Name: Een eenvoudige methode voor Plant polysoomdisplays Profiling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor polysoomprofiling in planten om actief vertaalde mRNA's te identificeren met Arabidopsis thaliana. Dit protocol helpt onderzoekers bij het bestuderen van translatie regulatie in plantaardige weefsels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Franse National Research Agency (ANR-14-CE02-0010). Wij danken Dr Benjamin Field en Dr. Elodie Lanet voor kritische lezing van het manuscript. We danken de heer Michel Terese voor zijn hulp met video editing.

1. Bereiding van 20 tot 50% (w / v) sucrose gradiënten Opmerking: De gradiënten bestaan ​​uit 4 lagen sucrose (50%, 35% en 2 lagen 20%) in 13,2 ml ultracentrifuge buis. In onze ervaring, het gieten van de 20% sucrose in twee afzonderlijke lagen aanzienlijk verbetert de kwaliteit van polysoomdisplays preparaten. <ol><li> Bereid de voorraad oplossingen. Zorg ervoor dat alle oplossingen zijn RNAse en DNAse gratis. <ol><li> Bereid 10X zoutoplossing: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCl en 100 mM MgCl2. </li><li> Bereid 2 M Sucrose Oplossing: Voor 200 ml, los 137 g sucrose in 1X Salt Solution. </li></ol></li><li> Verdun de sucroseoplossing in zoutoplossing, zoals beschreven in Tabel 1, de gradiënten te bereiden. De volumes zijn gegeven voor zes hellingen. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Final sucrose concentratie </td><td> sucrose 2M (ml) </td><td> Zoutoplossing 1X (ml) </td><td> Def Vol. (ml) </td></tr><tr><td> 50% </td><td> 8.8 </td><td> 3.2 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 35% </td><td> 12.9 </td><td> 12.1 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 7.4 </td><td> 17.6 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 5.8 </td><td> 14.2 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. verdunningen van de sucrose-oplossing tot zes hellingen te bereiden. <ol start="3"><li> Giet de lagen volgens tabel 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sucrose layer </td><td> 50% </td><td> 35% </td><td> 20% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> Vol. (Ml) </td><td> 1.85 </td><td> 3.65 </td><td> 3.65 </td><td> 1.35 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Volume van sucrose-oplossing per laag. <ol start="4"><li> Na het gieten elke laag, houdt de buizen in een -40 ° C of -80 ° C vriezer tot volledige bevriezing voor het toevoegen van de volgende laag sucrose. Bevriezen wordt gewoonlijk bereikt na 2 uur bij -40 ° C, maar wachten ongeveer 6 uur voor het gieten van de volgende laag wordt aanbevolen. De laatste 20% laag kan worden bevroren of vers toegevoegd op de dag van het experiment. Opmerking: Het bevriezen elke laag voor het toevoegen van het volgende voorkomt vermenging of verstoring van de lagen. Gradiënten kunnen in een -40 ° C bewaard of -80 ° C vriezer gedurende ten minste zes maanden. </li><li> Als het nog niet is gedaan, voeg de laatste 20% laag om de hellingen op de dag van het experiment. Vervolgens laat de gradiënten ontdooien in een koude kamer of een koelkast. </li></ol> 2. Bereiding van cytosolextracten Let op: We recommeindigen met twee hellingen per biologisch monster. 300 mg is de optimale hoeveelheid plantaardig materiaal tot twee hellingen te bereiden bij het ​​werken met 6 dagen oud Arabidopsis thaliana zaailingen. Bij het werken met minder translationeel actieve weefsels, kan de hoeveelheid plantenmateriaal worden verhoogd tot 600 mg. <ol><li> Harvest zes dagen oude zaailingen gegroeid op ½ Murashige en Skoog 8 medium aangevuld met 1% sucrose of gelijkwaardige media door diepvriezen in vloeibare stikstof </li><li> Grind plantmateriaal in een voorgekoeld mortier en een stamper met vloeibare stikstof. </li><li> Weeg 300 mg poedervormig materiaal in een voorgekoeld weegschaal. Voer deze stap snel ontdooien van het monster te voorkomen. Opmerking: Bewaar de ingevroren monsters niet meer dan een week in een -80 ° C vriezer. </li><li> Voeg 2,4 ml voorgekoelde polysoomdisplays buffer (Salt Solution 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (v / v) octylfenoxy poly (ethyleenoxy) ethanol, vertakte, 50 μg.ml -1 cycloheximide, 50 μg.ml 1chlooramfenicol) en homogeniseren door mengen met de pipet tip. Over in twee 1,5 ml buizen. Werk snel te voorkomen dat de monsters opwarmt. </li><li> Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C in een microcentrifuge om vuil te pelleteren. Opmerking: Om RNA degradatie te voorkomen, altijd de monsters bij 4 ° C, gebruik RNase / DNase gratis oplossingen en werken in RNase / DNase vrije omstandigheden. Heparine kan worden toegevoegd aan de polysoomdisplays buffer tot een eindconcentratie van 300 μg.ml -1, RNA beter te beschermen. Aangezien heparine kunnen interfereren met benedenstrooms analyse zal tijdens de RNA neerslaan door het uitvoeren lithiumchloride precipitatie plaats van ethanolprecipitatie (zie toelichting 4.7) te verwijderen. </li></ol> 3. polysoom Profiling <ol><li> Voorzichtig pipet de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren. Als plantendeeltjes zijn gepipetteerd, herhaalt u stap 2.5. Plaats het supernatant bovenop de gradiënt door zachtjes pipetting op de zijwand van de buis in een constante stroom. Gebruik een helling voor elke 1,5 ml buis. </li><li> Transfer emmers en centrifugeer voorgekoeld bij 175.000 xg gedurende 2 u 45 min bij 4 ° C, in een ultracentrifuge (bijvoorbeeld 32.000 rpm bij gebruik van een SW41 rotor). </li><li> Stel het verloop verzamelen zoals beschreven in figuur 1. De UV cuvette heeft een 1 mm weglengte. