Name: Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Leer hoe je menselijke villieuze cytotrofoblastcellen isoleert en cultiveert onder hypoxie/reoxygenatie om de beschermende effecten van melatonine tegen oxidatieve stress te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (nr. 262011-2009) aan CV en March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) aan CV en JTS; door beurzen aan LSF van het Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieur et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) en de Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, aan HC van het Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, aan AAHT van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) en FRQ-Santé, en aan JBP van NSERC; door een fellowship aan EMAS van de Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) en het Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

Placenta&#39;s werden verkregen direct na spontane vaginale leveringen van ongecompliceerde zwangerschap met de CHUM-St-Luc ziekenhuis, Montreal, QC, Canada, met geïnformeerde toestemming van de patiënt en de goedkeuring van de ethische commissies (CHUM-St-Luc Ziekenhuis en INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada). 1. Isolatie en zuivering van Villous cytotrofoblastcellen <ol><li> Oplossingen en media <ol><li> Bereid transportmiddelen aanvulling Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s Medium hoog glucosegehalte (DMEM-HG) met 1% vol / vol antibiotica (10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat) en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bereid primaire kweekmedium door DMEM-HG vullen met 10% v / v foetaal runderserum (FBS), 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), 1% vol / vol antibiotica (10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat) en bewaar bij 4 ° C. Warm media tot 37 ° C vóórgebruiken. </li><li> Bereid 4 L zoutoplossing (0,9% gew / vol natriumchloride). </li><li> Bereid gemodificeerde Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) door toevoeging van 25 mM HEPES tot 1x HBSS (pH 7,4). </li><li> Vers bereid, vier flessen ontsluitingsoplossing met gemodificeerde HBSS (bereid in 1.1.4), magnesiumsulfaat (MgSO4), calciumchloride (CaCl2), trypsine, desoxyribonuclease IV (DNase IV), en 1% vol / vol antibioticum ( 10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat) zoals getoond in tabel 1. </li><li> Bereid dichtheid centrifugeren media gradiënt <ol><li> Bereid dichtheid centrifugeren media-oplossing aan te vullen dichtheid centrifugeren media met 10% vol / vol HBSS 10x. </li><li> Bereid 14 testbuizen met dichtheidscentrifugatie mediaoplossing gewijzigde HBSS, zoals aangegeven in tabel 2. </li><li> Meng elke density oplossing (stap 1.1.6.2) krachtig voor de inhoud toe te voegen aan het verloop. Voorzichtigvoeg de dichtheid oplossingen een 50 ml glazen centrifugebuis met een peristaltische pomp (1 ml / min), beginnend met de hoogste concentratie (70%). Vermijd druppeltjes door het laten uitlekken van de oplossingen tegen de buiswand op de juiste scheiding van elke laag van de helling te handhaven. <ol><li> Bij afwezigheid van een peristaltische pomp, de lagen aan te brengen heel voorzichtig met Pasteurpipetten. </li></ol></li></ol></li><li> Bereid definitieve loopbuffer door daaraan loopbuffer (zie tabel of Materials) met 2% vol / vol antibioticum / antimycoticum (10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat). Bewaren bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Villous cytotrofoblast isolatie Opmerking: Gebruik steriele chirurgische apparatuur, glaswerk, pipetten, flesjes, enz. <ol><li> Op de dag van villi cytotrofoblast isolatie, in een 37 ° C waterbad, warm de spijsvertering oplossingen (uit stap 1.1.5) en 70 ml FBS. Opmerking: Gebruik 50 ml FBS aan de vertering en onderbrekenresterende 20 ml voor het invriezen stap (1.2.22) die op ijs worden gebracht als ontdooid. </li><li> Na de bevalling, breng de placenta naar het laboratorium in ijskoude transportmedium (uit stap 1.1.1) zo snel mogelijk (minder dan 1 uur). </li><li> Teruggooi transportmedium en de placenta bloed in vloeibare vuilnisbak. Weeg de placenta en onder te dompelen in koude zoutoplossing. </li><li> Meet en de volgende functies te analyseren: navelstreng lengte; navelstreng lokalisatie; placenta lengte, breedte, vorm (ovaal, discoïde); membraan kleur; zaadlob structuur pathologieën. Opmerking: De gegevens worden in de resultaten sectie. </li><li> Snijd de navelstreng, naast haar placenta inbrengen (dat wil zeggen, aan de basis van een extra 1 cm straal cirkel rond het snoer). Dompelen in 300 ml histologische fixerende oplossing (formaline 10%) voor latere histologische analyse. </li><li> Snijd de hele placenta in blokjes van 5 x 5 x 5 cm. Grondig wassen (4 x x ~ 1 min) in zoutoplossing solution (0,9%) bloedcellen te verwijderen totdat zoutoplossing duidelijk. Gooi spoelvloeistof. </li><li> In een horlogeglas, verwijder de placenta membranen en gehakt weefsels aan de bloedvaten en verkalkingen te verwijderen. Houd bloedvaten stevig vast met een tang en verwijder weefsels met behulp van de achterkant van Metzenbaum schaar. <ol><li> Plaats gehakt