Name: Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Leer hoe basement membrane stijfheid invasief celgedrag beïnvloedt bij prostaatkanker met dit interdisciplinaire model. Deze techniek bootst tumorstijfheid na en verbetert inzicht in kankerprogressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) voor de BPH-1 cellen; en Thomas Cox en Janine Erler (Biotech Research & Innovation Centre, Universiteit van Kopenhagen) voor hun hulp met reologische metingen. MR-T werd gefinancierd door Worldwide Cancer Research, voorheen The Association of International Cancer Research (subsidie 08-0803 aan JS), The British Embassy Montevideo en Agencia Nacional de Investigación e Innovación (UK_RH_2015_1_2 aan MR-T). MC werd ondersteund door Prostate Cancer UK (subsidie S14-017 aan JS en GS). KW werd gefinancierd door The China Scholarship Council. MAM werd gefinancierd door The Saudi Arabian Cultural Bureau.

<ol><li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+assembly+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li>
<li>Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+collagen+lateral+associations+in+the+EHS+tumor+matrix.+Comparison+with+amniotic+and+in+vitro+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks.</a> Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).</li>
<li>Halfter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+biomechanical+properties+of+in+vivo-derived+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes.</a> Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).</li>
<li>Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+the+structure%2C+composition+and+biophysical+properties+of+a+human+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane.</a> Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).</li>
<li>To, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-induced+morphological%2C+biomechanical%2C+and+compositional+changes+in+ocular+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes.</a> Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+responsive+adult+human+prostatic+epithelial+cell+lines+immortalized+by+human+papillomavirus+18%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18.</a> Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).</li>
<li>Hayward, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+immortalized+but+non-transformed+human+prostate+epithelial+cell+line%3A+BPH-1%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).</li>
<li>Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+prostatic+carcinoma+cell+line+%28PC-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Urol%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).</a> Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%3A+a+10-year+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).</li>
<li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGE-modified+basement+membrane+cooperates+with+Endo180+to+promote+epithelial+cell+invasiveness+and+decrease+prostate+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival.</a> J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).</li>
<li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li>
<li>Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nonlinear+rheology+with+inertio-elastic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheology%22%5BJournal%5D)">Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations.</a> J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).</li>
<li>Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase+enzymatic+function+increases+stiffness+to+drive+colorectal+cancer+progression+through+FAK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK.</a> Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).</li>
<li>Caley, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+Endo180+requires+stromal-derived+LOX+to+promote+metastatic+prostate+cancer+cell+migration+on+human+ECM+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces.</a> Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+uPAR+requires+Endo180+for+rapid+directional+sensing+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis.</a> J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes+generate+localized+Rho-ROCK-MLC2-based+contractile+signals+via+Endo180+to+promote+adhesion+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly.</a> J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).</li>
<li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+Outcome+and+EMT+Suppression+Mediated+by+a+Lectin+Domain+Interaction+of+Endo180+and+CD147%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147.</a> Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Carson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+characterization+of+ex+vivo+prostate+tissue+via+spherical+indentation+in+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Eng+Phys%22%5BJournal%5D)">Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic.</a> Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).</li>
<li>Hoyt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+elasticity+properties+as+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer.</a> Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).</li>
<li>Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+breast+and+prostate+tissues+under+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrason+Imaging%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression.</a> Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+viscoelastic+properties+of+human+prostate+correlated+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology.</a> Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).</li>