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" /> Figuur 1. Gradient opvangsysteem. De UV cuvette is via polyvinylchloride buis een glazen capillaire buis die afdaalt naar de bodem van de gradiënt. De gradiënt doorloopt het systeem door een peristaltische pomp. OD 260 wordt continu gelezen en 2 ml fracties worden verzameld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie te bekijken</a>dit figuur. <ol start="4"><li> Pas de fractie collector naar RT, en zet de carrousel op een snelheid die het verzamelen van 2 ml fracties zal toestaan. Gebruik pre-gekoelde collectie buizen. </li><li> Verzamelen van de fracties van onder naar boven met een glazen capillaire buis verbonden met polyvinylchloride slang aan het verloop opvangsysteem. Gebruik een kunststof paraffine film de verbinding tussen de polyvinylchloride buis en de glazen capillaire fixeren. </li><li> Lees absorptie bij 260 nm van de bodem naar de top van de gradiënt. Wanneer het gehele verloop wordt verzameld, plaatst de collectie buizen op ijs voor RNA-extractie. </li></ol> 4. RNA-extractie <ol><li> Verzamel de verzamelde fracties uit twee hellingen, in 50 ml centrifugebuizen afgedekt, als volgt: Polysomen: fracties 1-3 (12 ml) Monosomes: deel 4 (4 ml) Supernatant: fracties 5 en 6 (8 ml) </li><li> Aan elke fractie, voeg 1 vol. 8M guanidine hydrochloride,50 ug acryl drager en 1,5 vol. isopropanol. Opmerking: Acryl drager lineair acrylamide, gebruikt als coprecipiteermiddel de terugwinning van nucleïnezuren in alcoholprecipitatie verbeteren. </li><li> Meng door de buizen en precipiteren O / N bij -20 ° C. </li><li> Centrifugeer bij 175.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C, in een ultracentrifuge (32.000 rpm in een SW32 rotor). Als de precipitatie wordt uitgevoerd in een buis die niet compatibel is met ultracentrifugatie, In een geschikte buis. </li><li> Verwijder het supernatant en los de pellet in 200 ul RNAse-vrij TE-buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5-1 mM EDTA). Over te dragen aan een nieuwe 1,5 ml buis. </li><li> Extract RNA door toevoeging van 1 vol. water verzadigd fenol (pH 6,6) en 1 vol. chloroform: isoamylalcohol (24: 1). Meng krachtig. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Breng de waterige fase naar een nieuwe 1,5 ml buis. Noot: Zuur fenol (pH 4,5) kan worden gebruikt om DNA besmetting te minimaliseren. </li><li>RNA te precipiteren door toevoeging van 1/10 volume. 3 M natriumacetaat en 3 vol. 100% ethanol. Laten neerslaan bij -80 ° C gedurende 20 min of O / N bij -20 ° C. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Opmerking: Bij gebruik van heparine in de polysoomdisplays buffer (zie toelichting 2.5), het uitvoeren van een lithium chloride (LiCl) neerslaan in plaats van ethanolprecipitatie om enig spoor van heparine die kunnen interfereren met downstream-analyse 9 naar behoren te verwijderen. Na extractie voeg LiCl tot een eindconcentratie van 2,5 M. toegestaan ​​precipitatie gedurende 30 minuten bij -20 ° C of O / N bij 4 ° C. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Was de pellet met 500 pl 75% ethanol. Lucht droog de pellet en los op in 30 ui TE-buffer. Beoordelen RNA kwaliteit die door elektroforese op een vrije RNAse 1,2% agarosegel (100V, 15 min) of door capillaire elektroforese werkwijzen. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Export ruwe data naar een grafische en data-analyse software. Notitie: Zoals getoond in figuur 2A en B, de ruwe profielen geven kwalitatieve informatie: het aantal polysoomdisplays pieken die te zien is de hoogte van de piek monosome, en de aanwezigheid van een schouder overeenkomt met de vrije ribosoom subeenheden. </li><li> Samenvoegen profielen aan vergelijking van de profielen tussen monsters mogelijk. Gebruik het scherm lezer tool om de X-waarde van de monosome piek voor elk monster te bepalen en lijn de monosome pieken door het verwijderen van extra meetpunten aan het begin van de bochten. Identificeer het laagste punt van de curve en zijn bepalend voor de Y-waarde (met behulp van de lezer gereedschap scherm). Stel het laagste punt Y waarde op 0 met behulp van de functie &quot;set kolommen value&quot;. </li><li> Bepaal de polysomen / monosomes verhouding door de