelende bevolking met behulp van meerdere selectie druk afhankelijk van natuurlijke genetische diversiteit van de S. stipitis bevolking en mutaties geïnduceerd door blootstelling aan twee verschillende hydrolysaten, ethanol of UV-straling. Selectiedruk werden parallel en in serie toegepast om de evolutie voortgang van S. staand stipitis in de richting van de gewenste derivaten kunnen groeien en efficiënt te gisten in hydrolysaten(Figuur 1). Het repetitieve kweken van functionele bevolking in toenemende mate uitdagende hydrolysaten werd bereikt in microplaten gebruik van een verdunningsreeks van een van beide 12% glucan AFEX CSH of anders PGSHL bereid bij 20% vaste stof belading. De toepassing van ethanol uitgedaagd groei op xylose in continue kweek verder verbeterd AFEX CSH deze populaties door verrijkend fenotypen tonen minder gevoeligheid voor onderdrukking van xylose gebruik ethanol. Deze laatste functie werd onlangs problematisch pentose gebruik getoond door stam NRRL Y-7124 na glucose fermentatie. 8 Verrijking op PSGHL werd vervolgens onderzocht om hydrolysaat functionaliteit uit te breiden. Vermeende verbeterde derivaten van S. stipitis NRRL Y-7124 werd geïsoleerd uit elke fase van het evolutieproces via gerichte verrijking onder stressomstandigheden en verdunningsuitplatingstechniek kolonies kiezen de meest voorkomende populaties. dimensieloze relatievekengetallen (RPIs) werden gebruikt om stammen te scoren op basis van prestaties, waarbij kinetisch gedrag werd beoordeeld op verschillende hydrolysaat en voedingssupplementen toegepast. Hoewel het succes van verschillende procedures aangepast om de functionaliteit van S. verbeteren stipitis in lignocellulose hydrolysaten zijn eerder beschreven, stammen waaruit economische ethanolproductie op undetoxified hydrolysaten niet eerder gerapporteerd. 13-17 De evolutie procedures gevisualiseerd in meer detail hier Slininger et al. 18 ontwikkelde stammen die significant verbeterd de stam NRRL Y-7124 en kunnen produceren&gt; 40 g / l ethanol in AFEX CSH en enzym versuikerde hydrolysaat vingergras (SGH) aangevuld met geschikte stikstofbronnen. Deze nieuwe stammen zijn van toekomstige belang zijn voor de ontwikkeling van lignocellulose ethanol industrie en onderwerpen van extra genomics studies gebouwop die van eerder gesequenced stam NRRL Y-11545. 19 A genomics onderzoek van top stammen geproduceerd tijdens de verschillende fasen van de evolutie diagramed in figuur 1 zou de geschiedenis van de genetische veranderingen die zich hebben voorgedaan tijdens de ontwikkeling als een prelude op stam verbetering onderzoek verder te ontrafelen.

