Een eenvoudige methode voor Plant polysoomdisplays Profiling
28 augustus 2016
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om transcripten uit plantweefsels te extraheren en te fractoneren op basis van het aantal gebonden ribosomen. Het maakt een globale schatting van de translatieactiviteit mogelijk en de bepaling van de translationele status van specifieke mRNA's.
Hallo, ik ben Cecile. Ik werk bij de LGBP in Marseille. Het protocol dat we in deze video gaan beschrijven, is een eenvoudige methode om polysomen en monosomen te isoleren uit verschillende plantenweefsels om mRNA's te identificeren die actief worden vertaald en om de translatie-regulatie te bestuderen.
Als voorbeeld gaan we u de isolatie van polysomen laten zien van zes dagen oude Arabidopsis thaliana zaailingen, daaropvolgende isolatie van RNA en de analyse van de resultaten. Zaai de zaden op een plaat en laat ze twee dagen op vier graden. Laat vervolgens de planten zes dagen groeien.
Oogst de zaailingen en vermaal ze in vloeibare stikstof. Weeg 300 milligram plantenpoeder af en voeg 2,4 milliliter polysoombevattende buffer toe. Centrifugeer om plantfragmenten te verzamelen en laad het supernatant op de bovenkant van een sucrosegradiënt.
Ultra-centrifugeer de gradiënt en verzamel deze vervolgens van onder naar boven met continue aflezing van de OD. Trek de fractie in een polysoombevattende, een monosoombevattende en een supernatantfractie en laat RNA overnacht bezinken. Ultra-centrifugeer, suspendeer het pellet opnieuw en extraheer RNA voor verdere analyse. Enkele dagen voordat u polysoomprofilering uitvoert, bereidt u de sucrosegradiënt voor.
Bereid 50, 35 en 20% sucrose-oplossingen voor en bewaar ze op vier graden. Giet de 50% sucrose-laag. Vries het in een min 40 vriezer.
Na zes uur voegt u de 35% laag toe en vriest u deze in een min 40 vriezer overnacht. Giet de eerste 20% laag en vries hem. Op de dag van het experiment verwijdert u het noodzakelijke aantal gradiënten uit de vriezer.
Voeg de laatste 20% sucrose-laag toe en laat de gradiënten in een koude kamer ontdooien. Bereid het monster voor van de vers verzamelde plant. Hier gebruiken we zes dagen oude zaailingen van Arabidopsis thaliana.
Oogst de met vloeibare stikstof bevroren planten en vermaal ze grondig. Weeg 300 milligram plantenpoeder af. Voeg snel 2,4 milliliter verse polysoombevattende buffer toe en homogeniseer.
Pipetteer de oplossing in twee buisjes van 1,5 milliliter. Centrifugeer het cytosolische extract. Pipetteer het supernatant.
Pas op dat u plantfragmenten vermijdt. Deze zouden het profiel in de volgende stap bederven. Laad het supernatant op de sucrosegradiënt zonder de gradiënt te verstoren.
Plaats de gradiënt in een SW 41 rotor-emmer. Centrifugeer. Om het polysoomprofiel te visualiseren en de fractie te verzamelen, gebruiken we een eenvoudig systeem gemaakt van een capillaire buis die in de gradiënt duikt. Deze is verbonden met een UV-cuvet.
Het is zelf verbonden met een peristaltiekpomp. Een UV-spectrofotometer registreert continu de OD terwijl de gradiënt door de cuvet gaat. De fractieverzamelaar maakt het mogelijk om fracties van twee milliliter te verzamelen.
Reinig de cuvet en plaats deze in de spectrofotometer. Verwijder de gradiënt uit de emmer zonder deze te verstoren. Chlorofylen moeten worden geconcentreerd op de bovenkant van de gradiënt.
Duik de capillaire buizen naar de bodem van de gradiënt. Start de peristaltiekpomp. De gradiënt wordt verzameld van de bodem naar de bovenkant en de OD wordt continu afgelezen.
Fracties van twee milliliter worden verzameld. Dit is de vorm van een klassiek profiel. De RNA-bezinking wordt uitgevoerd met behulp van guanidiniumhydrochloride en isopropanol.
Pour eerst één volume guanidiniumhydrochloride in een buis van 50 milliliter en voeg vervolgens de fractie toe. Voeg vervolgens 1,5 volume isopropanol en 50 microgram gelijke koerier toe. Bezinken het RNA overnacht bij min 20 graden.
Breng de fracties over in ultra-centrifugebuisjes van 40 milliliter en breng het buisje in balans met isopropanol. Centrifugeer. Verwijder het supernatant en laat het pellet aan de lucht drogen. Suspendeer het pellet in 200 microliter warme TE-buffer.