integratie van het gebied onder de curve van de ruwe profielen (figuur 3C). Gebruik de gegevensselector gereedschap definiëren de grens van het gebied te integreren. Maak dan gebruik van de integratie-functie (Analysis-Wiskunde). </li><li> normaliserende bocht naar monosome piek door het verdelen van alle datapunten van een kromme door de Y-waarde van de top van de monosome piek (bepaald met behulp van de lezer gereedschap scherm). Selecteer de kolom, vervolgens onder Analyse-Wiskunde, selecteert normaliseren en kiezen voor de &quot;gedeeld door een bepaalde waarde&quot; methoden. Deze stap maakt vergelijking van het relatieve niveau van polysomen (Figuur 3D). </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" /> Figuur 2. Vertegenwoordiger polysoomdisplays profielen. Arabidopsis thaliana wild-type (wt, ecotype Col-0) en mutant zaailingen werden gekweekt voor zes dagen op ½ Murashige en Skoog medium onder lange dag fotoperiodiciteit (16 uur licht, 8 uur donker). A: raw polysoomdisplays profielen van wt zaailingen. B: raw polysoomdisplays profielen van mutant zaailingen. C: Bepaling van het percentage polysomen en monosomes door integratie van het gebied onder de kromme D: polysoomdisplays profiles genormaliseerd naar de monosome piek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<ol><li>Nelson, C. J., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+in+plant+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Protein turnover in plant biology.</a> Nat Plants. 1 (3), 15017(2015).</li>
<li>Warner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economics+of+ribosome+biosynthesis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The economics of ribosome biosynthesis in yeast.</a> Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).</li>
<li>Amthor, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+McCree-de+Wit-Penning+de+Vries-Thornley+Respiration+Paradigms%3A+30+Years+Later%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later.</a> Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).</li>
<li>Preiss, T., W Hentze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starting+the+protein+synthesis+machine%3A+eukaryotic+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).</li>
<li>Baerenfaller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteomics+reveals+Arabidopsis+thaliana+gene+models+and+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics.</a> Science. 320 (5878), 938-941 (2008).</li>
<li>Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopurification+of+Polyribosomal+Complexes+of+Arabidopsis+for+Global+Analysis+of+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiol%22%5BJournal%5D)">Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression.</a> Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Arabidopsis+protocols%22">Arabidopsis protocols</a>. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).</li>
<li>Piques, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+and+transcript+copy+numbers%2C+polysome+occupancy+and+enzyme+dynamics+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+syst+biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis.</a> Mol syst biol. 5 (314), 314(2009).</li>
<li>Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+Profiling+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Polysome Profiling Analysis.</a> bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).</li>
<li>Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Sormani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+cadmium+intoxication+in+Arabidopsis+thaliana+impacts+translation+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels.</a> Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).</li>
<li>Lanet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+translational+repression+by+Arabidopsis+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs.</a> Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).</li>
<li>Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rice+cis-Natural+Antisense+RNA+Acts+as+a+Translational+Enhancer+for+Its+Cognate+mRNA+and+Contributes+to+Phosphate+Homeostasis+and+Plant+Fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness.</a> Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIngolia%2C+NT+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).</li>
<li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Het protocol dat we hier presenteren is een eenvoudige en goedkope methode voor het genereren van polysoomprofielen en het isoleren van mRNA's geassocieerd met polysomen, enkele ribosomen of vrij van ribosomen. Een breed scala aan verschillende polysoomfractioneringsmethoden wordt beschreven in de literatuur. De methode die we hier hebben beschreven is geoptimaliseerd om alleen de noodzakelijke verbindingen te behouden en is aangepast voor plantmateriaal. In het bijzonder hebben we de hoeveelheid detergent11 v...