<li>Corona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benign+prostatic+hyperplasia%3A+a+new+metabolic+disease+of+the+aging+male+and+its+correlation+with+sexual+dysfunctions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions.</a> Int J Endocrinol. , Article ID:329456 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een protocol voor het genereren van 3D glandular acini van MEC in pure rBM gels 6 is in een eerdere studie gemodificeerd door toevoeging van 4 mg / ml type I collageen de RBM matrix. De toevoeging van collageen resulteerde in de elastische modulus van de rBM gel toeneemt van 175 ± 37-1589 ± 380 Pascal. Deze 9,1-voudige toename in stijfheid gemoduleerde de groei, overleving, migratie en differentiatie van MEC 21. Het protocol werd wederom gewijzigd door opname van een behandelingsstap met D - (-) - ribose niet-enzymatische verknoping van de type I collageen dat was toegevoegd aan de gel rBM bevorderen. De resulterende 15-voudige toename in stijfheid bleek te werken met oncogene transformatie van MEC hun invasief gedrag 22 bevorderen. De experimentele benadering van het toevoegen type I collageen gels rBM vergemakkelijkt de directe interactie van MEC&#39;s ​​met collageenvezels, die alleen in menselijk weefsel na de fysieke barrière tussen de stromaen epitheel door de BM ondergaat proteolytische afbraak. Door het genereren van 3D-glandular acini van PEC in pure rBM gels voorbehandeld met GLA, het huidige protocol opent de weg om te onderzoeken hoe BM stijfheid per se hun invasief gedrag (figuur 3) kan leiden. De niveaus van BM stijfheid veroorzaakt in dit protocol hebben fysiologische relevantie. Incubatie met 50 mM GLA 6 uur en 14 uur met respectievelijk de elastische moduli van de zuivere rBM gel 175 ± 90 en 322 ± 160 ten opzichte van 122 ± 55 Pascal in rBM gels behandeld met PBS (tabel 1). Dit 1,7-3,2-voudige toename in stijfheid rBM recapituleert het 2,5 tot 3,4-voudige toename van de stijfheid waargenomen maligne opzichte van normale prostaat of BPH weefsel 23-26. Zoals in een recente publicatie de 13 morfologische veranderingen bij de accumulatie van AGE en rBM stijfheid in PEC acini kan worden gekwantificeerd om een statistisch significante verschuiving van arounded naar polygonale vorm, verminderde luminale / totale oppervlakte acinaire en uitsteekt cellen migreren vanuit het acina in de AGE-rijke rBM (figuur 3). Immunoblotting kan ook worden gebruikt om merkers van EMT beoordelen (bijvoorbeeld verlies van E-cadherine 13) en de contractiele beïnvloeden (gefosforyleerd myosine lichte keten-2, pMLC2 13) in PEC gekweekt in normale versus stijve rBM (figuur 3). Verdere beoordelingsproces met immunofluorescentie kleuring en confocale microscopie kunnen worden toegepast op de BM visualiseren (bijvoorbeeld laminine, collageen IV en AGE accumulatie 13), cellulaire apicale naar basale polariteit (bijvoorbeeld apicale lokalisatie van EEA1: vroege endosomale antigeen 1 en GM130: 130 kDa cis Golgi-merker 13) en cellulaire patronen van adhesiemoleculen (bijv E-cadherine lokalisatie tot cel-cel contacten 13) (figuur 3). <img alt = &quot;Figuur 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; Figuur 3:. Overzicht van de verschillende protocollen hier gepresenteerde Het diagram toont hoe voor te bereiden en te verstijven het opgeloste basaal membraan (RBM) met glycolaldehyde (Maillard-reactie), hoe je cellen te zaaien op de stijve rBM, hoe de stijve rBM analyseren ( omvang van Maillard reactie) en -procedures die kunnen worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire veranderingen bij AGE-rijke rBM analyseren. AGE, geavanceerde glycatie eindproducten; BM, basaal membraan; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindol; EEA1, vroeg endosomale antigen 1; GAPDH, glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase; GLA, glycolaldehyde; GEE, glycine ethyl ester; GM130, 130 kDa cis-Golgi marker; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), myosine lichte keten-2 gefosforyleerd op sites threonine 18 en serine 19; rBM, gereconstitueerde basaal membraan; SDS-PAGE, natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese. Voor RWPE1 acini Schaal bar = 10 micrometer; voor PC3 tumorcellensferoïden Schaal bar = 100 micrometer. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Stappen voor probleemoplossing is noodzakelijk als D - (-) - ribose gekozen als verknopingsmiddel voor rBM. Tijdens protocolontwikkeling bleek dat behandeling met 1 M D - (-) - ribose gedurende 72 uren, zoals eerder beschreven voor rBM / collageen gels 22, geleid tot de dehydratatie en krimp van rBM gels. De evaluatie van lagere concentraties van D - (-) - ribose en kortere behandelingstijden kunnen helpen om deze beperking te overwinnen. Een mogelijke beperking van toekomstige toepassingen van het protocol kan waar hogere niveaus van rBM stijfheid gewenst worden aangetroffen. Bij langere incubatietijden en hogere concentraties GLA worden gebruikt om hogere rBM gel stijfheid veroorzaken, zullen dit noodzakelijk<html> beoordelen of deze behandeling die een impact hebben op celoverleving en proliferatie, zoals eerder beschreven 13. Ook moet worden opgemerkt dat incubatie van RWPE-1-cellen met serum induceert een fenotypische EMT-achtige overgang en blootstelling aan serum of serum-bevattende materialen moet worden vermeden. Als bijvoorbeeld experimenten omvatten de transfectie van korte interfererende RNA (siRNA) oligonucleotiden, moet de werkwijze worden geoptimaliseerd met behulp RWPE-1 cellen gekweekt in KSFM zonder het schakelen van de cellen aan lage serum transfectie media. Dit nadeel zou het niveau van gen beschadigen geluidsdemping bereikt bij gebruik van voorbijgaande siRNA zal in het model. Voor sommige eiwit targets zou worden geadviseerd om induceerbare shRNA vectoren voor afstembare gene silencing en de gewenste afname van de eiwitgehalten in dienst. Aanpassingen die enzymatische verknoping te nemen door stromale cel of tumorcel geassocieerd lysyloxidase (LOX) 17 kan ook in toekomstige modellen worden opgenomen. jove_content &quot;&gt; Dit protocol zal de toekomstige studie van pro-invasieve mechanismen geactiveerd door leeftijdsafhankelijke BM stijfheid in PEC (RWPE-1, BPH-1) en evaluatie van anti-metastatische doelstellingen invasieve PTC (PC3) te vergemakkelijken. Aangezien BPH wordt als een stofwisselingsstoornis 27 zijn, dit protocol effent ook de weg naar onze beter inzicht in de relatie tussen metabole stoornissen en verhoogd risico op