placenta in een Büchner trechter. Spoelen met ongeveer 100 ml van een zoutoplossing buffer. Blijven hakken tot 30-35 gram gehakt weefsel wordt verkregen (gebruik plastic wegen boot en schaal). Indien nodig, gehakt de rest van de placenta te verkrijgen tot drie extra 30-35 g preparaten. Gedurende deze tijd, zet gehakt weefsel in een weegschuitje op ijs. Opmerking: Deze stap zal ongeveer 45 minuten duren 1 uur. </li></ol></li><li> Voeg de 30 - 35 g gehakt placenta weefsel om een ​​trypsinizing kolf. Overdracht 150 ml van de bereide ontsluitingsoplossing 1 (tabel 1) bij de trypsinizing kolf en meng. </li><li> Plaats de kolf in trypsinizingeen schuddend waterbad gedurende 30 minuten bij een snelheid van niet meer dan 50 cycli / min en handmatig trypsinizing kolf zachtjes elke 5 min gedurende homogene spijsvertering. </li><li> Aan het einde van de eerste digestie verwijdert de trypsinizing kolf uit het waterbad en kantelen (45 °) gedurende 1 min naar het placentaweefsel sedimenteren. Met een 10 ml steriele pipet, te verwijderen en gooi ongeveer 80 ml van de bovenstaande. Vermijd het opzuigen van het weefsel. </li><li> Breng 100 ml ontsluitingsoplossing 2 (tabel 1) bij de trypsinizing kolf; meng goed en herhaal stap 1.2.9. </li><li> Aan het einde van de tweede spijsvertering, verwijder de trypsinizing kolf uit het waterbad en kantelen 45 ° gedurende 1 minuut. Met een 10 ml steriele pipet Verwijder 80 ml supernatant en voorzichtig overbrengen naar een centrifugebuis met een cel zeef (100 um mesh). Breng de bovenstaande vloeistof gefiltreerd met een bekerglas met 2 ml FBS telkens de centrifugebuis vol. </li><li> Voer de derde digestie zoals beschreven voor detweede spijsvertering (1.2.11 en 1.2.12) met behulp van 75 ml spijsvertering oplossing 3. Tegelijkertijd voeren stappen 1.2.15 om 1.2.16.1 voor de spijsvertering 2. </li><li> Voer de vierde digestie precies zoals de derde digestie met de verteringsoplossing 4 (75 ml), maar laat een maximale hoeveelheid supernatant. Voer stap 1.2.15 om 1.2.16.1 in parallel voor de spijsvertering 3, en ten slotte voor de spijsvertering 4. </li><li> Aliquot de supernatant (van digesties 2, 3 en 4) in 13,5 ml delen, elk in een 15 ml centrifugebuis. Met een 22,8 cm lange glazen Pasteur pipet zachtjes en langzaam plaats 1,5 ml FBS onder aan elke buis om een ​​afzonderlijke laag. Meng geen FBS en supernatant. Centrifugeer de buizen zonder rem gedurende 20 minuten bij 1250 xg bij kamertemperatuur. Opmerking: Na centrifugeren 4 lagen zijn zichtbaar in de buis, zoals weergegeven in figuur 1 De scheiding van trypsine en trofoblast cellen voorkomt overmatige cellulaire spijsvertering.. </li><li> Met een vacuümpomp, Aspiraten en gooi het supernatant (spijsvertering oplossing) en FBS lagen, met inbegrip van de witachtige film tussen de twee lagen. Resuspendeer de pellet (de trofoblasten en rode bloedcel lagen) met 1 ml warm celkweekmedium (stap 1.1.2, zonder FBS en zonder HEPES). <ol><li> Verzamel geresuspendeerde cellen van alle buizen en combineren in 1 tube. Laat de buis bij kamertemperatuur staan ​​tot het einde van alle ontsluitingen. Let op: Na alle ontsluitingen, de gebruikelijke opbrengst is 3 tubes van geresuspendeerde cellen (één per spijsvertering). </li></ol></li><li> Make-up het volume op 15 ml met warme celkweekmedium. Centrifugeer bij 1250 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant met een vacuümpomp. Vermijd opzuigen de pellet. </li><li> Voorzichtig resuspendeer de pellet verkregen uit de 3 buizen met 1 ml warm celcultuurmedium. de inhoud in 1 tube zwembad. Om 8 ml te verkrijgen, vul het volume met warme celkweekmedium. </li><li> Heel voorzichtig laag de celsuspensie op een scheiding gradseerde met een Pasteur pipet. Centrifugeren zonder rem gedurende 30 min bij 507 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Na centrifugeren identificeren van de verschillende lagen van cellen in het verloop met achtergrondverlichting. Zoek de lagen die trofoblast en contaminerende cellen tussen 40 - 50% van dichtheidscentrifugatie medium. Met een vacuümpomp verwijdert de bovenste lagen (&gt; 50%). </li><li> Verzamel cellen die zich in de lagen van belang met een Pasteur pipet en overbrengen naar een 50 ml centrifugebuis. Vul met water aan tot 50 ml met celkweekmedium. Centrifugeer 10 minuten bij 1250 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Onder steriele omstandigheden, gooi het supernatant, resuspendeer de pellet met 20 ml FBS en tel het aantal cellen met een hemocytometer. Op ijs, voeg 2,22 ml steriele dimethylsulfoxide (DMSO) en meng door omkeren. Aliquot 1,5 ml celsuspensie in cryogene flesjes, invriezen overnacht bij -80 ° C en overbrengen in een vloeibare stikstof tank. </li></ol></li> &lt;li&gt; Trofoblast zuivering <ol><li> Installeer de spoelen en actief buffers en een nieuw filter kolom aan de magnetische zuivering instrument volgens de instructies van de fabrikant. Voer de &quot;schone programma&quot; negatieve 1, positieve 1 en positieve 2 poorten schoon te maken, en vervolgens de invoering van de 50 ml buizen onder elke haven volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Ontdooi de cellen die werden bevroren in stap 1.2.22 snel in een 37 ° C waterbad. Overdracht cellen om een ​​50 ml buis en resuspendeer cellen zachtjes met 20 ml koud bufferoplossing. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant. Herhaal de wasstap met koud stromend buffer. Aantal cellen met een hemocytometer levensvatbaarheid te bepalen. Centrifugeer nogmaals (gedurende 5 min, 450 x g bij 4 ° C). Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig. Voeg 1 ml koude loopbuffer die 1% vol / vol muizen anti-HLA-ABC-antilichamen. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min, mixing zachtjes elke 5 min. </li><li> Voeg 6 ml koud stromend buffer. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en herhaal deze stap. Resuspendeer cellen in 1 ml koude loopbuffer die 10% vol / vol anti-muis secundair antilichaam gekoppelde magnetische korrels. Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten, voorzichtig mengen om de 5 min. </li><li> Voeg 6 ml koud stromend buffer. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 5 ml koud stromend buffer. </li><li> Scheid de trofoblast cellen met de magnetische zuivering instrument. Verzamel cellen op het negatieve haven en voeg 20 ml koud stromend buffer. Opmerking: trofoblast cellen niet bevatten complexe HLA-ABC en worden dus gescheiden van andere celtypen en gericht naar de negatieve 1 poort. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in 20 ml warme primaire kweekmedium. Tel de cellen usinga hemocytometer om de levensvatbaarheid te bepalen. </li><li> Plaat de cellen op de volgende dichtheden: 0,15 x 10 6 cellen / putje in 96-putjesplaten, 1,6 x 10 6 cellen / putje in 24-putjesplaten en 4,5 x 10 6 cellen / putje in 6-well platen. Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Bevestigt de zuiverheid van de trofoblast cellen door flowcytometrie 16,17 en / of 18 immunocytochemie. Opmerking: De zuiverheid van het immuungezuiverd cellen werd bepaald met FITC-geconjugeerde monoklonale antilichamen tegen cytokeratine-7 en vimentine 17-19. Dit protocol is goed gedetailleerd in Lanoix et al., 2008 7. </li><li> Na minimaal 4 uur Spoel de cellen tweemaal met warm kweekmedium losse cellen te verwijderen en vervolgens de platen dragen aan de normoxia kamer, die is samengesteld uit 8% O 2 (zie figuur 2 en paragraaf 2). </li></ol></li></ol> 2. In vitro Induction van normoxia en hypoxie / reoxygenation <ol><li> Incubator kamer operatie (zie figuur 2A voor de set-up). <ol><li> In een laminaire stroming kap, plaats een petrischaal met steriel water op de bodem van de kamer incubator tot droog voorkomen; plaats de eerder bereide cel kweekplaten of flessen (stap 1.3.10) op de superieure schappen van de kamer. </li><li> Buiten de kap, sluit de kamer (inlaatpoort) aan de gasslang (Figuur 2A: 5a, b en c) de buis gas (8% O 2 of 0,5% O 2) te bereiken (Figuur 2A: 7). Open beide inlaat en uitlaat poorten van de kamer. Op dit moment, het gas regulator (Figuur 2A: 4) moet gesloten blijven. </li><li> Open voorzichtig de gas-regelklep (Figuur 2A: 4). Flush 4 min onder een luchtstroom van 25 l / min tot volledig vervangen van de lucht in de kamer. </li><li> Na het spoelen van de kamer, sluit het gas regulator dan de inlaat en outlet havens van de kamer. </li><li> Koppel de debietmeter afvoerslang (Figuur 2A: 5c) vanaf de inlaatpoort van de kamer en plaats de kamer in een cel incubator bij 37 ° C. </li><li> Vervang het moment aanwezig in de platen, kolven en opgelost in het kweekmedium door het vullen van de kamer met gas 1 uur na stap 2.1.3. </li><li> Herhaal de stappen 2.1.1 tot 2.1.6 voor de andere composities gas (bv, 2% O 2 voor de eerste trimester trofoblast cultuur 9). </li></ol></li><li> Bevestig het zuurstofpercentage (Figuur 2B-C) <ol><li> De concentratie van zuurstof in de celkweek medium (zonder cellen) binnen de kamer te bevestigen, gebruikt een zuurstof elektrode verbonden met een zuurstof adapter. Sluit de zuurstof elektrode naar een voltmeter. </li><li> Een kalibratiekromme in dezelfde oplossing (bijv celkweekmedium) Door de oplossing bloot gassen met bekende zuurstofgehaltes (bijvoorbeeld 0% en21% zuurstof). Nadat de metingen zijn gestabiliseerd voor elke concentratie, dient de elektrode in het medium in de kamer. Opmerking: Neem alle metingen op dezelfde diepte om eventuele bias in zuurstofconcentratie 10 voorkomen. </li></ol></li><li> Inductie van normoxia en hypoxie / reoxygenatie in trophoblasts. <ol><li> Na toevoeging primaire trofoblast cellen de juiste celkweek flessen, platen of petrischaaltjes, voeren behandelingen nodig. </li><li> Tegelijkertijd binnen de kamer, bloot cellen het gewenste gasmengsel te reproduceren een specifieke voorwaarde elke 24 uur (figuur 3). </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In zoogdieren, ontwikkeling van de foetus is direct afhankelijk van een adequate placenta-functie. De oorsprong van ontwikkeling stoornissen zijn gebaseerd op de hypothese dat de oorzaak van ziekten manifesteren op latere leeftijd naar vroege ontwikkeling en dat de placenta een mechanistische rol bij de foetale 30-32 kunnen worden getraceerd. De placenta is de sleutel mediator van de foetale groei en ontwikkeling: het reguleert nutriëntentransfers, beschermt tegen schadelijke blootstelling, en heeft grote end...