Eiwitsynthese is een essentieel en energetisch kostbaar proces in alle cellen 1. Allereerst moeten cellen energie in de productie van de translatie machinerie, de ribosomen. Bijvoorbeeld een actief delende gistcel produceert zoveel 2000 ribosomen per minuut. Deze productie is maximaal 60% van de totale transcriptionele activiteit en tot 90% van de totale splicing activiteit van de cel 2. Bovendien wordt energie gebruikt voor de synthese van aminozuren, aminoacyl-tRNA en peptidebindingen. In planten, het toevoegen van een aminozuur aan een peptideketen kosten 4,5-5,9 moleculen ATP 3. Daarom is het niet verwonderlijk dat de vertaling van mRNA tot eiwit is een belangrijke plaats van de regelgeving, met name als het gaat om het omgaan met veranderende omgevingsfactoren. De initiatie stap van de vertaling, dat is de vereniging van een mRNA met het ribosoom, is het belangrijkste doelwit van de regulering van devertaling 4. Als gevolg van de regulering van translatie en andere post-transcriptionele regulerende stappen, kan slechts 40% van de variaties in eiwitconcentratie te verklaren door mRNA overvloed 5,6. Zo is de studie van het totale mRNA geeft relatief slechte informatie over eiwit overvloed. Aan de andere kant, de vereniging van mRNA met ribosomen geeft een beter inzicht in eiwit overvloed door het geven van toegang tot die mRNA&#39;s die betrokken zijn bij de vertaling. Actief vertaald mRNA&#39;s geassocieerd met een aantal ribosomen structuren genaamd polysomen. Omgekeerd zal slecht vertaald mRNA&#39;s geassocieerd worden met slechts één ribosoom (monosome). Bijgevolg kan de translationele status van mRNA geëvalueerd door monitoring de associatie met ribosomen 7. Dit protocol beschrijft de isolatie van polysomen zes dagen oud Arabidopsis thaliana zaailingen, de daaropvolgende isolatie van RNA en de analyse van de resultaten. polysomes en monosomes worden gescheiden door een sucrose dichtheidsgradiënt. Verlopen worden verzameld in zes fracties. Enkele fracties worden samengevoegd tot drie goed gescheiden fracties te verkrijgen: polysomen, monosomes en de lichte fractie (hierna supernatant), waarin het vrije 60S en 40S ribosomale subeenheden en mRNA&#39;s die niet zijn gekoppeld aan ribosomen bevat. Global vertaling activiteit kan worden bepaald door het genereren van een polysoom / monosome verhouding die wordt bepaald door integratie van het gebied onder de curve, en door vergelijking van de polysomen profielen. mRNA&#39;s en eiwitten worden geëxtraheerd uit de verschillende fracties en gebruikt voor analyse door RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, microarray, western blot of proteomics. Dit protocol is gevalideerd voor andere planten en weefsels. De voor dit protocol voeren materiaal worden aangetroffen in de meeste laboratoria: Er is geen behoefte aan een gradiënt maker. Bevriezing elke laag voor het toevoegen van het volgende voorkomens uit een mix of verstoring van de lagen. Nr buis piercer wordt gebruikt gradiënt collectie die kan worden bereikt door onderdompeling van een glazen capillaire buis in het verloop. Daarom is de kostbare ultracentrifugebuizen onbeschadigd blijven en kunnen worden hergebruikt vaak. Collectief, dit maakt het huidige protocol een gemakkelijke en goedkope methode voor het polysoomdisplays profilering.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary tube</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima series</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>070534-22</td><td>Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Fraction collector Model 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>UV cuvette</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>Quartz flow-through cuvette</td></tr><tr><td>UV Spectrophotometer</td><td>Varian</td><td>Cary50</td><td>Read every 0.0125 sec</td></tr><tr><td>All chemicals</td><td>Any</td><td></td><td>Use only Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-Free water</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>10083251&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40)</td><td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>Linear acrylamide (acryl carrier)</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>AM9520</td><td>RNA precipitation carrier</td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Analysis software</td></tr></tbody></table>