prostaatkanker. Aangezien BM stijfheid veroorzaakt door de blootstelling aan AGEs trigger voor invasieve andere kanker kan types, zal het van belang zijn om het protocol te gebruiken voor het opzetten van vergelijkbare modellen die normale epitheliale cellen en tumorcellen op te nemen van andere organen (zoals borst-, colon, eierstokken, pancreas). Kritische stappen in het protocol met de timings, zijn in figuur 4. In de eerste stap is het essentieel om de voorraadoplossing van rBM houden bij 4 ° C terwijl het ontdooit zijn pol voorkomenymerization. Pipetpunten mag niet worden geplaatst in de RM voorraad oplossing totdat ze zijn afgekoeld tot 4 ° C. Voor de volgende stap is eveneens belangrijk de kamer sleden geëquilibreerd tot 4 ° C voordat zij worden bekleed met het rBM oplossing. Zodra de temperatuur van de oplossing rBM boven 4 ° C wordt verhoogd zal het onomkeerbare polymerisatie vorming van een gel ondergaat. Het essentieel dat de rBM niet verstoord tijdens de polymerisatiestap zodat er een homogene oppervlak geschikt voor celcultuur en microscopische analyse. De duur van de incubatie met GLA, met of zonder remmers van de Maillard-reactie (natriumcyaanboorhydride en amingoguanidine) zal bepalen hoe stijf de rBM gel wordt. Het wordt aanbevolen om een 6 uur incubatie te gebruiken met GLA ​​als semi-stijve voorwaarden nodig zijn, en 14 uur incubatie als stijve voorwaarden zijn vereist (tabel 1). Alternatieve incubatietijden of concentraties GLA kan worden gebruikt als verschillende niveausstijfheid gewenst zijn. In dit geval rheologische analyse van de RBM gels nodig als een essentiële stap te worden opgenomen. Na de stap van het blussen van de Maillard reactie door incubatie met GEE en de daaropvolgende wasstappen met PBS, kan de rBM gels onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 48 uur vóór het gebruik voor celcultuur. Zodra celkweken worden ingesteld is het belangrijk om het kweekmedium (inclusief eventuele behandelingen) om de twee dagen veranderen. Het wordt aanbevolen om de 3D celculturen handhaven 3-12 dagen afhankelijk van de onderzochte parameters. Voor 3D PEC Acini is het raadzaam om de culturen te analyseren na 6 dagen, en voor 3D PTC sferoïden analyse wordt aanbevolen na 3 dagen van de cultuur in de eerste plaats. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> Figuur 4:. Eenvoudig overzicht van het protocol met kritische stappen en timings gewezen op de flow diagram toont hoe voor te bereiden en te verstijven het opgeloste basaal membraan (RBM) met glycolaldehyde (Maillard-reactie) met kritische stappen en timings aangegeven. Punten waar de protocol kan worden gestopt, en rBM gels opgeslagen, zijn ook aangegeven. rBM, gereconstitueerde basaal membraan; GLA, glycolaldehyde; GEE, glycine ethyl ester; ON, &#39;s nachts; PBS, fosfaatgebufferde zoutoplossing; RT, kamertemperatuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De basement membraan (BM) is een laag van gespecialiseerde extracellulaire matrix (ECM) die stabiele weefselgrenzen handhaaft door lagen van epitheliale cellen te scheiden van het stroma1. Covalente verknoping tussen aangrenzende drievoudige helices van collageen IV in de BM stabiliseert hun laterale associatie door een onregelmatig netwerk van supergedraaide helices te vormen2. Deze collageen IV-rasters fungeren als een schakel voor de interactie met laminine en andere BM-componenten1. De structurele opstelling van de BM verschaft het de mechanische sterkte en stijfheid die nodig zijn voor de normale ontwikkeling van glandulaire epitheel3.
Tijdens veroudering en ziekte wordt de BM progressief dikker en stijf3,4. Bijvoorbeeld, een 3-voudige toename in de elastische modulus (E) van de oculair BM vindt plaats tussen de leeftijden van 50 en 80 in de normale populatie, en deze verstevigen wordt verder verergerd bij metabole stoornissen zoals diabetes5. De structurele en biomechanische veranderingen in de BM die resulteren in de verhoogde stijfheid, treden op wanneer de ECM-componenten, collageen IV en laminine, niet-enzymatisch worden verknoopt na hun blootstelling aan geavanceerde glycosylatie-eindproducten (AGEs).
Het doel van de hier beschreven methode was om een model op te stellen voor het onderzoek naar hoe BM-stijfheid, als gevolg van AGE-blootstelling, de invasiviteit van prostaatepitheelcellen (PEC) en prostaattumorcellen (PTC) bevordert in de context van de overgang naar metastaserend prostaatkanker (PCa). Hiervoor werd een eerdere methode die werd gebruikt voor het genereren van 3D-glandulaire acini uit mammaire epitheelcellen (MECs) in gereconstituteerde rBM-gels6 aangepast om een extra stap te omvatten waarbij de rBM-gels worden voorbehandeld met glycolaldehyde (GLA). Er worden verschillende technieken beschreven voor het beoordelen van GLA-geïnduceerde verknoping en verstevigen van voorbehandelde rBM-gels, inclusief fotometrische analyse, natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), confocale microscopie en reometrische analyse. De prostaatceltypen die zijn geselecteerd voor kweek op de voorverstevigde rBM omvatten: RWPE-1, PECs afkomstig van een normale prostaatklier7; BPH-1, PECs afkomstig van een prostaatklier aangetast door BPH8; en PC3, metastaserende PTCs afkomstig van een secundaire tumor in het wervelbeen van een patiënt met prostaatkanker (PCa)9.
Naast het bevorderen van de studie van pathologie van de prostaatklier, kan het protocol voor het verstevigen van rBM-gels door behandeling met GLA worden aangepast om te onderzoeken hoe BM-stijfheid bijdraagt aan andere leeftijdsgerelateerde pathologieën en metabole stoornissen. Bijvoorbeeld, het model kan direct worden toegepast om te onderzoeken hoe metastaserend kanker wordt geïnduceerd door BM-stijfheid in organen zoals de borst, dikke darm, eierstokken en pancreas door de incorporatie van geschikte celtypen. Verder kan het protocol worden aangepast om te onderzoeken hoe stijve BM biomechanische mechanismen van ziekteprogressie bevordert bij diabetes-gerelateerde microvasculaire ziekte, retinopathie, nefropathie en neuropathie.

