Genoom-brede Zuivering van extrachromosomale circulaire DNA van eukaryote cellen

Genoombrede zuivering van extracromosomaal circulair DNA uit eukaryote cellen. Hallo, ik ben Rasmus. Hier zal ik de volledige outline presenteren voor de methode voor de zuivering van circulair DNA.

In het eerste deel worden gistcellen gekweekt en geoogst. Vervolgens wordt circulair DNA gezuiverd en in drie stappen geamplificeerd. Ten eerste via kolomscheiding, waarbij DNA-cirkels worden gezuiverd en verrijkt.

Vervolgens wordt het DNA behandeld met exonuclease om al het resterende lineaire DNA te verteren, en tot slot worden de DNA-cirkels geamplificeerd met behulp van het phi-29 polymerase. In het vijfde deel van dit protocol worden de DNA-cirkels gesequenced en worden de reads gemapt op het referentiegenoom van Saccharomyces cerevisiae. Aan het einde van deze video tonen we enkele representatieve resultaten.

We zullen de perspectieven voor toekomstige studies en de voordelen van het gebruik van deze methode bespreken. Deel één, celoogst. De startcultuur wordt gekweekt bij 30 °C met agitatie tot de maximale dichtheid, die ongeveer 200 miljoen cellen per milliliter bedraagt en na 24 tot 48 uur wordt bereikt.

De uitgegroeide cultuur wordt overgebracht naar een Falcon-buis en door centrifugatie gedurende drie minuten neergeslagen. De supernatant wordt verwijderd. De grote pellet wordt gevortexd in TE-buffer en opnieuw neergeslagen door centrifugatie.

Deel twee, kolomzuivering. In deze stap maken we gebruik van een commercieel verkrijgbare kit voor kolomzuivering waarmee zeer zuivere plasmiden uit genomisch bacterieel DNA worden verkregen. Voordat deze kit bij gist kan worden gebruikt, moet de celwand worden afgebroken.

Dit wordt gedaan door de gewassen celpellet opnieuw op te lossen in L-1 buffer uit de kit. De celsuspensie wordt overgebracht naar een microcentrifugebuisje en er worden glasparels toegevoegd tot een derde van het totale volume. Het monster wordt 10 minuten op maximale snelheid gevortexd en de parels worden verwijderd door centrifugatie bij 2.000 toerentallen per minuut gedurende 30 seconden.

De supernatant wordt overgebracht naar een nieuwe buis. Bij deze methode voegen we sterk verdunde plasmiden toe aan de supernatant in drie verschillende verhoudingen. Wij stellen voor om sterk verdund plasmide aan de cyclus toe te voegen.

Dit kan dienen als interne referentiegidsen. U kunt dit gebruiken om de kwaliteitscontrole van uw DNA-zuivering en -amplificatie uit te voeren; daarnaast kunt u met behulp van deze spike-in-plasmiden een semi-kwantitatieve schatting maken van de niet-circulaire DNA's per cel. Voeg alleen sterk verdunde plasmiden toe, aangezien deze de sequentieresolutie van andere circulaire DNA's kunnen beïnvloeden.

De celsuspensie die gespikete plasmiden bevat, wordt behandeld met L-2-oplossing uit de kit en het kitprotocol wordt gevolgd. Na het laden van de kolom worden eiwitten, lipiden en chromosomaal DNA verwijderd door de kolom tweemaal te wassen. Extrachromosomaal circulair DNA is sterk verrijkt in de elueerfractie.

Deel drie, lineaire DNA-digestie. In deze stap gebruiken we een exonuclease om het resterende lineaire DNA te verteren. Een ATP-afhankelijk exonuclease richt zich specifiek op lineair dubbelstrengs en enkelstrengs DNA zonder circulair DNA te verteren.

De specificiteit van de exonuclease voor lineair DNA werd bevestigd door gelelektroforese na 29 uur DNase-behandeling. De resultaten tonen aan dat genomisch DNA wordt verteerd, terwijl plasmid-DNA intact blijft, zoals aangegeven door de rode pijl. Gist bevat 16 chromosomen met een lengte tot 1.500 kilobasen.

Om de exonucleasevertering te vergemakkelijken, wordt een zeldzame knippende endonuclease gebruikt om een groter aantal toegankelijke DNA-uiteinden te verkrijgen. Bij gebruik van het restrictie-enzym NotI wordt elk chromosoom tot zeven keer gesplitst, zoals aangegeven. Kolomgezuiverd DNA wordt gedurende één nacht behandeld met NotI bij 37 °C in een warmteblok.

Na hitte-inactivatie van NotI wordt het geknipt DNA behandeld met exonucleasen bij 37 °C volgens het protocol van de fabrikant. Na de exonucleasebehandeling worden de enzymen hitte-geïnactiveerd bij 70 °C gedurende 30 minuten. Het kan enkele dagen duren om al het lineaire chromosomale DNA te verteren door toevoeging van ATP en exonuclease. Om er zeker van te zijn dat al het lineaire DNA volledig is verteerd, worden de monsters geanalyseerd met PCR- of qPCR-methoden met gebruik van een intern referentiegen zoals ACTI.

Deel vier, amplificatie van DNA. In deze stap verrijken en amplificeren we circulair DNA met behulp van het phi-29 polymerase. De reactie vindt plaats bij 30 °C met behulp van random hexameer oligonucleotiden en phi-29.

De polymerase heeft een hoge getrouwheid en proofreading-activiteit, wat een onbevooroordeelde DNA-amplificatie garandeert. Elke polymerase kan via rolling circle-replicatie tot 100 kilobases aan DNA synthetiseren. De polymerase is bovendien zeer procesief en amplificeert DNA tot 10^9 keer.