Gedurende de zwangerschap, de placenta cytotrofoblastcellen, die mononucleaire stamcellen zijn, zich snel vermenigvuldigen en differentiëren in ofwel villous of extravilleuze cytotrofoblastcellen. Extravilleuze cytotrofoblasten binnen te vallen en de vorm van de spiraal arteriën van de baarmoederwand. Villous cytotrofoblasten, anderzijds blijven prolifereren, differentiëren en zekering multinucleated syncytiotrofoblast (de syncytium) 1 vormen. Het onderhoud van villi trofoblast homeostase is essentieel voor foetale welzijn en gezonde zwangerschap. In feite, villous trofoblasten mogelijk maternale-foetale uitwisseling van zuurstof en voedingsstoffen en hormonen produceren essentieel voor de zwangerschap. Bovendien is het syncytiotrofoblast het enige celtype in direct contact met de maternale bloedsomloop en een essentiële fysische en immunologische barrière. Daarom moet de syncytiotrofoblast apoptose en vervanging ondergaan homeostatische onderhoud en AVOid placenta pathologie 2-5. De door Kliman et al. 6 ontwikkeld in 1986 tot primaire villous cytotrofoblasten isoleren van menselijke placenta&#39;s techniek zorgde voor een revolutie in de placenta onderzoek doordat de studie van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij villous trofoblast differentiatie. Deze klassieke techniek, waarbij in de enzymatische digesties met trypsine en DNase, gevolgd door isolatie van dichtheidscentrifugatie media (colloïdale silicadeeltjes bekleed met polyvinylpyrrolidon of Percoll) wordt nu erkend als de gouden standaard voor het isoleren villeus cytotrofoblastcellen. De techniek kan worden geoptimaliseerd door magnetische immunozuivering, een procedure die villous cytotrofoblasten scheidt van niet-trofoblastcellen gebaseerd op de differentiële expressie van specifieke antigenen op het oppervlak van deze cellen. We kozen voor het menselijke leukocyt antigen ABC (HLA-ABC) vanwege de afwezigheid van de expressie op het trofoblastische cel membraame 7,8. De placenta is een orgaan dat dramatische verschillen in zuurstofgehalte ondergaat tijdens de zwangerschap. In het eerste trimester is de oxygenatie verhouding fysiologisch zeer laag (2% O 2) maar neemt milde niveaus van oxygenatie (8% O 2) in het tweede en derde trimester. Tuuli et al. 9 beschreven dat het in vitro reproduceren van de trofoblast omgeving in de placenta villi is een uitdaging en variaties oxygenatie niveau kan zelfs leiden tot fenotypische veranderingen. Het is daarom voorgesteld 8% zuurstof vast die normoxia de zuurstofspanning in placenta villi in het derde trimester van de zwangerschap 8,9 nabootsen. Chen et al. 10 uitgebreid bestudeerd verscheidene variabelen in verband met zuurstofspanning in trofoblast celkweek en toonde het belang van het bepalen van het zuurstofgehalte in een pericellulaire omgeving. De niveaus van zuurstof in de villi neiging te stijgendoor vasculogenese. De bloedstroom in placenta villi voortdurend toeneemt en het niveau van waterstofperoxide (een overvloedige reactieve zuurstofspecies) een belangrijk signaal dat vasculogenese 11,12 regelt. In de zwangerschap complicaties, een gebrek aan vasculogenese genereert hypoxie, en nog belangrijker, intermitterende variaties van oxygenatie (genaamd hypoxie / reoxygenatie). Deze omstandigheden leiden tot een abnormale verhoging van de oxidatieve stress, die de placenta en de levensvatbaarheid van de foetus 13,14 compromissen. De veranderingen die trofoblast cellen ondergaan in vivo tijdens episodes van hypoxie / reoxygenation kan worden nagebootst in vitro als volgt: villous cytotrofoblasten onder normoxische omstandigheden (8% O 2) totdat ze differentiëren tot syncytiotrofoblast worden gehandhaafd. Zij worden vervolgens onderworpen aan hypoxische omstandigheden (0,5% O2) gedurende 4 uur, gevolgd door nog 18 h normoxia (reoxygenatie). Met behulp van deze hypoxie / reoxygenation benadering, trofoblasten exHiBit gedereguleerd redox status en verhoogde intrinsieke apoptose 8, zoals in sommige zwangerschap complicaties waargenomen. Daarom is het zinvol om in vitro model om nieuwe preventieve en therapeutische mogelijkheden te evalueren bestrijding zwangerschap complicaties van placenta hypoxie / reoxygenatie. Placenta cellen produceren melatonine, dat een aantal belangrijke functies, zoals het vermogen om oxidatieve stress en placentale dysfunctie 15 overbodig is. Hier presenteren we de experimentele aanpak en mobiele modellen die worden gebruikt om de beschermende effecten van melatonine in de placenta trofoblast cellen vertonen op moleculair, cellulair en functioneel niveau 8.