<table><tbody><tr><td>I - Materiaal voor monolaagcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BPH-1</td><td>CaP Cell Line Database</td><td>PCaCL-132</td><td>Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td></tr><tr><td>Complete keratinocyte serumvrij media&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-075</td><td>Niet opwarmen bij 37 &ordm;C vóór gebruik</td></tr><tr><td>Fetaal runder serum&nbsp;</td><td>First Link UK Ltd</td><td>02-00-850</td><td>Bewaar bij -20 &ordm;C in aliquots</td></tr><tr><td>PC3&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1435</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing (Dulbecco A) tabletten</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td>Warm in 37 &ordm;C waterbad vóór gebruik</td></tr><tr><td>RWPE-1&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11609</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>II - Materiaal voor 3D-cultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Aminoguanidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>396494</td><td>Irriteert de ogen, het ademhalingssysteem en de huid</td></tr><tr><td>Chamber slides, 8-well&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td><td>TKT-210-816M</td><td></td></tr><tr><td>Culture Matrix gereconstitueerde basaalmembraan (rBM) gereduceerd groeifactorextract&nbsp;</td><td>AMS Biotechnology</td><td>3445-005-01</td><td>Bewaar het basaalmembraan (BM) bij -80 &ordm;C in aliquots</td></tr><tr><td>Cyanogeen bromide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C91492</td><td>Giftig bij contact met huid en inademing</td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50060</td><td>Irriteert de ogen</td></tr><tr><td>Glycolaldehyde dimer (GLA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6805</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcyanoborohydride&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>Zeer ontvlambaar; giftig bij contact met huid en inademing</td></tr><tr><td>Spuitfilter 0,22 micrometer</td><td>Appleton Woods</td><td>BC680</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>III - Materiaal om Maillard-reactie te kwantificeren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4&rsquo;,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>D3571</td><td>lichtgevoelig en bewaar bij -20 &ordm;C in aliquots</td></tr><tr><td>Kloon cilinders</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugaat</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>lichtgevoelig</td></tr><tr><td>Geit anti-konijn IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugaat</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>lichtgevoelig</td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td>Bewaar bij -20 &ordm;C in aliquots</td></tr><tr><td>Vectashield montagemedium&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-pentosidine klonale PEN-12 mAb</td><td>TransGenic Inc</td><td>KH012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Bewaar bij -20 &ordm;C in aliquots</td></tr><tr><td>Konijn anti-menselijk collageen IV polyklonaal antilichaam&nbsp;&nbsp;</td><td>Acris Antibodies</td><td>R1041</td><td>Bewaar bij -20 &ordm;C in aliquots</td></tr><tr><td>Konijn anti-laminine A/C pAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-7292</td><td>Bewaar bij -20 &ordm;C in aliquots</td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol tert-octylfenyl ether (Triton-X100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol sorbitaanmonolauraat (Tween-20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Dialyse cassette Slide-A-Lyzer</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>66333</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>IV - Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARG2 gecontroleerde spanningsrotatierheometer</td><td>T.A. Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert S100 (20X vergroting) microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 gecontroleerde bevochtigde incubatiekamer voor Zeiss Axio S100 microscoop</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocale Axiovert 200M (40X, 63X vergroting) microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus LH50A microscoop uitgerust met een digitale camera met fasecontrast&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar Plus plate reader spectrofotometer</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>V - Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 1.47v</td><td>National Institute of Health, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress</td><td>Molecular Divices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hoe om te studeren basement membrane stijfheid als biofysische trigger bij prostaatkanker en andere leeftijdsgebonden pathologies of metabole ziekten

