Een eenvoudige methode voor Plant polysoomdisplays Profiling
28 augustus 2016
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om transcripten uit plantweefsels te extraheren en te fractoneren op basis van het aantal gebonden ribosomen. Het maakt een globale schatting van de translatieactiviteit mogelijk en de bepaling van de translationele status van specifieke mRNA's.
Hoi, ik ben Cecile. Ik werk bij het LGBP in Marseille. Het protocol dat we in deze video gaan beschrijven, is een eenvoudige methode om polysomen en monosomen te isoleren uit diverse plantenweefsels, om zo mRNA's te identificeren die actief worden vertaald en om de regulatie van de translatie te bestuderen.
Als voorbeeld laten we u de isolatie van polysomen uit zes dagen oude Arabidopsis thaliana-zaailingen zien, de daaropvolgende isolatie van RNA en de analyse van de resultaten. Zaai de zaden op een plaat en laat deze twee dagen bij vier graden staan. Laat de planten vervolgens zes dagen groeien.
Oogst de zaailingen en maal deze in vloeibare stikstof. Weeg 300 milligram plantenpoeder af en voeg 2,4 milliliter polysoombuffer toe. Centrifugeer om plantfragmenten te verzamelen en breng het supernatant aan bovenop een sucrosegradiënt.
Ultracentrifugeer de gradiënt en verzamel deze vervolgens van onder naar boven met een continue meting van de OD. Verdeel de fracties in een polysoomfractie, een monosoomfractie en een supernatante fractie en precipiteer het RNA gedurende de nacht. Ultracentrifugeer, resuspendeer het pellet en extraheer het RNA voor verdere analyse. Bereid de sucrosegradiënt enkele dagen voordat de polysoomprofilering wordt uitgevoerd.
Bereid sucrose-oplossingen van 50%, 35% en 20% en bewaar deze bij vier graden. Giet de 50% sucrose-laag in. Vries deze vervolgens in in een vriezer van min 40.
Voeg na zes uur de 35%-laag toe en vries deze gedurende de nacht in een vriezer van -40 °C in. Giet de eerste 20%-laag en vries deze in. Haal op de dag van het experiment het benodigde aantal gradiënten uit de vriezer.
Voeg de laatste laag van 20% sucrose toe en laat de gradiënten ontdooien in een koelruimte. Bereid het monster voor van de vers geoogste plant. Hier maken we gebruik van zes dagen oude zaailingen van Arabidopsis thaliana.
Oogst de in vloeibare stikstof bevroren planten en maal deze grondig. Weeg 300 mg plantenpoeder af. Voeg snel 2,4 ml verse polysoombuffer toe en homogeniseer.
Pipetteer de oplossing in twee buisjes van 1,5 milliliter. Centrifugeer het cytosolisch extract. Pipetteer het supernatant.
Zorg ervoor dat er geen plantfragmenten achterblijven. Deze zouden het profiel in de volgende stap kunnen verstoren. Breng het supernatant op de sucrosegradiënt aan zonder de gradiënt te verstoren.
Plaats de gradiënt in een SW 41 rotorbucket. Centrifugeer. Om het polysoomprofiel te visualiseren en de fractie te verzamelen, gebruiken we een eenvoudig systeem bestaande uit een capillaire buis die in de gradiënt wordt gestoken. Deze is verbonden met een UV-cuvet.
Het is zelfverbonden met een peristaltische pomp. Een UV-spectrofotometer registreert continu de OD terwijl de gradiënt door de cuvette stroomt. De fractiecollector maakt het mogelijk om fracties van twee milliliter op te vangen.
Reinig de cuvette en plaats deze in de spectrofotometer. Verwijder de gradiënt uit het bakje zonder deze te verstoren. Chlorofyllen moeten geconcentreerd zijn aan de bovenkant van de gradiënt.
Steek de capillaire buisjes tot op de bodem van de gradiënt. Start de peristaltische pomp. De gradiënt wordt van onder naar boven opgevangen en de OD wordt continu uitgelezen.
Fracties van twee milliliter worden opgevangen. Hier is de vorm van een klassiek profiel. De RNA-precipitatie wordt uitgevoerd met behulp van guanidiniumhydrochloride en isopropanol.
Giet eerst één volume guanidiniumhydrochloride in een buis van 50 milliliter en voeg vervolgens de fractie toe. Voeg daarna 1,5 volume isopropanol en 50 microgram courier toe. Precipiteer het RNA gedurende de nacht bij -20 °C.
Breng de fracties over in ultracentrifugebuizen van 40 milliliter en balanceer de buis met isopropanol. Centrifugeer. Verwijder het supernatant en laat het pellet aan de lucht drogen. Resuspendeer het pellet in 200 microliters warme TE-buffer.
Extraheer het RNA verder door een klassieke fenol-chloroformextractie uit te voeren. Hier wordt een representatief profiel getoond van polysomextracten van zes dagen oude Arabidopsis-zaailingen. De hoofdpiek komt overeen met het monosoom, het mRNA dat geassocieerd is met een enkel ribosoom.
Het eerste deel van het profiel komt overeen met de polysomale fracties, namelijk het mRNA dat geassocieerd is met veel ribosomen. Elke piek komt overeen met de associatie van een nieuw ribosoom met het mRNA. Het laatste deel van het profiel komt overeen met de zogenaamde supernatantfractie, die de vrije ribosomale subunits en RNA bevat.