<table><tbody><tr><td>Curved Metzenbaum Scissors</td><td>Shandon</td><td>9212</td><td>chirurgische apparatuur (celisolatie) (2 eenheden)</td></tr><tr><td>Splinter Forceps Fine 41/2 in</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-42</td><td>chirurgische apparatuur (celisolatie) (2 eenheden)</td></tr><tr><td>Scissors 4.5 Str Dissection</td><td>Fisherbrand</td><td>08-940</td><td>chirurgische apparatuur (celisolatie) (2 eenheden)</td></tr><tr><td>Gauze Sponge 10 cm x 10 cm</td><td>Cardinal Health</td><td>361020733</td><td></td></tr><tr><td>Oblong Glass Baking Dish</td><td>Pyrex</td><td>1105397</td><td>Glaswerk (2,8 L)</td></tr><tr><td>Funnel Buchner</td><td>Coorstek Inc</td><td>10-356E</td><td>Glaswerk (114 mm diameter)</td></tr><tr><td>Watch Glass&nbsp;</td><td>pyrex</td><td>9985100EMD</td><td>Glaswerk</td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>oplossing voor histologisch weefselfixatief</td></tr><tr><td>Trypsinizing Flasks</td><td>Wheaton</td><td>355395</td><td>Glaswerk (1 eenheid)</td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes</td><td>Kimble</td><td>73750-13100</td><td>Glaswerk</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm)</td><td>Fisherbrand</td><td>K63B1367820C</td><td>Glaswerk</td></tr><tr><td>250 ml Glass Beakers</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14005250</td><td>Glaswerk</td></tr><tr><td>Glass Media Bottles With Cap</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14395250</td><td>Glaswerk (8 eenheden)</td></tr><tr><td>50 ml Corex Tube&nbsp;</td><td>Corning</td><td>8422-A</td><td>(1 eenheid)</td></tr><tr><td>15 ml Polystyrene Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polystyrene Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological Pipet</td><td>Corning</td><td>11415038</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &mu;m Nylon</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Absorbant Liner</td><td>Scienceware</td><td>1199918</td><td></td></tr><tr><td>500&nbsp;ml Bottles Top Filter</td><td>Corning</td><td></td><td>Pore: 0.22&nbsp;&micro;m / medium en HBSS-voorbereiding</td></tr><tr><td>2 ml Criogenic Vials</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Pharmacia Fine Chemicals</td><td>P3 model</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Water Bath</td><td>Fisher</td><td>Model 127</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>ABM</td><td>4EKFS6CX-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisherbrand</td><td>EC231-598-3</td><td>Zoutoplossing 0,9%</td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Buffered Salt Solution (Hbss)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td>Hoeveelheid: 9,25 (één flesje) voor 1 L van de verteringsoplossing</td></tr><tr><td>Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes)</td><td><a name="RANGE!B29">Life Technologies</a></td><td>15630-080</td><td>25 ml (1 M) voor 1 L van de verteringsoplossing</td></tr><tr><td>Trypsin Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>9.888 U</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease Type Iv</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>402.000 U</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Baker</td><td>2500-01</td><td>800 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)</td><td>Life Technologies</td><td>10564-045</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Sulphate</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td>Densiteitscentrifugeringsmediagradient. Volume: 36 ml</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros</td><td>42383-0010</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Automacs Magnetic Separator&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Model 003</td><td></td></tr><tr><td>Automacs&nbsp;Columns&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Automacs Running Buffer&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1</td></tr><tr><td>Automacs Rinsing Solution&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td></tr><tr><td>Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-9983-82</td><td>anti-muis antilichaam</td></tr><tr><td>Anti Mouse Igg Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130048401</td><td></td></tr><tr><td>Multiple Well Plate -&nbsp; 6 Well With Lid</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Cell Bind-oppervlak</td></tr><tr><td>Multiple Well Plate -&nbsp; 24 Well With Lid</td><td>Corning</td><td>3337</td><td>Cell Bind-oppervlak</td></tr><tr><td>Multiple Well Plate -&nbsp; 96 Well With Lid</td><td>Corning</td><td>3300</td><td>Cell Bind-oppervlak</td></tr><tr><td>Modular Incubator Chamber&nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>Een set van twee is noodzakelijk voor gelijktijdig genereren van normoxia en hypoxia/reoxygenatiecondities</td></tr><tr><td>Single Flow Meter</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SFM3001</td><td></td></tr><tr><td>50 mm In-Line Filter</td><td>Whatman</td><td>6721-5010</td><td>PTFE, pore: 1,0 &micro;m</td></tr><tr><td>Gas Regulator</td><td>Pro Star</td><td>PRS301233</td><td>Een set van twee is noodzakelijk voor gelijktijdig genereren van normoxia en hypoxia/reoxygenatiecondities</td></tr><tr><td>Gas Hose Class Vi Clear 5/16&nbsp;</td><td>Parker</td><td>100-05070102</td><td>3 stuks met ~ 0,5 m</td></tr><tr><td>17 mm Adjustable Gas Hose Clamp</td><td>Tiewraps</td><td>THCSS-16</td><td></td></tr><tr><td>Normoxia Gas Cylinder&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Maat K (3rd trimester's samenstelling