een eenvoudige methode voor plant polysoomdisplays profiling

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translatie van mRNA naar eiwit is een fundamenteel en sterk gereguleerd biologisch proces. Polysoomprofilering wordt beschouwd als een gouden standaard voor de analyse van translationele regulatie. De hier beschreven methode is een eenvoudige en economische manier om polysomen uit verschillende plantenweefsels te scheiden. Een sucrosegradiënt wordt gemaakt zonder de noodzaak van een gradiëntmaker door elke laag achtereenvolgens te bevriezen. Cytosolische extracten worden vervolgens bereid in een buffer die cycloheximide en chlooramfenicol bevat om de cytosolische en chloroplastische ribosomen op mRNA te immobiliseren en worden op de sucrosegradiënt geladen. Na centrifugatie worden zes fracties direct van de bodem tot de top van de gradiënt verzameld, zonder de ultracentrifugebuis te doorboren. Tijdens het verzamelen wordt de absorptie bij 260 nm continu gemeten om een polysoomprofiel te genereren dat een momentopname geeft van de globale translationele activiteit. Fracties worden vervolgens gepoold om drie verschillende mRNA-populaties te bereiden: de polysomen, mRNA's gebonden aan meerdere ribosomen; de monosomes, mRNA's gebonden aan één ribosoom; en mRNA's die niet aan ribosomen zijn gebonden. mRNA's worden vervolgens geëxtraheerd. Dit protocol is gevalideerd voor verschillende planten en weefsels, waaronder Arabidopsis thaliana zaailingen en volwassen planten, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum en Oryza sativa bladeren.

In de literatuur worden polysoomdisplay profielen vaak blijkt uit de lichte fractie met de zware fractie als gevolg van de manier waarop de gradiënten worden verzameld, dus van boven naar beneden. Omdat in het hier beschreven protocol het verlopen worden verzameld van de bodem naar de top, de profielen tonen we beginnen met de zware fractie (de polysomen) en naar de lichte fractie (vrij ribosoom subeenheden en RNA) (Figuur 2A). Vervolgens hebben we het verzamelen van elk...

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om transcripten uit plantweefsels te extraheren en te fractoneren op basis van het aantal gebonden ribosomen. Het maakt een globale schatting van de translatieactiviteit mogelijk en de bepaling van de translationele status van specifieke mRNA's.