```html
<table><tbody><tr><td>Cellic Ctec, Bevat Xylanase (endo-1,4-)</td><td>Novozymes</td><td>Geen productnummer</td><td>www.novozymes.com, 1-919-494-3000</td></tr><tr><td>Cellic Htec, Bevat Cellulase en Xyalanase</td><td>Novozymes</td><td>Geen productnummer</td><td>www.novozymes.com, 1-919-494-3000</td></tr><tr><td>Gebakken Nutrisoy Meel</td><td>Archer Daniels Midland Co. (ADM)</td><td>63160</td><td>ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL&nbsp; 1800-37-5843</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 (Oppervlakteactieve stof)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1300</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Difco Vitamin Assay Casamino Acids</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>228830</td><td>meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>D,L-tryptophan&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3300</td><td>meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>L-cysteine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td>meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>214010</td><td>meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Bacto Malt Extract</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>218630</td><td>meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Peptone Type IV van sojabonen</td><td>Fluka</td><td>P0521-500g</td><td>meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Adenine, >99% poeder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8626</td><td>CAS 73-24-5. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Cytosine, >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3506</td><td>CAS 71-30-7. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Guanine, SigmaUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6779</td><td>CAS 73-40-5. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Thymine, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376</td><td>CAS 65-71-4. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Uracil, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>CAS 66-22-8. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td>CAS 50-99-7. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>D-Xylose, assay >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1500</td><td>CAS 58-86-6. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>96-well, platte bodemplaten</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>351172</td><td>meerdere leveranciers: bijv., Thermo-Fisher, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Wypall L40 Doek</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td>handdoek in microplatedozen om water te absorberen voor bevochtiging; meerdere leveranciers bijv., Thermo-Fisher, uline, Daigger</td></tr><tr><td>Corning gegradueerde pyrex kolf, 125 ml, smalle opening (stop #5)</td><td>Corning Life Science Glass</td><td>4980-125</td><td>meerdere leveranciers: bijv., Thermo-Fisher, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Innova 42R schudder/incubator, 2,5 cm (1") rotatie</td><td>New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)</td><td>M1335-0016</td><td>meerdere leveranciers: bijv., Eppendorf, Thermo-Fisher. Andere schudders/incubators met een 2,5 cm (1") worp kunnen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Duetz Dekselklem voor 4 diepe putjes MTP platen</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>Z365001700</td><td>applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Duetz Systeem sandwichdeksel voor 96 diepe putjes platen</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>Z365001296</td><td>applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Duetz Systeem siliconen afdichting (0,8 mm zwart lage verdamping) voor 96 diepe putjes plaatdeksel</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>V0W1040027</td><td>applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Blauwe microvezellaag voor Duetz systeem sandwichdeksel</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>V0W1040001</td><td>applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>96 well, 2 ml vierkante putjes piramidebodemplaten, natuurlijk popypropylene</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>ZC3DXP0240</td><td>applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Bellco 32 mm siliconen sponspakketingsluitingen, pk van 25 voor 125 ml kolven</td><td>Bellco</td><td>1924-00032</td><td>Thomas Scientific, hun catalogusnummer is 1203K27</td></tr><tr><td>Bellco Spinner Flask, 1968-Glas Dom, Afsluitbare Flens Type, 100 ml werkvolume. Dit ontwerp wordt niet langer vervaardigd.</td><td>Bellco</td><td>1968-00100 (origineel Cat. Nr.)</td><td>Gemantelde vaten hebben la