human primary trofoblast cell cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie studie / reoxygenation-geïnduceerde disruption

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Dit protocol beschrijft hoe villoze cytotrofoblastcellen worden geïsoleerd uit placenta's bij term door opeenvolgende enzymatische digesties, gevolgd door dichtheidscentrifugatie, media-gradientisolatie en immunomagnetische zuivering. Zoals in vivo waargenomen, differentiëren mononucleaire villoze cytotrofoblastcellen in primaire cultuur na 72 uur in multinucleaire syncytiotrofoblastcellen. In vergelijking met normoxie (8% O2) ondergaan villoze cytotrofoblastcellen die hypoxie/reoxygenatie ondergaan (0,5% / 8% O2) verhoogde oxidatieve stress en intrinsieke apoptose, vergelijkbaar met dat wat in vivo wordt waargenomen bij zwangerschapscomplicaties zoals pre-eclampsie, vroeggeboorte en intra-uteriene groeirestrictie. In deze context vertegenwoordigen primaire villoze trofoblasten die onder hypoxie/reoxygenatie-condities worden gekweekt een uniek experimenteel systeem om de mechanismen en signaalroutes die in de menselijke placenta zijn veranderd beter te begrijpen en om de zoektocht naar effectieve medicijnen die beschermen tegen bepaalde zwangerschapsstoornissen te vergemakkelijken. Menselijke villoze trofoblasten produceren melatonine en drukken de enzymen en receptoren uit die het synthetiseren. Melatonine is voorgesteld als een behandeling voor pre-eclampsie en intra-uteriene groeirestrictie vanwege de beschermende antioxiderende effecten. In het primaire villoze cytotrofoblastcellenmodel dat in dit artikel wordt beschreven, heeft melatonine geen effect op trofoblastcellen in de normoxische toestand, maar herstelt het redoxevenwicht van syncytiotrofoblastcellen dat door hypoxie/reoxygenatie is verstoord. Dus zijn menselijke villoze trofoblastcellen in primaire cultuur een uitstekende aanpak om de mechanismen achter de beschermende effecten van melatonine op de placentafunctie tijdens hypoxie/reoxygenatie te bestuderen.

