Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten

Het algemene doel van dit model is om te onderzoeken hoe de stijfheid en dikte van de basementmembraan, als gevolg van gevorderde glycatie en productblootstelling, het invasieve celgedrag kan moduleren dat overeenkomt met de vroege en gevorderde stadia van uitzaaiend prostaatkanker. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van leeftijdsgerelateerde pathologieën. Zoals hoe verhoogde stijfheid en dikte van de basementmembraan bijdraagt aan kankerprogressie, en ook aan metabole stoornissen zoals diabetes.

Het grootste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige methode biedt om het niveau van stijfheid na te bootsen dat gemeten wordt in humane prostaattumoren in de klinische setting. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot onze therapie en diagnose van prostaatkanker door ons begrip te verbeteren van hoe basementmembraanstijfheid moleculaire en cellulaire veranderingen bevordert. Personen die nieuw zijn met deze methode kunnen worstelen, omdat het model multidisciplinair is.

Door technieken te combineren uit de vakgebieden chemie, fysica en biologie. We hadden eerst het idee voor deze methode toen we veronderstelden dat basementmembraanstijfheid in de prostaatklier de novo invasief gedrag kan bevorderen in bekende getransformeerde epitheelcellen. Videodemonstratie van deze methode is cruciaal, omdat interdisciplinaire stappen moeten worden beschreven.

Waaronder cross-linking van de basementmembraan, gevolgd door 3D-celcultuur. Begin door een gelijkmatige ijsoppervlakte voor te bereiden en gebruik deze om een acht-kamerglasplaatje tot vier graden Celsius te koelen. Snijd vervolgens het uiteinde van een 200 microliter pipettetip af en koel de tip eveneens tot vier graden Celsius.

Eenmaal afgekoeld, plaats de tip op een pipetsleuf voor 200 microliter. En gebruik deze om 40 microliter ijskoud BM-matrixoplossing in elk van de wel van de gekoelde acht-kamerglasplaatjes over te brengen. Plaats vervolgens de kamerplaatje op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten om de polymerisatie van de basementmembraan te bevorderen.

Sluit de deur van de incubator zeer voorzichtig om verstoring van de vloeibare gereconstitueerde basementmembraan te voorkomen. Voeg na exact 30 minuten 250 microliter van een voorbereide glycolaldehyde-oplossing toe om de gepolymeriseerde, gereconstitueerde basementmembraan te bedekken. Bereid vervolgens een negatieve controle voor door 250 microliter steriele PDS toe te voegen aan een nat, gereconstitueerd basementmembraangeel.

Bereid ook twee extra controles voor door ofwel 50 millimolair natriumcyanoborohydride, of 250 millimolair aminoguanidine toe te voegen aan glycolaldehyde-oplossing voordat u deze aan het basementmembraangeel toevoegt. Incubeer vervolgens de gels bij 37 graden Celsius gedurende zes uur om een semi-stijve gel te produceren. Of gedurende 14 uur om een stijve gel te produceren.

Na incubatie, verwijder voorzichtig de oplossingen uit de gels en voeg 250 microliter van een molaar glycine ethyl ester toe aan elke gel. En incubeer ze bij 37 graden Celsius gedurende één uur. Was elke gel 10 keer in 500 microliter PBS om alle sporen van de glycolaldehyde-oplossing en de glycine ethyl ester te verwijderen.

Voeg vervolgens 400 microliter PBS toe om uitdroging te voorkomen en incubeer de gereconstitueerde basementmembraangeels overnacht bij 37 graden Celsius. Wanneer u klaar bent om door te gaan, verwijder de PBS uit de gereconstitueerde basementmembraangeels en voeg 250 microliter ijskoud, dubbel gedistilleerd water toe aan elke wel. Incubeer de gels bij vier graden Celsius gedurende 16 tot 24 uur om ervoor te zorgen dat de matrix volledig is gevloeid.

Breng vervolgens het gevloeide basementmembraan over in een 1,5 milliliterbuis en meet de fluorescerende emissie van de oplossing met behulp van een spectrofotometer. Centrifugeer vervolgens de oplossing en verwijder de resulterende supernatant. Suspensie de pellet opnieuw in 500 microliter van een oplossing die 20 milligram per milliliter cyanogen bromide en 70% formzuur bevat.

Incubeer de monsters overnacht bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een enkele milliliter wegwerpspuit om het opnieuw gesuspendeerde basementmembraangeel over te brengen in een dialyse cassette met een moleculair gewichtssnede van 3,5 kilodalton. Dompel de cassette onder in een 500 milliliter glazen beker met 500 milliliter dubbel gedistilleerd water.

En roer het water met een magnetische roerstaaf. Plaats deze opstelling overnacht bij vier graden Celsius om alle sporen van cyanogen bromide en formzuur te verwijderen. Gebruik een enkele milliliter wegwerpspuit om de gedialyseerde oplossing uit de cassette over te brengen in een 1,5 milliliterbuis.

Analyseer vervolgens de oplossing door deze te draaien op een 12% polyacrylamide gel. Kleur de gel met zilver kleur om het elektroforese patroon van de cyanogen bromide matrix peptiden te visualiseren. Begin met de basementmembraangeels bedekt met PBS, spoel de gels nog twee keer, met 300 microliter PBS bevattende 0,1 millimol calcium chloride.

En 0,5 millimol magnesium chloride. Gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het PBS en voeg 300 microliter van 4% paraformaldehyd toe om elke gereconstitueerde basementmembraangeel te bedekken.

Incubeer de gels gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de gereconstitueerde basementmembraancomponenten te fixeren. Verwijder vervolgens de fixeervloeistof en voeg 300 microliter van een blusoplossing toe, bevattende 75 millimol ammoniumchloride en 0,5 millimol magnesiumchloride. Incubeer de oplossing gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens de oplossing en herhaal het spoelen nog vier keer.

Na de laatste spoeling, voeg 300 microliter van immunofluorescence buffer toe aan de gereconstitueerde basementmembraangeels om niet-specifieke reacties te voorkomen. Incubeer de gels in de oplossing gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een schuddende platform. Verwijder vervolgens de immunofluorescence blokkeer buffer.

En voeg 300 microliter van primair antilichaam toe, verdund in de blokkeer buffer. Incubeer de gereconstitueerde basementmembraangeels gedurende 16 uur bij vier graden Celsius.