technieken voor de evolutie van de robuuste pentose hoge gisting gist voor bioconversie van omzetting van lignocellulose ethanol

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Lignocellulose biomassa is een overvloedig, hernieuwbaar grondstof dat nuttig is voor de productie van brandstofkwaliteit ethanol en andere bioproducten. Voorbehandeling en enzym-saccharificatieprocessen zetten suikers vrij die kunnen worden gefermenteerd door gist. Traditionele industriële gisten fermenteren geen xylose (dat tot 40% van de plantsuikers uitmaakt) en kunnen niet functioneren in geconcentreerde hydrolysaten. Geconcentreerde hydrolysaten zijn nodig om een economische ethanolterugwinning te ondersteunen, maar ze zijn beladen met toxische bijproducten die tijdens de voorbehandeling worden gegenereerd. Terwijl ontgiftingsmethoden hydrolysaten fermenteerbaar kunnen maken, zijn ze kostbaar en genereren ze afvalverwijderingsverplichtingen. Hier worden adaptieve evolutie en isolatietechnieken beschreven en gedemonstreerd om derivaten van de inheemse Scheffersomyces stipitis stam NRRL Y-7124 op te leveren die in staat zijn om hydrolysaten efficiënt om te zetten in economisch herwinnenbaar ethanol ondanks ongunstige kweekcondities. Verbeterde individuen worden verrijkt in een evoluerende populatie met behulp van meerdere selectiedrukken die afhankelijk zijn van de natuurlijke genetische diversiteit van de S. stipitis populatie en mutaties geïnduceerd door blootstelling aan twee verschillende hydrolysaten, ethanol of UV-straling. De uiteindelijke evolutieculturen worden verdund geplaat om de overheersende isolaten te verzamelen, terwijl tussenliggende populaties, bevroren in glycerol in verschillende stadia van evolutie, worden verrijkt op selectieve media met behulp van geschikte stressgradienten om de meest veelbelovende isolaten te herstellen door middel van verdunningsplateren. Isolaten worden getest op verschillende hydrolysaattypen en gerangschikt met behulp van een nieuwe procedure met behulp van dimensieloze relatieve prestatie-index (RPI) transformaties van de xylose-opnamesnelheid en ethanolopbrengstgegevens. Met behulp van de RPI statistische parameter wordt een algemeen relatief prestatiegemiddelde berekend om isolaten te rangschikken op basis van meerdere factoren, waaronder kweekcondities (variërend in voedingsstoffen en remmers) en kinetiek karakteristieken. Door toepassing van deze technieken hadden derivaten van de ouderstam de volgende verbeterde kenmerken in enzym-gesaccharificeerde hydrolysaten bij pH 5-6: verminderde initiële latentiefase voorafgaand aan groei, verminderde diauxische latentie tijdens glucose-xylose overgang, aanzienlijk verbeterde fermentatiesnelheden, verbeterde ethanoltolerantie en accumulatie tot 40 g/L.

S. stipitis werd ontwikkeld met combinaties van drie selectie culturen die AFEX CSH, PSGHL en ethanol uitgedaagd xylose-fed continue kweek opgenomen. Figuur 1 toont het schema van de evolutie experimenten uitgevoerd met de isolaten hebben ofwel meest effectieve wijze overall, of het meest effectief op één van de geteste hydrolysaten. Tabel 3 toont de toegangsnummers NRRL van deze superieure isolaten en vat de aanpassing spanningen toegepast bij de werkwijze van het bereiken van...

Adaptieve evolutie en isolatietechnieken worden beschreven en aangetoond dat derivaten van Scheffersomyces stipitis stam NRRL Y-7124 die in staat zijn om snel te consumeren hexose en pentose gemengde suikers in enzym versuikerd undetoxified hydrolysaten en te accumuleren meer dan 40 g / l ethanol opleveren.

Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Het algemene doel van deze procedure voor adaptieve evolutie is het verkrijgen van robuuste stammen van de inheemse xylose-fermenterende gist scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 die de hexose- en pentosesugers in niet-gedetoxificeerde hydrolyzaten sneller kunnen fermenteren tot economisch winbare ethanol. Deze methode brengt de lignocellulose-naar-ethanolindustrie vooruit door een routekaart te bieden naar stammen met complexe modificaties, waardoor fermentatie van suikers in hydrolyzaten mogelijk wordt die microbiële inhibitoren bevatten. Hier is het belangrijkste voordeel van gerichte evolutie dat robuuste stammen worden gevormd uit een inheemse gist die in staat is xylose te fermenteren, waardoor het niet langer nodig is om industriële saccharomyces-stammen genetisch te modificeren.We stelden vast dat het onwaarschijnlijk was dat een enkele giststam robuust zou zijn in verschillende soorten hydrolysaten, zoals AFEX-voorbehandelde maïsstengels of met verdund zuur voorbehandeld switchgrass. Het vermogen van scheffersomyces stipitis om een seksuele reproductiecyclus te doorlopen is gunstig voor verdere exploitatie in het huidige werk, omdat de verschillende ontwikkelde stammen gecombineerd kunnen worden tot één meer robuuste stam door middel van paring van stammen met deze verschillende eigenschappen. De procedure zal worden gedemonstreerd door co-auteurs Stephanie Thomson en Maureen Shea-Andersh, die biologisch wetenschappelijk technici zijn in mijn laboratorium.Bereid vóór het starten van deze verrijkingsprocedure een precultuur van stam NRRL Y-7124 voor in een kolf van 125 milliliter en een verdunningsreeks van het enzymatisch gesacharificeerde ammonia fiber expansion pretreated corn stover hydrolysaat, of AFEX CSH. Gebruik een multistep-pipet om een microtiterplaat met 96 wells te vullen met 15 µL per well, en acht wells per hydrolysaatverdunning. Inoculeer met enkele µL precultuur per well om een initiële absorptie bij 620 nanometer, of A620, van groter dan of gelijk aan 0,1 te verkrijgen.Plaats de microplaat in een plastic doos met een nat vel keukenpapier voor de vochtigheid en incubeer deze statisch gedurende 24 tot 28 uur bij 25 graden Celsius. Gebruik vervolgens een spectrophotometer voor microplaten om de culturen te identificeren die fysiek zijn gegroeid tot een A620 groter dan 1,0 in de meest geconcentreerde hydrolysaatverdunning. Voeg de geïdentificeerde wells samen in een microcentrifugebuis en verdeel deze over een vulplaat.Breng één tot vijf µL over van de vulplaat naar elke put van een nieuwe verdunningsreeks van het hydrolysaat om een initiële A620 van groter dan of gelijk aan 0,1 te bereiken en incubeer de plaat zoals voorheen. Monitor de groei van de culturen in de microplaat met een microplaat-spectrofotometer. Maak regelmatig glycerolvoorraden van de adaptatieculturen.Combine vier wells met de hoogste hydrolysaatconcentratie die gekoloniseerd zijn in een cryofile, en meng deze in een verhouding van één op één met 20% steriele glycerol. Vries de cellen in bij minus 80 graden Celsius. Herhaal deze verrijkingsprocedure totdat groei in 12% glucaan AFEX CSH consistent zichtbaar is na 24 uur.Om deze procedure te starten, worden geselecteerde glycerolstocks van adaptatieculturen uitgestreken op gistmaltpepton-dextrose-agar, of YM-agar. Gebruik na de groei de strepen om drie microplate-wells te inoculeren met elk 50 µL van 3% of 6% glucaan AFEX CSH. Incubeer de microplate gedurende 24 uur bij 25 °C.Voeg de gekoloniseerde wells met de hoogste hydrolysaatsterkte en sterke groei samen. Maak verdunningsplaten op YM- of 6% glucaan AFEX CSH-agar. Incubeer de platen in een incubator van 25 degree Celsius gedurende 24 tot 48 uur.Selecteer vijf enkelvoudige kolonies van de plaat met de hoogste verdunning die groei vertoont om deze als glycerolstockculturen te invriezen. Ent elke kolonie uit op een YM-plaat en incubeer deze gedurende 24 uur. Breng met een steriele lus een