Een eenvoudige methode voor Plant polysoomdisplays Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Hoi, ik ben Cecile. Ik werk bij het LGBP in Marseille. Het protocol dat we in deze video gaan beschrijven, is een eenvoudige methode om polysomen en monosomen te isoleren uit diverse plantenweefsels, om zo mRNA's te identificeren die actief worden vertaald en om de regulatie van de translatie te bestuderen.Als voorbeeld laten we u de isolatie van polysomen uit zes dagen oude Arabidopsis thaliana-zaailingen zien, de daaropvolgende isolatie van RNA en de analyse van de resultaten. Zaai de zaden op een plaat en laat deze twee dagen bij vier graden staan. Laat de planten vervolgens zes dagen groeien.Oogst de zaailingen en maal deze in vloeibare stikstof. Weeg 300 milligram plantenpoeder af en voeg 2,4 milliliter polysoombuffer toe. Centrifugeer om plantfragmenten te verzamelen en breng het supernatant aan bovenop een sucrosegradiënt.Ultracentrifugeer de gradiënt en verzamel deze vervolgens van onder naar boven met een continue meting van de OD. Verdeel de fracties in een polysoomfractie, een monosoomfractie en een supernatante fractie en precipiteer het RNA gedurende de nacht. Ultracentrifugeer, resuspendeer het pellet en extraheer het RNA voor verdere analyse. Bereid de sucrosegradiënt enkele dagen voordat de polysoomprofilering wordt uitgevoerd.Bereid sucrose-oplossingen van 50%, 35% en 20% en bewaar deze bij vier graden. Giet de 50% sucrose-laag in. Vries deze vervolgens in in een vriezer van min 40.Voeg na zes uur de 35%-laag toe en vries deze gedurende de nacht in een vriezer van -40 °C in. Giet de eerste 20%-laag en vries deze in. Haal op de dag van het experiment het benodigde aantal gradiënten uit de vriezer.Voeg de laatste laag van 20% sucrose toe en laat de gradiënten ontdooien in een koelruimte. Bereid het monster voor van de vers geoogste plant. Hier maken we gebruik van zes dagen oude zaailingen van Arabidopsis thaliana.Oogst de in vloeibare stikstof bevroren planten en maal deze grondig. Weeg 300 mg plantenpoeder af. Voeg snel 2,4 ml verse polysoombuffer toe en homogeniseer.Pipetteer de oplossing in twee buisjes van 1,5 milliliter. Centrifugeer het cytosolisch extract. Pipetteer het supernatant.Zorg ervoor dat er geen plantfragmenten achterblijven. Deze zouden het profiel in de volgende stap kunnen verstoren. Breng het supernatant op de sucrosegradiënt aan zonder de gradiënt te verstoren.Plaats de gradiënt in een SW 41 rotorbucket. Centrifugeer. Om het polysoomprofiel te visualiseren en de fractie te verzamelen, gebruiken we een eenvoudig systeem bestaande uit een capillaire buis die in de gradiënt wordt gestoken. Deze is verbonden met een UV-cuvet.Het is zelfverbonden met een peristaltische pomp. Een UV-spectrofotometer registreert continu de OD terwijl de gradiënt door de cuvette stroomt. De fractiecollector maakt het mogelijk om fracties van twee milliliter op te vangen.Reinig de cuvette en plaats deze in de spectrofotometer. Verwijder de gradiënt uit het bakje zonder deze te verstoren. Chlorofyllen moeten geconcentreerd zijn aan de bovenkant van de gradiënt.Steek de capillaire buisjes tot op de bodem van de gradiënt. Start de peristaltische pomp. De gradiënt wordt van onder naar boven opgevangen en de OD wordt continu uitgelezen.Fracties van twee milliliter worden opgevangen. Hier is de vorm van een klassiek profiel. De RNA-precipitatie wordt uitgevoerd met behulp van guanidiniumhydrochloride en isopropanol.Giet eerst één volume guanidiniumhydrochloride in een buis van 50 milliliter en voeg vervolgens de fractie toe. Voeg daarna 1,5 volume isopropanol en 50 microgram courier toe. Precipiteer het RNA gedurende de nacht bij -20 °C.Breng de fracties over in ultracentrifugebuizen van 40 milliliter en balanceer de buis met isopropanol. Centrifugeer. Verwijder het supernatant en laat het pellet aan de lucht drogen. Resuspendeer het pellet in 200 microliters warme TE-buffer.Extraheer het RNA verder door een klassieke fenol-chloroformextractie uit te voeren. Hier wordt een representatief profiel getoond van polysomextracten van zes dagen oude Arabidopsis-zaailingen. De hoofdpiek komt overeen met het monosoom, het mRNA dat geassocieerd is met een enkel ribosoom.Het eerste deel van het profiel komt overeen met de polysomale fracties, namelijk het mRNA dat geassocieerd is met veel ribosomen. Elke piek komt overeen met de associatie van een nieuw ribosoom met het mRNA. Het laatste deel van het profiel komt overeen met de zogenaamde supernatantfractie, die de vrije ribosomale subunits en RNA bevat.Een grote hoeveelheid 60S-subunits vormt een schouder naast de monosoompiek. Om hun integriteit te beoordelen, kunnen de uit de fracties geëxtraheerde RNA's op een klassieke agarosegel worden geladen voordat ze worden gebruikt voor verdere experimenten. Wij hebben dit protocol gebruikt om polysomen te isoleren uit Arabidopsis thaliana-zaailingen, maar ook uit jonge en oude rozetten, alsook uit bladeren van Nicotiana benthamiana, tomaat en rijst, waardoor het effectief zou moeten zijn voor een breed scala aan planten en weefsels.De gezuiverde RNA's zijn geschikt voor microarray-analyse alsmede voor de identificatie van kleine RNA's geassocieerd met polysomale fracties.