Isolatie en immunozuivering van villous cytotrofoblastcellen van een normale term placenta verkregen door vaginale bevalling leverde 1 x 10 8 levensvatbare cellen. De placenta woog 350 g, was 19 cm in diameter 4 cm hoog met schijfvormige vorm en transparant membranen. Geen zaadlob misvorming werd gedetecteerd. De navelstreng had paracentrale lokalisatie en een lengte van 56 cm. De zuiverheid werd beoordeeld door flowcytometrie behulp vimentine en cytokeratine 7-merkers. Meer d...

Dit manuscript presenteert een uniek in vitro model van immunogezuiverde humane villoze cytotrofoblastcellen gekweekt onder hypoxie/reoxygenatie. Dit model is geschikt om de beschermende effecten van veelbelovende behandelingen, zoals melatonine, op zwangerschapscomplicaties geassocieerd met verhoogde oxidatieve stress en veranderde placentafunctie te bestuderen.

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Het algemene doel van deze procedure is om de beschermende effecten van melatonine te bestuderen met behulp van immuun-gezuiverde primaire menselijke villous cytotrophoblastcellen, gekweekt onder hypoxie of reoxygenatie. Deze methode kan helpen bij het begrijpen van de mechanismen en signaleringspaden die geassocieerd worden met zwangerschapcomplicaties met de placenta onder hypoxie en reoxygenatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze geschikt is voor het bestuderen van veelbelovende behandelingen, zoals melatonine, bij zwangerschapsstoornissen geassocieerd met verhoogde oxidatieve stress.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met de stappen voor de isolatie van villous cytotrophoblasten, zoals het fijnmalen van weefsels en het voorbereiden van de dichtheidsgradiënt voor centrifugatie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de trofoblast van het derde trimester, kan zij ook worden toegepast op andere systemen, zoals de placenta van het eerste trimester en placenta's van andere diersoorten. Een visuele demonstratie van deze methode is belangrijk, aangezien veel stappen moeilijk te leren zijn zonder ze te zien, wat de r

human-primary-trophoblast-cell-culture-model-to-study-protective

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Traditionele, tweedimensionale celcultuur technieken vaak resulteren in veranderde eigenschappen met betrekking tot de differentiatie markers, cytokines en groeifactoren. Drie-dimensionale celkweek in het draaiende celkweek systeem (RCC's) herstelt expressie van vele van deze factoren zoals hier afgebeeld met een extravillous trophoblast cellijn.