volgroeid uitstrijkje cellen over naar een klein volume 10% glycerol om de cellen te suspenderen en verdeel dit over twee tot drie cryovials voor invriezing bij minus 80 graden Celsius.Om isolaten te testen in eenvoudige 6%glucan AFEX CSH batchculturen, worden cellen van 48 uur oude platen, uitgestreken vanuit glycerolstocks, overgebracht naar pH 7 kaliumfosfaatbuffer om celsuspensies te bereiden. Na het meten van de optische dichtheid van elke celsuspensie wordt het volume met extra buffer aangepast om een A620 van tien te bereiken. Gebruik één µL van elke suspensie om elk van vier wells met 50 µL 3%glucan hydrolysaat te inoculeren tot een initiële A620 van 0,2.Incubeer de microplaat gedurende 24 uur. Draag vervolgens de inhoud van twee wells van de 24 uur oude microplaat over om preculturen van 25 milliliter 6% glucaan AFEX CSH bij pH 5 te inoculeren. Sluit de kolven met siliconen sponsdoppen en incubeer gedurende 24 uur bij 25 °C en 150 RPM.Gebruik de 6%glucan AFEX CSH-voorkleuren om soortgelijke groeiculturen van 25 milliliter in dubbelvoud te inoculeren tot een initiële A620 van 0,1. Incubeer de groeiculturen gedurende 24 uur bij 25 graden Celsius en 150 RPM. Om het dioxische gebrek aan isolaten in batchculturen van optimaal gedefinieerd medium, of ODM, met gemengde suikers te testen, inoculeer voorkleuren van 75 milliliter ODM met 150 gram per liter xylose in kolven van 125 milliliter met siliconensponsdoppen.Incubeer gedurende 24 uur bij 25 °C en 150 RPM. Gebruik de preculturen om twee soortgelijke 75 milliliter testculturen te inoculeren tot een A620 van 0,1 in ODM met 75 gram per liter glucose en 75 gram per liter xylose bij pH 6,5. Schud de erlenmeyers bij 25 °C en 150 RPM.Bereid 24 uur vóór het inoculeren van een continue cultuur een precultuur van een representatieve AFEX CSH-tolerante kolonie in ethanolvrije ODM voor in een fles van 125 milliliter. Gebruik vijf tot 10 milliliter van de precultuur van het AFEX CSH-tolerante isolaat om 100 milliliter ODM in een gejaakte spinner-fles van 100 milliliter te inoculeren om een initiële A620 van 0,5 te verkrijgen. Houd het cultuurvolume op 25 graden Celsius.Roer het mengsel bij 200 RPM en rust het uit met een steriliseerbare pH-elektrode, een pH-regelaar en een temperatuurgecontroleerd circulerend waterbad. Omdat de celgroei in het begin traag zal zijn door de blootstelling aan ethanol, dient er een pH-gestuurde pomp te worden ingesteld zodat, wanneer de cultuurfermentatie de pH verlaagt tot 5,4, de pomp pH 6,3 ODM met 100 g/L xylose en 50 g/L ethanol toevoegt om verdere pH-dalingen te stoppen. Handhaaf het volume op 100 milliliter met een effluentpomp die continu het cultivoppervlak afstroomt.Meet het opgevangen effluentvolume en neem elke 48 tot 72 uur monsters van de continue culturen voor analyse van de levensvatbare celconcentratie, producten en substraten zoals beschreven in het manuscript. Bewaar regelmatig glycerolstocks door koloniën te isoleren van levensvatbaarheidplaten van gebufferde monsterverdunningen die 30 tot 100 koloniën vormen, wat de meest prevalente robuuste koloniën op dat moment in de verrijking vertegenwoordigt. Overstroom de platen met vijf milliliter 10%glycerol om de bereiding van dubbele cryofiles mogelijk te maken.Indien culturen gestaag kunnen groeien bij specifieke groeisnelheden van meer dan 0,01 per uur op xylose in de aanwezigheid van meer dan 25 gram per liter ethanol, start dan de continue cultuurvoeding bij een lage verdunningssnelheid van ongeveer 0,01 per uur in het houdevolume van 100 milliliter. Verhoog na verloop van tijd de hoeveelheid ethanol in de voeding richting 50 gram per liter. Ultraviolette bestraling van inocula voor het herstarten van continue culturen is een optie om de mutatiesnelheid te versnellen.Sla geavanceerde populaties op in glycerolstocks. Voordat enkelvoudige celkolonies worden geïsoleerd, worden glycerolstockpopulaties met een verbeterde xylosefermentatie in aanwezigheid van ethanol geïdentificeerd zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik deze superieure populaties om platen uit te