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Hier beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt om de biofysische micro verband met de toegenomen dikte en stijfheid van de basale membraan (BM) bij leeftijdsgebonden pathologieën en metabole stoornissen (zoals kanker, diabetes, microvasculaire ziekte, retinopathie, nefropathie en neuropathie) bestuderen . Het uitgangspunt van het model is niet-enzymatische verknoping van opgeloste BM (RBM) matrix door behandeling met glycolaldehyde (GLA) tot geavanceerde glycatie eindproduct (AGE) generatie te bevorderen via de Maillard-reactie. Voorbeelden van laboratoriumtechnieken die kunnen worden gebruikt om AGE generatie niet-enzymatische verknoping bevestigen en verhoogde stijfheid in GLA behandelde rBM geschetst. Deze omvatten bereiding van natief rBM (behandeling met fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS) en stijf rBM (behandeling met GLA) voor het bepalen van: een AGE gehalte in fotometrische analyse en immunofluorescentie microscopie, de niet-enzymatische verknoping door natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese (SDS PAGE) en confocale microscopie en de toegenomen stijfheid behulp reometrie. De hier beschreven procedure kan worden gebruikt om de stijfheid (elastische modulus, E) van rBM verhogen tot 3,2-voudige, in overeenstemming met metingen bij gezonde versus zieke menselijke prostaatweefsel. Om de biofysische micro-omgeving in verband met de vergrijzing en zieke prostaat recreëren klier drie prostaat celtypen werden geïntroduceerd aan inheemse rBM en stijf rBM: RWPE-1, prostaat epitheelcellen (PEC) afgeleid van een normale prostaat; BPH-1, PEC afgeleid van een prostaat die door goedaardige prostaathyperplasie (BPH); en PC3, metastatische cellen afkomstig van een secundaire beentumor afkomstig van prostaatkanker. Meerdere parameters kunnen worden gemeten, waaronder de grootte, vorm en invasieve eigenschappen van de 3D glandulaire acini gevormd door RWPE-1 en BPH-1 op inheemse versus stijf rBM en gemiddelde celgrootte lengte, migrerend snelheid en persistentie van celbeweging 3D kobaOIDs gevormd door PC3 cellen onder dezelfde omstandigheden. Cel signaalwegen en de subcellulaire lokalisatie van eiwitten kan ook worden beoordeeld.