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor bemonstering van menselijke placenta villous weefsel gevolgd door isolatie van de cytotrophoblasts voor primaire celculturen. Behandeling van trophoblasts met TNFα recapituleert ontsteking in de zwaarlijvige uteriene omgeving en vergemakkelijkt de ontdekking van moleculaire targets geregeld door een ontsteking in placentas met moeders obesitas.

Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta

Hier beschrijven we een methode voor het opwarmen van verglaasde menselijke blastocysten, die ze in vitro door de implantatieperiode kweekt, verteren tot enkele cellen en vroege trofoblastcellen verzamelen voor verder onderzoek.

Single Cell Collection van Trophoblast Cellen in Peri-implantatie Stage Human Embryo's

De verschillende effecten van verschillende graden van onderkoeling op myocardbescherming zijn niet grondig geëvalueerd. Het doel van deze studie was om de niveaus van celdood na verschillende hypothermiebehandelingen te kwantificeren in een op humane cardiomyocyten gebaseerd model, dat de basis legde voor toekomstig diepgaand moleculair onderzoek.

In vitro beoordeling van myocardbescherming na hypothermie-conditionering in een humaan cardiale myocytenmodel

Deze studie heeft tot doel een nieuw humaan organotypisch retinale cultuurmodel (HORC) te ontwikkelen dat voorkomt dat de retinale integriteit tijdens explantbehandeling in gevaar komt. Dit wordt bereikt door het netvlies te kweken met het bovenliggende glasvocht en het onderliggende retinale pigmentepitheel-vaatvlies (RPE-vaatvlies) en sclera.

Karakterisering van een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek

Hier beschrijven we een in vitro protocol om hypoxie/reoxygenatieschade te modelleren in de sterk metabole proximale tububulaire epitheelcellen. Dit model is ontworpen om schade veroorzaakt door metabole stress te induceren, die kan worden gemeten door de expressie van proximale tubuli-schademarkers en de beoordeling van de mitochondriale ademhalingsfunctie.

Modellering van hypoxie/reoxygenatieschade in proximale tubulära epitheelcellen

Zelfassemblage menselijke cardiale organoïden (hCO's) zijn een opkomend systeem voor het modelleren van menselijke hartontwikkeling en ziekte. Hier wordt een methodologie gegeven voor het genereren en beschadigen van hCO's met hypoxie-reoxygenatie en details van verwachte histologische en functionele uitkomsten na een verwonding.

Een hypoxie-reoxygenatie-schademodel bij zelf-assemblerende menselijke cardioïden

Een gestandaardiseerd protocol voor het induceren van voortijdige veroudering in HNM met behulp van tBHP, gestandaardiseerde protocollen voor het analyseren van belangrijke senescentiemarkers, waaronder groeistop, SA-β-galactosidase-activiteit en SASP-factoren.

Een gestandaardiseerd protocol voor het induceren van door stress veroorzaakte voortijdige veroudering in primaire menselijke melanocyten met behulp van tert-butylhydroperoxide

Embryonale kuiken netvlies celculturen vormen waardevolle hulpmiddelen voor de studie van fotoreceptor biologie. We hebben een efficiënte genoverdracht techniek gebaseerd op ex ovo plasmide elektroporatie van de netvliezen voorafgaand aan cultuur ontwikkeld. Deze techniek aanzienlijk vergroot transfectie-efficiënties op dit moment beschikbare protocollen, waardoor genetische manipulatie mogelijk voor dit systeem.

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An Ex-ovo Elektroporatie Aanpak

Leer hoe je menselijke villieuze cytotrofoblastcellen isoleert en cultiveert onder hypoxie/reoxygenatie om de beschermende effecten van melatonine tegen oxidatieve stress te bestuderen.

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption (Video) | JoVE Journal

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

Meer video's verkennen