strijken.De uitgestreken platen worden gebruikt om dichte gebufferde cel-suspensies te bereiden met een A620 gelijk aan vijf. Vervolgens worden de cel-suspensies gebruikt om preculturen in 96-wells deepwellplaten te inoculeren. Incubeer gedurende 48 uur bij 25 °C, 400 RPM en een orbit van één inch.Verrijk vervolgens de tolerante kolonies door elke precultuur te gebruiken voor het inoculeren van 16 replica-culturen van één milliliter tot een initiële A620 van 0,5 in zuur voorbehandeld switchgrass-hydrolysaat, één-op-één gemengd met ODM plus 50 g/L xylose, en voldoende ethanol om een ethanolconcentratie van 20, 30 of 40 g/L te verkrijgen. Incubeer gedurende 48 uur bij 25 °C, 400 RPM en een orbit van één inch. Oogst voor elke verschillende glycerolstock de cultuurputjes met de hoogste ethanolconcentratie waarbij groei en xyloseverbruik mogelijk waren.Plate elke cellijn op YM-agar om dominante enkelvoudige kolonies te verkrijgen voor bewaring in glycerol. Selecteer 10 kolonies per cellijn en strijk deze uit op een YM-agarplaat voor de bereiding van glycerolstocks. Na adaptatie op AFEX CSH laat een vergelijking van de fermentatieprestaties in ODM tussen de ouderstam en de geadapteerde populaties zien dat de geadapteerde populaties xylose efficiënter gebruiken om ethanol sneller en in grotere hoeveelheden te produceren.Een hydrolysaat-tolerante kolonie werd verder ontwikkeld voor verbeterde ethanoltolerantie door middel van continue cultuurselectie op ODM met xylose en hoge concentraties ethanol. Alle aangepaste populaties overtroffen de ouderstam in het vermogen om het xylosemetabolisme te induceren in de aanwezigheid van 40 gram per liter ethanol. Deze grafieken vatten de prestaties samen van superieure tolerante isolaten, beoordeeld op basis van xylose-opnamesnelheden en ethanolopbrengsten ten opzichte van de ouderstam voor elke formulering van PSGHL.De beste stammen die waren geselecteerd uit de primaire screening op xylose-rijke PSGHL werden vervolgens gescreend op drie volledige hydrolysaten, waarbij de relatieve prestatie-index, of RPI, werd berekend voor de fermentatie van elk isolaat binnen elk hydrolysaat. Vervolgens werden de gecombineerde totale prestatie-indices voor elk isolaat berekend. Vijf isolaten, 3, 14, 27, 28 en 33, hadden totale RPI's boven de 60, waardoor zij werden geclassificeerd als het meest robuust voor alle variaties van hydrolysaat en nutriëntcondities gecombineerd.Na het bekijken van deze video zou u weten hoe u een xylose-fermenterende gist, zoals scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, kunt onderwerpen aan een gericht evolutieproces, en hoe u robuustere derivaten kunt verrijken, isoleren en evalueren die gemengde suikers in niet-gedetoxificeerde hydrolysaten effectiever fermenteren. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze worden toegepast met een dagelijkse tijdsinvestering van gemiddeld ongeveer een uur per dag. Significante veranderingen in het evolutieproces kunnen in slechts vier maanden worden gedocumenteerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voortschrijdende populaties regelmatig te bewaren door glycerolstocks te bereiden voor invriezing bij -80 °C. Dit maakt herstel van de populatie, periodieke evaluatie, isolatie of het opnieuw starten van het evolutieproces mogelijk. Om verschillende mutaties te beheren, dient men eraan te denken de gist regelmatig te screenen onder procespecifieke condities voor een reeks fenotypes.De berekening van algemene dimensieloze relatieve prestatie-indexen, of RPI's, op basis van kinetische parameters, maakt het mogelijk om de rangorde van stammen en de robuustheid tegen variaties in fermentatieomstandigheden, zoals het type hydrolysaat en nutriëntensuppletie, te beoordelen. Superieure giststammen die voortkomen uit elke fase van het evolutieproces zijn kandidaten voor genoomsequencing, zodat de aard van de verbeteringen, zoals een verminderde tolerantie voor inhibitoren en een verkorte dioxische lag-fase, begrepen kan worden en kan worden gebruikt voor het ontwerp van biocatalytische stammen van de volgende generatie.