3D Prostaat Acini gekweekt op Stijf rBM Na 6 dagen kweken PEC afgeleid van normaal prostaatweefsel (RWPE-1) (Figuur 1A) en BPH weefsel (BPH-1) (Figuur 1B) vorm acini op natieve (PBS behandelde) rBM die zijn georganiseerd in uniform sferoïden van epitheliale cellen. Deze acini hebben ook de kenmerken van goed georganiseerde PEC met apicale-to-basale polariteit en een zichtbare luminale ruimte 13,20. De acini gevormd door PEC afgeleid van normaal prostaatweefsel (RWPE-1) (Figuur 1A) en BPH weefsel (BPH-1) (Figuur 1B) met verstijfde (AGE-rich) rBM (behandeling met GLA) een verstoord architectuur (verschuiven van bolvormige naar veelhoekige in vorm en cellen uitsteken / migreren van de acini in de AGE-rijke rBM) (Figuur 1A). Deze<html> acini worden ook gekenmerkt door zeer ongeorganiseerd PEC op hun apicale-basale polariteit te hebben verloren met een klein of nihil luminale ruimte 13. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> Figuur 1:. Prostate epitheelcellen gegroeid 3D Glandular Acini op natieve en Stiff Gereconstitueerd Basement Membrane (rBM) (A) Helderveld afbeeldingen RWPE-1 cellen gekweekt gedurende 12 uur tot 6 dagen rBM gels behandeld met PBS (natief) of 50 mM glycolaldehyde gedurende 14 uur (AGE-rijk, stijf); Schaal bar = 50 micrometer. (B) BPH-1 cellen gekweekt zoals beschreven in paneel A; Schaalbalken = 50 urn; data is representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <html> Tabel 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; Tabel 1:. Kenmerken van de prostaat Epitheliale RWPE-1 acini Grown op Native, Semi-Stijf en stijf Gereconstitueerd Basement Membrane (RBM) RWPE-1 acini werden gekweekt op rBM voorbehandeld met PBS gedurende 14 uur (native), glycolaldehyde (GLA ) gedurende 6 uur (semi-stijf) of GLA gedurende 14 uur (stijf). Voor acinar vorm, het percentage (%) ± standaarddeviatie (SD) van de toer, werden semi-veelhoekige en veelhoekige acini berekend op basis van 5 onafhankelijke experimenten (50 acini gekwantificeerd per conditie). Relatieve acinar grootte werd berekend (inheemse rBM = 100%) van 3 onafhankelijke experimenten. Voor invasiviteit% ± SD acini met één of meer uitstekende cellen werden berekend uit 3 onafhankelijke experimenten. Voudige verandering wordt berekend door de gemiddelde waarde onder semi-stijf of stijf omstandigheden verkregen door de overeenkomstige waarde voor natieve omstandigheden verdelen. P-waarden berekend met t-toets (α = 0,05). NHOUD &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; AGE afhankelijk verhoogd rBM stijfheid bevordert PC3 prostaattumor celmigratie PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM migreren door het handhaven van continue cel-cel contact, terwijl PC3 cellen gekweekt op AGE-rijke (stijf) rBM bewegen onafhankelijk van elkaar (Figuur 2A). Na 72 uur in de cultuur PC3 cellen vormen foci (bolletjes) op inheemse (PBS behandeld) rBM, terwijl PC3 cellen op stijf (AGE-rijke) rBM van bolletjes niet en migreren onafhankelijk (Figuur 2B). PC3 cellen op stijf (AGE-rijke) rBM zijn meer langwerpig dan PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM (figuur 2C). PC3 cellen op stijve rBM migreren sneller dan PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM (figuur 2D). PC3 cellen op stijf rBM vertonen een daling van de persistentie in vergelijking met PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM (figuur 2E). <img alt = &quot;Figuur 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2:. Prostaattumor celmigratie op natieve en Stiff Gereconstitueerd Basement Membrane (rBM) (A) Helderveld afbeeldingen PC3 cellen gekweekt op rBM gels behandeld met PBS (natief) of 50 mM glycolaldehyde 14 uur (AGE-rijke, stijf) . De cellen werden afgebeeld met behulp van een helderveld microscoop (10X objectief) en een overname snelheid van 1 beeld per uur gedurende 12 uur, gevolgd door de cel volgen om trajecten te genereren. Getoonde afbeeldingen komen overeen met de tijdstippen na 0, 3, 6, 9 en 12 uur. Trajecten van enkele cellen worden getoond voor de 12 uur tijdstip. Schaal bar = 100 micrometer. (B) PC3-cellen gekweekt op natieve of stijve rBM voor 72 uur, en afgebeeld zoals in paneel (A). Schaal bar = 100 micrometer. Detail toont geselecteerde gebied op 2X vergroting. (C) Gemiddelde ± SD cellengte (pm); significant verschil tussen autochtone rBM en stijf rBM (p = 1,2 x 10 -23). ( <strong&gt; D) Gemiddelde ± SD snelheid (um / hr) berekend op basis van cell trajecten; significant verschil tussen autochtone rBM en stijf rBM (p = 0,004). (E) Gemiddelde ± SD voortbestaan ​​van de cel beweging (verhouding D / T, waarbij D = afstand van het begin tot het einde van de cel traject, T = totale lengte van de cel traject); significant verschil tussen autochtone rBM en stijf rBM (p = 0,0007). Voor panelen CE&gt; 10 cellen werden geanalyseerd, data is representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier leggen we een protocol voor het modelleren van de biofysische micro-omgeving waar de verknoping en verhoogde stijfheid van het basaal membraan (BM) geïnduceerd door geavanceerde glycatie eindproducten (AGE&#39;s) heeft pathologische relevantie.

Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Het algemene doel van dit model is om te onderzoeken hoe de stijfheid en dikte van het basaalmembraan, als gevolg van blootstelling aan geavanceerde glycatieproducten, het invasieve gedrag van cellen kan moduleren in overeenstemming met de vroege en gevorderde stadia van metastatisch prostaatkanker. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van ouderdomsgerelateerde pathologieën, zoals de wijze waarop een toegenomen stijfheid en dikte van het basaalmembraan bijdraagt aan kankerprogressie en metabole stoornissen zoals diabetes.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige methode biedt om de stijfheidsgraad te simuleren die in een klinische setting wordt gemeten in menselijke prostaattumoren. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot onze therapie en diagnose van prostaatkanker door ons begrip te verbeteren van hoe de stijfheid van het basaalmembraan moleculaire en cellulaire veranderingen bevordert. Personen die nieuw zijn aan deze methode kunnen hiermee worstelen, aangezien het model multidisciplinair is.Combinatie van technieken uit de velden van de chemie, fysica en biologie. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we de hypothese stelden dat de stijfheid van het basaalmembraan in de prostaat klier de novo invasief gedrag kan bevorderen in bekende getransformeerde epitheelcellen. Een video-demonstratie van deze methode is essentieel, omdat interdisciplinaire stappen beschreven moeten worden.Inclusief cross-linking van het keldermembraan, gevolgd door 3D-celkweek. Begin met het voorbereiden van een vlak ijsvlak en gebruik dit om een glazen objectglas met acht kamers af te koelen tot vier graden Celsius. Snijd vervolgens het uiteinde van een 200 microliter pipetteertip af en koel ook deze tip af tot vier graden Celsius.Zodra deze is afgekoeld, plaatst u de tip op een pipethulp met een capaciteit van 200 microliter. Gebruik deze om 40 microliters ijskoude BM-matrixoplossing in elke put van het gekoelde glazen objectglas met acht kamers over te brengen. Plaats het kamerobjectglas vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius om de polymerisatie van de basale membraan te bevorderen.Sluit de deur van de incubator zeer voorzichtig om te voorkomen dat de vloeibare gereconstitueerde basaalmembraan wordt verstoord. Voeg na precies 30 minuten 250 µL van een bereide glycolaldehyde-oplossing toe om de gepolymeriseerde, gereconstitueerde basaalmembraan te bedekken. Bereid vervolgens een negatieve controle door 250 µL steriel PDS toe te voegen aan een native, gereconstitueerde basaalmembraangel.Bereid daarnaast twee aanvullende controles voor door vóór het toevoegen aan de keldermembraangel ofwel 50 millimolar natriumcyanoborohydride of 250 millimolar aminoguanidine aan de glycolaldehyde-oplossing toe te voegen. Incubeer de gels vervolgens zes uur lang bij 37 °C om een semi-stijve gel te verkrijgen, of 14 uur lang voor een stijve gel.Verwijder na incubatie voorzichtig de oplossingen uit de gels en voeg 250 µL van één molar glycine-ethylester toe aan elke gel. Incubeer deze vervolgens gedurende één uur bij 37 °C. Was elke gel 10 keer met 500 µL PBS om alle sporen van de glycolaldehyde-oplossing en de glycine-ethylester te verwijderen.Voeg vervolgens 400 µL PBS toe om uitdroging te voorkomen en incubeer de gereconstitueerde keldermembraangelen gedurende de nacht bij 37 °C. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, verwijdert u de PBS uit de gereconstitueerde keldermembraangelen en voegt u 250 µL ijskoud, dubbel gedestilleerd water toe aan elke well. Incubeer de gelen gedurende 16 tot 24 uur bij 4 °C om ervoor te zorgen dat de matrix volledig is vloeibaar gemaakt.Breng vervolgens het vloeibare keldermembraan over in een buisje van 1,5 milliliter en meet de fluorescentie-emissie van de oplossing met een spectrofotometer. Centrifugeer daarna de oplossing en verwijder het resulterende supernatant. Resuspendeer het pellet in 500 microliters van een oplossing die 20 milligram per milliliter cyanogeenbromide en 70% mierenzuur bevat.Incubeer de monsters gedurende de nacht bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een wegwerpspuit van 1 mL om de resuspendeerde keldermembraangel over te brengen naar een dialysekasette met een moleculaire gewichtsafsnijding van 3,5 kDa. Dompel de kasette onder in een glazen bekerglas van 500 mL met 500 mL dubbel gedestilleerd water.Roer het water met een magnetische roerstaf. Laat deze opstelling een nacht bij vier graden Celsius staan om alle sporen van cyanogeenbromide en mierenzuur te verwijderen. Gebruik een disposable spuit van één milliliter om de gedialyseerde oplossing vanuit de cassette over te brengen naar een buis van 1,5 milliliter.Analyse vervolgens de oplossing door deze op een 12% polyacrylamidegel te laden. Kleur de gel met zilverkleuring om het elektroforetisch patroon van de cyanogeenbromide-matrixpeptiden te visualiseren. Begin met de basementmembraangels bedekt met PBS en spoel de gels nog twee keer extra met 300 microliters PBS die 0,1 millimol calciumchloride bevat.En 0,5 millimool magnesiumchloride. Gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de PBS en voeg 300 microliter 4% paraformaldehyde toe om elke gereconstitueerde basaalmembraangel te bedekken.Incubeer de gels gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de gereconstitueerde componenten van het basaalmembraan te fixeren. Verwijder vervolgens het fixeermiddel en voeg 300 µL van een quenching-oplossing toe die 75 mM ammoniumchloride en 0,5 mM magnesiumchloride bevat. Incubeer de oplossing gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, verwijder daarna de oplossing en herhaal het spoelen nog vier keer.Voeg na de laatste spoeling 300 µL immunofluorescentiebuffer toe aan de gereconstitueerde keldermembraangelen om aspecifieke reacties te voorkomen. Incubeer de gelen gedurende twee uur bij kamertemperatuur in de oplossing op een schudplatform. Verwijder vervolgens de immunofluorescentie-blokkeringsbuffer.Voeg vervolgens 300 µL primaire antilichaam toe, verdund in de blokkeringsbuffer. Incubeer de gereconstitueerde keldermembraangelen 16 uur bij 4 °C. Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam en was de gelen drie keer met 300 µL immunofluorescentiebuffer.Schud de gels gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een schudplatform na elke toevoeging van buffer. Verwijder vervolgens de buffer en voeg 300 µL van het fluorescent gelabelde secundaire antilichaam toe, verdund in de blokkeringsbuffer. Plaats de monsters op een schudplatform en incubeer de gels gedurende twee uur bij kamertemperatuur.Verwijder het secundaire antilichaam. Spoel het monster af met een immunofluorescentiebuffer, gevolgd door PBS, en fixeer en quench de monsters vervolgens nogmaals. Monteer tot slot de gels en gebruik een microscoop om de vorming van dichte bundels te analyseren.Om acini van de prostaatklier te vormen, verdun 5 000 RWPE-1-cellen in 300 µL compleet KSFM, aangevuld met 2% van de basaalmembraanoplossing. Voor prostaattumorcelaggregaten verdun 2 500 PC3-cellen in 300 µL RPMI-1640 kweekmedium, aangevuld met 2% van de basaalmembraanoplossing. Na een nachtelijke incubatie van de gereconstitueerde basaalmembraangelels in PBS, spoel deze twee keer af met 500 µL kweekmedium.Voordat de cellen worden gezaaid: zaai de cellen voorzichtig uit op de gereconstitueerde keldermembranen die zijn verstijfd met native en geavanceerde glycatie-eindproducten. Plaats de culturen vervolgens zorgvuldig in een incubator om een gelijkmatige verdeling van de groeiende acini en sferoïden te waarborgen.Vervang voor de acini-vormende cellen elke twee dagen het medium door vers cultuurmedium, dat 2% van de keldermembraanoplossing bevat. Dit is om ervoor te zorgen dat de cellen over de groeifactoren beschikken die nodig zijn voor een normale acini-homeostase. Na zes dagen in cultuur vormen prostaatepitheelcellen acini op een natuurlijk gereconstitueerd keldermembraan.En zijn georganiseerd in uniforme sferoïden van epitheelcellen. Deze acini vertonen tevens de kenmerken van zeer georganiseerde PEC's met apicale tot basale polariteit en een zichtbare luminale ruimte. Wanneer ze zes dagen lang op het verstevigde membraan worden gekweekt, hebben de cellen een verstoorde architectuur.En ze veranderen van sferoïde naar polygonale vorm. Daarnaast zijn deze acini sterk gedesorganiseerd en hebben ze hun apicaal-basale polariteit verloren, met een kleine of afwezige luminale ruimte.Dit geldt ook voor cellen afgeleid van een prostaatklier die is aangetast door goedaardige prostaathyperplasie. Bij de metingen van de prostaattumorcellen bleek dat de cellen langer waren op het stijve, gereconstitueerde basaalmembraan, en dat ze bovendien sneller migreerden en een verhoogde celpersistentie vertoonden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de effecten van de stijfheid van het basaalmembraan op het gedrag van epitheliale cellen en tumorcellen gemodelleerd kunnen worden.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de gewenste stijfheid van het basaalmembraan wordt geïnduceerd en dat individuele acini of s-sferoïden correct worden gevormd. Na de ontwikkeling van deze techniek is de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de oncologie om de inductie van invasie van kankercellen door de stijfheid van het basaalmembraan in de prostaatklier te onderzoeken. Na dit protocol kunnen andere methoden, zoals immunoblotting van cellysaat, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot signaalpaden die worden gemoduleerd door de stijfheid van het basaalmembraan.Vergeet niet dat het werken met natriumcyanoborohydride, cyanogeenbromide en mierenzuur uiterst gevaarlijk kan zijn; tijdens het uitvoeren van deze procedure moeten daarom altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van een laboratoriumjas, handschoenen, een gelaatsscherm en een ademhalingsbeschermingsmiddel tijdens het werken in de zuurkast.