Deel vijf, sequenering. Volgend op het protocol voor een high-throughput next-generation sequencing-platform, wordt het DNA gesoniceerd tot een gemiddelde grootte van 300 baseparen en gesequeneerd als 141 nucleotide single-end reads. De sequentie-reads worden gekoppeld aan het referentiegenoom van Saccharomyces cerevisiae met behulp van de gratis Galaxy-database.

Gesequentieerde gegevens worden geüpload naar Galaxy en reads worden in kaart gebracht met behulp van de short read aligner Bowtie2, die mapping van partiële reads mogelijk maakt. Deel zes, representatieve resultaten. Na sequencing en mapping naar het referentiegenoom van Saccharomyces cerevisiae kunnen de reads worden gevisualiseerd in de genome browser binnen de Galaxy-software.

DNA van circulaire oorsprong kan bijvoorbeeld worden geteld als regio's die coherente reads bevatten van meer dan één kilobase, zoals op het scherm wordt aangegeven. Een voorbeeld van een regio op chromosoom vier die coherente reads bevat die meer dan één kilobase beslaan, is de regio met de hexose-transportergenen zes en zeven. Wanneer deze methode wordt toegepast op een populatie gistcellen, worden er vaak gemapte reads op deze locus gevonden en suggereert de read-dekking duidelijk dat er een DNA-cirkel is gevormd tussen paraloge hexose-transportergenen.

Vanwege de hoge sequentiehomologie tussen de hexose-transportergenen stellen wij voor dat illegitieme homologe recombinatie leidt tot circularisatie van dit DNA. In het model voor circulair DNA treedt een mutatie op wanneer het DNA-reparatieproces onvolledig of incorrect verloopt. Als er bijvoorbeeld een dubbelstrengse breuk optreedt in een repetitief element, kan de homologe sequentie op dezelfde chromatide als template worden gebruikt voor DNA-reparatie via homologe recombinatie.

Na resectie, strenginvasie, DNA-synthese en resolutie van alle knopen kan een DNA-cirkel uit het genoom worden uitgestoten, wat leidt tot een DNA-deletie op het chromosoom. De effecten van het behandelen van DNA met exonucleasen en phi-29 polymerase kunnen worden gevisualiseerd met behulp van propidiumjodide-kleuring. Kleuringscontroles van genomisch DNA zien eruit zoals in de linker afbeelding, terwijl plasmid-DNA eruitziet zoals in de rechter afbeelding.

Na 29 uur exonucleasebehandeling van 400 nanogram genomisch DNA is het grootste deel van het DNA verteerd, zoals aangegeven in de linker afbeelding. Dit resultaat wordt bevestigd door gelelektroforese, zoals te zien is op de gel-afbeelding rechts. Na 72 uur exonucleasebehandeling, gevolgd door DA-synthese door het phi-29 polymerase, kunnen nog steeds miljoenen kopieën van DNA worden geïdentificeerd.

Hetzelfde geldt voor de behandeling van 400 nanogram genomisch DNA met exonuclease gedurende 29 uur, samen met een extra 100 nanogram plasmid DNA; het grootste deel van het genomisch DNA is dan verteerd. Echter is het plasmid DNA niet verteerd, zoals blijkt uit de gelafbeelding. Na behandeling van het gedurende 72 uur met exonuclease behandelde monster met phi-29 polymerase, verschijnt het grootste deel van het geamplificeerde DNA als gekleurde plasmiden.

We hebben dus eerst genen gescreend op circulair DNA en waren zeer verrast om honderden verschillende typen DNA-monsters te vinden. Ja, het was werkelijk verrassend om te ontdekken hoe algemeen DNA-cirkels voorkomen in de gistpopulatie, en we geloven dat deze methode voor vele soorten studies kan worden gebruikt. Een voor de hand liggende toepassing zou zijn om menselijk weefsel te onderzoeken.

We weten dat genen kunnen worden geamplificeerd op acirculaire elementen en natuurlijk in gist, en zelfs in tumorcellen. Ik denk dat het in het algemeen interessant zal zijn om somatische cellen te bekijken en te onderzoeken welk type circulair DNA we daar zullen vinden en hoe we dit effect kunnen beïnvloeden. Circularisatie. In verouderende cellen hebben we cirkels die zich ophopen naarmate we ouder worden, en we verwachten dat er meer genen op circulair DNA worden aangetroffen.

Daarnaast willen we graag kijken naar de moleculaire mechanismen van DNA-circularisatie, en het is een voor de hand liggende stap om naar gist te kijken, waar we mutanten hebben die defect zijn in homologe recombinatie en niet-homologe recombinatie. Bij het bestuderen van deze mutanten verwachten we dat het DNA-circularisatieprofiel verschilt tussen de verschillende typen mutanten en we hopen dat we door giststudies veel meer te weten kunnen komen over DNA-circularisatie. Vergeleken met andere methoden is deze methode veel gevoeliger. Het zou mogelijk zijn om DNA-cirkels te vinden in ongeveer één op de 10.000 cellen.

En voor zover ik weet uit studies uit het uitgebreid uitgevoerde onderzoek, moeten mutante allelen normaal gesproken een aandeel van 1 tot 10% van de populatie bereiken voordat ze gedetecteerd kunnen worden. Klopt, en met deze techniek hoef je geen voorkennis te hebben van de gevormde DNA-cirkels, in tegenstelling tot technieken waarbij de DNA-cirkels enigszins gebonden moeten zijn om ze vervolgens eenvoudig te kunnen detecteren als amplificaties via sequencing of via chromosoomkleuring.

Ja, dus ik denk dat het belangrijkste voordeel echt de gevoeligheid is en ik hoop dat we met deze methode veel interessante dingen kunnen doen.