an-easy-method-for-plant-polysome-profiling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.

Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Hier beschrijven we een werkwijze veranderingen in de initiatie van mRNA translatie van eukaryote cellen in reactie stresssituaties analyseren. Deze methode is gebaseerd op de snelheid scheiding op sucrosegradiënten vertalen ribosomen van niet-translating ribosomen.

Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Het vermogen van cellen om zich aan stress aan te passen is cruciaal voor hun overleven. Regulatie van mRNA-translatie is een van deze aanpassingsstrategieën, die zorgt voor een snelle regulering van het proteoom. Hier bieden we een gestandaardiseerd polysoomprofileringsprotocol om specifieke mRNA's te identificeren die selectief worden getransleerd onder stressomstandigheden.

Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Het algemene doel van Polysoom profiling techniek is analyse van translationeel activiteiten van individuele mRNAs of transcriptome mRNAs tijdens de eiwitsynthese. De methode is belangrijk voor de studie van eiwit synthese verordening, vertaling activering en onderdrukking in gezondheid en meerdere ziekten bij de mens.

Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) biedt de mogelijkheid om ontwikkelingsprogramma's te ontleden met minimale verwerking van organen en weefsels. Het protocol levert hoogwaardig RNA op uit cellen die zijn gericht op een groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabelde ribosomalsubunit. Downstream analysetools, zoals qRT-PCR of RNA-seq, onthullen weefsel- en celtypespecifieke expressieprofielen.

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.

Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering

Dit protocol beschrijft hoe u een polysoomprofiel kunt genereren zonder gebruik te maken van geautomatiseerde gradiëntmakers of gradiëntfractioneringssystemen.

Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Dit protocol beschrijft een methode voor eukaryote polysoomzuivering van intacte sojabonenknobbels. Na sequencing kunnen standaardpijplijnen voor genexpressieanalyse worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen op transcriptoom- en translatoomniveau te identificeren.

Polysoom zuivering van sojabonen symbiotische knobbeltjes

Het hier gepresenteerde protocol omvat polysomale profilering om translatom, mRNA's geassocieerd met ribosomen, te isoleren in niet-polysomale en polysomale RNA's van Arabidopsis door middel van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode toont de translatie-efficiëntie van hitte-gestreste Arabidopsis.

Translatie-efficiëntietest met behulp van polysoomprofielen onder hittestress

Leer een eenvoudige methode voor polysoomprofiling in planten om actief vertaalde mRNA's te identificeren met Arabidopsis thaliana. Dit protocol helpt onderzoekers bij het bestuderen van translatie regulatie in plantaardige weefsels.

Een eenvoudige methode voor Plant polysoomdisplays Profiling

Meer video's verkennen