how-to-study-basement-membrane-stiffness-as-biophysical-trigger

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Het effect van substrata stijfheid op cellulaire functie kan worden...

Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid te meten. Het algemene principe van deze benadering is membraan vervorming te meten in reactie op welbepaalde negatieve druk aangebracht door een micropipet op het celoppervlak. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om biomechanische eigenschappen van substraat-aangehechte cellen te bestuderen.

Micropipet Aspiratie van substraat-attached Cellen to Cell Stijfheid Schatting

Deeltjes volgen microrheology kunnen worden gebruikt om niet-destructieve kwantificeren en veranderingen in extracellulaire matrix mechanische eigenschappen in 3D tumormodellen ruimtelijk in kaart.

Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

We presenteren gedetailleerde protocollen voor het isoleren van aorta's uit muizen en het meten van hun elastische modulus met behulp van atoomkrachtmicroscopie.

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.

Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Hier gepresenteerd is het protocol van de Conpokal techniek, die confocale en atomaire kracht microscopie combineert in een enkel instrument platform. Conpokal biedt dezelfde cel, dezelfde regio, in de buurt van gelijktijdige confocale beeldvorming en mechanische karakterisering van levende biologische monsters.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) op Live Cells

We hebben onlangs retinale capillaire verstijving geïdentificeerd als een nieuw paradigma voor retinale disfunctie geassocieerd met diabetes. Dit protocol werkt de stappen uit voor de isolatie van de retinale capillairen van muizen en de subendotheelmatrix uit retinale endotheelculturen, gevolgd door een beschrijving van de stijfheidsmeettechniek met behulp van atoomkrachtmicroscopie.

Isolatie van de retinale capillairen en subendotheliale matrix van muizen voor stijfheidsmeting met behulp van atoomkrachtmicroscopie

Dit protocol visualiseert hoe cryosecties van muizenlongweefsel moeten worden voorbereid, experimenten met atoomkrachtmicroscopiekaarten kunnen worden uitgevoerd en de gegevens moeten worden geanalyseerd om Young's modulus van het inheemse muizenlongbasaalmembraan te bepalen.

Extractie van de Young's Modulus van inheemse muizen pulmonale basaalmembranen uit door atoomkrachtmicroscopie afgeleide krachtkaarten

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Dynamische nucleaire polarisatie met daaropvolgende oplossing van het monster heeft real-time studies van metabolisme in biologische systemen mogelijk gemaakt. Gehyperpolariseerd [1-13C]pyruvaat werd gebruikt om lactate dehydrogenase-activiteit te bestuderen in een prostaatcarcinoom-cellijn in vitro.

hypergepolariseerde 13 C Metabolic magnetische resonantie spectroscopie en beeldvorming

Leer hoe basement membrane stijfheid invasief celgedrag beïnvloedt bij prostaatkanker met dit interdisciplinaire model. Deze techniek bootst tumorstijfheid na en verbetert inzicht in kankerprogressie.

Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten (Video) | JoVE Journal

Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten

Meer video's verkennen