techniques-for-evolution-robust-pentose-fermenting-yeast-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een eenvoudige, snelle methode voor het bepalen van de versuikering potentieel van grote aantallen van plantaardige biomassa monsters is beschreven. De geautomatiseerde platform voor deze analyse heeft betrekking op de voorbereiding van de plantaardige biomassa voor analyse in platen met 96 putjes en de daaropvolgende prestaties van de voorbehandeling, hydrolyse en kwantificering van de vrijgekomen suikers.

High-throughput versuikering test voor Lignocellulose Materialen

De structuur en chemische eigenschappen van de plantencelmuur worden geëvalueerd om ideale grondstoffen voor biobrandstoffen en biomaterialen te identificeren. Standaardmethoden hebben beperkingen wanneer ze worden toegepast op grote datasets. Deze hoogdoorvoerpre-behandelings-, enzym-saccharificatie- en pyrolyse-moleculaire bundel massaspectrometrie-methoden vergelijken een groot aantal biomassamonsters met verminderde experimentele tijd en kosten.

High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Weergegeven is het protocol voor co-immobiliserende hele cellen biokatalysatoren voor cofactorregeneratiesysteem en betere herbruikbaarheid, via de productie van L-xylulose als voorbeeld. De cofactor regeneratie wordt bereikt door het koppelen van twee Escherichia coli-stammen die functionele complementariteit enzymen; de hele cellen biokatalysator immobilisatie wordt bereikt door celinkapselende in calciumalginaat parels.

Immobilisatie van Multi-biokatalysatoren in Alginaat Kralen voor cofactorregeneratiesysteem en verbeterde Herbruikbaarheid

De voorbehandeling van lignocellulose biomassa met protische goedkope ionische vloeistoffen wordt getoond, wat resulteert in een delignificeerde, celluloserijke pulp en een gezuiverde lignine. De pulp geeft aanleiding tot hoge glucoseopbrengsten na enzymatische saccharificatie.

Voorbehandeling van lignocellulose met Low-cost ionische vloeistoffen

Wij rapporteren hier methoden over de moleculair-genetische manipulatie van de Yarrowia lipolytica Po1g stam voor verbeterde gendeletie-efficiëntie. De resulterende gemanipuleerde Y. lipolytica stammen hebben potentiële toepassingen in biobrandstof en biochemische productie.

Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production

Optogenetische controle van microbieel metabolisme biedt flexibele dynamische controle over fermentatieprocessen. Het protocol hier laat zien hoe blauw licht-gereguleerde fermentaties voor chemische en eiwitproductie op verschillende volumetrische schalen kunnen worden opgezet.

Lichtgestuurde fermentaties voor microbiële chemische en eiwitproductie

Dit protocol maakt gebruik van een bioluminescente reporter, waardoor metingen van transcriptionele activiteit in Saccharomyces eubayanus mogelijk zijn om de overgang van glucose naar maltose te volgen, waardoor real-time analyse van metabole aanpassingen mogelijk is en stamoptimalisatie voor industriële fermentatie onder diverse omstandigheden wordt ondersteund.

In vivo Monitoring van transcriptionele activiteit tijdens metabole overgang met behulp van een bioluminescente reporter in gist

Een cyclische druk bioreactor in staat om onderwerpen hartklep tissue om fysiologische en pathologische condities druk is ontworpen. Een LabVIEW programma stelt gebruikers in staat om de controle druk omvang, amplitude en frequentie. Dit apparaat kan gebruikt worden om de Mechanobiologie van hartklep tissue of geïsoleerde cellen te bestuderen.

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

We beschrijven hier de werking van een microfluïdische apparaat dat continue en hoge-resolutie microscopische beeldvorming van enkele ontluikende gistcellen kunnen gedurende hun volledige replicatie en / of chronologische levensduur.

Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

Leer adaptieve evolutietechnieken om robuuste Scheffersomyces stipitis-stammen te ontwikkelen voor efficiënte fermentatie van hexose- en pentose-sugars in lignocellulosische hydrolysaten.

Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol (Video) | JoVE Journal

Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol

Meer video's verkennen