Extract het RNA verder door een klassieke fenol-chloroform-extractie uit te voeren. Een representatief profiel van polysoomextract uit zes dagen oude zaailingen van Arabidopsis wordt hier getoond. De hoofdpiekk komt overeen met het monosoombevattende, het mRNA dat geassocieerd is met een enkel ribosoom.
Het eerste deel van het profiel komt overeen met de polysoomfracties, namelijk het mRNA dat geassocieerd is met veel ribosomen. Elke piek komt overeen met de associatie van het nieuwe ribosoom met het mRNA. Het laatste deel van het profiel komt overeen met de zogenaamde supernatantfractie die de vrije ribosoomsubeenheden en RNA bevat.
Grote hoeveelheden van de 60S subeenheden vormen een schouder naast de monosoompiek. Om hun integriteit te beoordelen, kunnen de RNA's die uit de fracties zijn geëxtraheerd, op een klassieke Aragose-gel worden gedraaid voordat ze worden gebruikt voor verdere experimenten. We hebben dit protocol gebruikt om polysomen te isoleren uit zaailingen van Arabidopsis thaliana, maar ook uit jonge en oude rosetten, evenals uit bladeren van Nicotiana benthamiana, tomaat en rijst, dus het zou moeten werken met een breed scala aan planten en weefsels.
De gezuiverde RNA's zijn compatibel met en micro-array-analyse, evenals voor de identificatie van kleine RNA's geassocieerd met polysoomfracties.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om polysomen en monosomen uit plantweefsels te isoleren, waardoor de identificatie van actief vertaalde mRNA's en de studie van translatieregeling mogelijk wordt. Het voorbeeld richt zich op de isolatie van polysomen uit zes dagen oude Arabidopsis thaliana zaailingen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Plantenbiologie
- Translatieregeling
- mRNA-analyse
Achtergrond
- Het begrijpen van translatieactiviteit is cruciaal voor het bestuderen van genregulatie.
- Polysomen zijn clusters van ribosomen die mRNA vertalen, terwijl monosomen enkele ribosomen zijn.
- Deze methode geeft inzicht in de translationele status van specifieke mRNA's.
- Arabidopsis thaliana dient als modelorganisme in plantenonderzoek.
Doel van de studie
- Polysomen en monosomen isoleren uit plantweefsels.
- mRNA's identificeren die actief worden vertaald.
- De regeling van translatie in planten bestuderen.
Gebruikte methoden
- Zaaien van zaden op platen en koude stratificeren gedurende twee dagen.
- Zaailingen zes dagen laten groeien onder optimale omstandigheden.
- Isoleren van polysomen en monosomen uit de plantweefsels.
- RNA analyseren om translatieactiviteit te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van polysomen uit Arabidopsis thaliana zaailingen.
- Identificatie van actief vertaalde mRNA's.
- Inzichten in de regeling van translatie in plantweefsels.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode voor het bestuderen van translatie.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van translatie in planten.
- Het versterkt het begrip van genregulatie.
- De aanpak kan worden toegepast op verschillende plantensoorten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Polysome profiling provides a direct snapshot of translational activity, enabling mechanistic de-risking of target hypotheses in plant-based biopharma discovery. By distinguishing actively translated mRNA pools, the method supports target validation and phenotypic screening in agriculturally relevant systems. This approach enhances predictive confidence when prioritizing leads for crop improvement or molecular farming applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mRNA abundance to translational output.
- Operational Value: Clarifies pathway activity through ribosome engagement metrics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets with sustained translational engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening in plant expression platforms.
- Operational Value: Enables assay standardization via quantitative OD260 profiling and fraction reproducibility.
- Scalability: Supports platform reuse across Arabidopsis, Nicotiana, tomato, and rice tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase target validation to preclinical biomarker assessment in plant systems.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by isolating mRNA populations defined by ribosome load.
- Disease-Relevant System: Applicable to crop models used in molecular farming and biopharma production.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing before lead identification and enabling translational continuity into preclinical evaluation in plant-based systems.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring shifts in polysome/monosome ratios under experimental conditions.
- Screening: Delivers ribosome-profiling readouts that help compare compound or genetic perturbation effects.
- Analytics: Generates quantitative OD260 tracings and fractionated RNA yields for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery in plant molecular farming pipelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a fractionation capability applicable across diverse plant tissues and species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving translational states of target mRNAs.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized sucrose gradient fractionation and continuous OD monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target modulation at the translation level.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on translational activity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and polysome buffer preparation.
- Depends on ultracentrifugation equipment and fraction collection systems with UV monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for gradient preparation and fraction pooling protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to non-model plant systems.
- Involves practical limitations related to RNA integrity during fractionation and extraction steps.