Een grote hoeveelheid 60S-subunits vormt een schouder naast de monosoompiek. Om hun integriteit te beoordelen, kunnen de uit de fracties geëxtraheerde RNA's op een klassieke agarosegel worden geladen voordat ze worden gebruikt voor verdere experimenten. Wij hebben dit protocol gebruikt om polysomen te isoleren uit Arabidopsis thaliana-zaailingen, maar ook uit jonge en oude rozetten, alsook uit bladeren van Nicotiana benthamiana, tomaat en rijst, waardoor het effectief zou moeten zijn voor een breed scala aan planten en weefsels.
De gezuiverde RNA's zijn geschikt voor microarray-analyse alsmede voor de identificatie van kleine RNA's geassocieerd met polysomale fracties.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om polysomen en monosomen te isoleren uit plantenweefsels, wat de identificatie van actief vertaalde mRNA's en de studie van translatie-regulatie mogelijk maakt. Het gegeven voorbeeld richt zich op de isolatie van polysomen uit zes dagen oude Arabidopsis thaliana-kiemplanten.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantbiologie
- Translatieregulatie
- mRNA-analyse
Achtergrond
- Het begrijpen van de translatieactiviteit is cruciaal voor het bestuderen van genexpressie.
- Polysomen zijn clusters van ribosomen die mRNA vertalen, terwijl monosomen enkelvoudige ribosomen zijn.
- Deze methode biedt inzicht in de translationele status van specifieke mRNA's.
- Arabidopsis thaliana dient als modelorganisme in plantonderzoek.
Doel van de studie
- Om polysomen en monosomen uit plantenweefsels te isoleren.
- Om mRNAs te identificeren die actief worden vertaald.
- Om de regulatie van translatie in planten te bestuderen.
Gebruikte methoden
- Zaden op platen zaaien en twee dagen koud stratificeren.
- Zaailingen zes dagen lang onder optimale omstandigheden laten groeien.
- Polysomen en monosomen isoleren uit de plantenweefsels.
- RNA analyseren om de translatieactiviteit te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van polysomen uit Arabidopsis thaliana-zaailingen.
- Identificatie van actief vertaalde mRNA's.
- Inzichten in de regulatie van translatie in plantenweefsels.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode voor het bestuderen van translatie.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van translatie in planten.
- Het vergroot het inzicht in de regulatie van genexpressie.
- De aanpak kan worden toegepast op diverse plantensoorten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Polysoomprofilering biedt een direct overzicht van de translationele activiteit, wat mechanische risicoreductie van doelwit-hypothesen mogelijk maakt bij biofarmaceutische ontdekkingen op basis van planten. Door actief vertaalde mRNA-pools te onderscheiden, ondersteunt deze methode doelwitvalidatie en fenotypische screening in landbouwkundig relevante systemen. Deze benadering verhoogt het voorspellend vertrouwen bij het prioriteren van leads voor gewasverbetering of toepassingen in molecular farming.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door mRNA-overvloed te koppelen aan translationele output.
- Operationele waarde: Verduidelijkt pathway-activiteit via metrieken voor ribosoombinding.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door targets te identificeren met aanhoudende translationele binding.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op compoundscreening in plantexpressieplatforms.
- Operationele waarde: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via kwantitatieve OD260-profilering en reproduceerbaarheid van fracties.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform in weefsels van Arabidopsis, Nicotiana, tomaat en rijst.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt targetvalidatie in de ontdekkingsfase met preklinische biomarkerbeoordeling in plantensystemen.
- Mechanische risicoreductie: Richt zich op de voorspellende waarde door mRNA-populaties te isoleren die zijn gedefinieerd door de ribosoombelasting.
- Ziekterellevant systeem: Toepasbaar op gewasmodellen die worden gebruikt in molecular farming en biofarmaceutische productie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows, waarbij zij hypothesetoetsing ondersteunt voorafgaand aan lead-identificatie en translationele continuïteit mogelijk maakt naar preklinische evaluatie in systemen op plantbasis.
- Ontdekkingsbiologie: Test de interactie met het doelwit door verschuivingen in polysoom/monosoom-ratio's onder experimentele omstandigheden te meten.
- Screening: Levert ribosome-profiling resultaten die helpen bij het vergelijken van de effecten van verbindingen of genetische perturbaties.
- Analytica: Genereert kwantitatieve OD260-curven en gefractioneerde RNA-opbrengsten voor vergelijkende analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij de ontdekking van biomarkers in pipelines voor moleculaire plantenteelt.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een fractioneringscapaciteit die toepasbaar is op diverse planteweefsels en soorten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door translationele toestanden van doel-mRNA's vast te stellen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde sucrosegradiënt-fractionering en continue OD-monitoring.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door direct bewijs te leveren van doelmodulatie op translationeel niveau.
- Portfolio-impact: Maakt risicogebaseerde prioritering mogelijk op basis van gegevens over translationele activiteit.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de behandeling van plantenweefsel en de bereiding van polysomenbuffer.
- Is afhankelijk van ultracentrifugatieapparatuur en fractieverzamelsystemen met UV-monitoring.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de bereiding van gradiënten en protocollen voor het poolen van fracties.
- Houdt rekening met aanpassingen bij uitbreiding naar niet-modelplantensystemen.
- Houdt rekening met praktische beperkingen met betrekking tot de RNA-integriteit tijdens de fractionerings- en extractiestappen.
