Name: Voorbereiding van de Single-cohort Colonies and Hormoon Behandeling van werkbijen Analyseer Physiology geassocieerd met Rol en / of endocriene systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer hoe je single-cohort kolonies van honingbijen voorbereidt en behandelt met juveniel hormoon en ecdysone. Deze methode analyseert de fysiologie van werkbijen in relatie tot hun rol en endocriene systeem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek (B) en een Grant-in Aid voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden 'Systems Molecular Ethology' van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT) van Japan. T.U. was de ontvanger van een Grant-Aid van de Japan Society for the Promotion of Science voor jonge wetenschappers.

1. Voorbereiding van de Single-cohort Colonies <ol><li> Bereid drie honingbijenkolonies twee enkele-cohort kolonies maken en een voldoende aantal nieuw ontstaan ​​werknemers verkrijgen. <ol><li> Controleer dat sommige poppen in de bedekte perifere cellen in de raten hebben bruine ogen en een gepigmenteerde cuticula door het openen van de afgedekte kammen met een pincet. Als deze poppen aanwezig in perifere cellen kam meeste poppen in heel raten zullen ontstaan ​​in ongeveer 1-3 dagen. </li><li> Vervolgens, het verzamelen van de kammen die deze poppen na alle aanhangend volwassen bijen zijn verwijderd met een borstel, en meng kammen van de drie kolonies aan variatie tussen kolonies te minimaliseren. </li></ol></li><li> Plaats de verzamelde raten in een lege korf doos en incubeer bij 33 ° C onder vochtige omstandigheden (&gt; 60% relatieve vochtigheid). Verzamel ongeveer 6.000 nieuw opgedoken werknemers over 3 dagen (3.000 werknemers per kolonie) uit de verzamelde kammen. </li><li> Bepaal de hoeveelheid workers gebaseerd op het gewicht van vijf nieuw opgedoken werknemers willekeurig vanuit ongemanipuleerd kolonies. <ol><li> Weeg vijf nieuw opgedoken werknemers willekeurig verzameld van ongemanipuleerde kolonies met behulp van een gewicht van machines. Let op: Het gewicht van vijf nieuw opgedoken werknemers is over het algemeen 500-600 mg. </li><li> Schatting van de hoeveelheid verzamelde werknemers door het gewicht van de verzamelde werknemers te delen door het gemiddelde gewicht van vijf nieuw opgedoken werknemers. </li></ol></li><li> Solliciteer verf markeringen aan de thoraces van ongeveer 1.800 werknemers (900 werknemers per kolonie) met behulp van watergedragen plakkaatverf markers. Noot: wasbaar marker die wordt gebruikt om de verf aan te brengen wordt in de Tabel Materials. </li><li> Introduceer een koningin en ongeveer 3.000 van de 0-2 dagen oude werknemers naar een nieuwe bijenkorf doos die twee kammen, één kam met honing en stuifmeel als conserven en een andere lege kam voor leg door de koningin bevat. Verzamel de kam met honing en stuifmeel frOM ander ongemanipuleerde kolonie na alle aanhangend bijen worden verwijderd. Opmerking: Het gebruik van nucleaire bijenkorf doos (klein formaat bijenkorf doos) wordt aanbevolen. </li><li> Verzamel verpleegkundige bijen en vroegrijpe voedermachines met verf markeringen 6-8 dagen na het maken van single-cohort kolonies. <ol><li> Voor het verzamelen van bijen verpleegster, halen de werknemers dat hun hoofd gestoken in kam cellen om zorg te dragen voor het broed. Gebruik een pincet om de verpleegkundige bijen te verzamelen van kammen dat veel broed en volwassen werknemers bevatten. Let op: Als HPGs van de verzamelde werknemers worden ontwikkeld wanneer ontleed zoals beschreven in stap 1.7, zijn deze werknemers gedefinieerd als verpleegkundige bijen. Houd de thoraces door pincet wordt geadviseerd op te pikken werknemers uit de raten. </li><li> Om verzamelaars verzamelen, gebruiken een insect net voor de werknemers die terugkeren naar hun korven met stuifmeel lasten op hun achterpoten vast te leggen. Let op: Als HPGs van gevangen werknemers verschijnen gekrompen wanneer ontleed zoals beschreven in stap 1.7, worden die werknemers gedefinieerd als verzamelaars. </li></ol></li><li> CLASSify de HPG in drie groepen, &#39;ontwikkelde&#39;, &#39;Intermediate&#39; en &#39;gekrompen&#39; van de dissectie onder een stereomicroscoop. <ol><li> Verdoven 10-15 bijen in een insect kooi in een koelkast voor 10-15 minuten totdat de bijen kunnen niet vliegen of lopen. Beweeg dan bijen op ijs en vul de narcose op ijs gedurende 5 minuten. Opmerking: Het duurt ongeveer 15-20 minuten in totaal om anesthesie te bereiken. Als de anesthesie tijd moet worden verkort, dient het aantal bijen in een kooi verlaagd tot 1-3 bijen per kooi. </li><li> Ontleden het hoofd uit het lichaam met een schaar en pincet. Bevestig het hoofd op tandheelkundige wax geplaatst op een petrischaal met pinnen. Plaats twee pennen in de bases van de antennes aan het hoofd te bevestigen. Genieten vaste koppen in insectencellen zoutoplossing (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2). </li><li> Verwijder het anteriore gedeelte van de cuticula van de kop met fijne pincet en een chirurgisch mes onder een binoculaire microscoop. Opmerking: De HPGs kan gemakkelijk gevonden worden in de kop na verwijdering van cuticle. De HPG is een botryoid orgaan dat bestaat rond de hersenen in de weg. </li><li> Verwijder de tracheale weefsel dat is een witte membraneuze weefsel onder de nagelriem. Vervolgens ontleden de HPGs van het hoofd door ze langzaam te trekken met een pincet. </li><li> Classificeren HPGs met grote en ronde acini als &#39;ontwikkelde&#39;. Classificeren HPGs met kleine en verwrongen acini als &#39;gekrompen&#39;. Classificeren HPGs overeenkomt met geen van beide &#39;ontwikkelde&#39; noch &#39;gekrompen&#39; als &#39;Intermediate&#39;. Opmerking: Representatieve foto&#39;s die tonen deze drie klassen HPG toestanden zijn in figuur 2. </li><li> Subject &#39;ontwikkelde&#39; en &#39;gekrompen&#39; HPGs om RNA-extractie als &#39;nurse bee HPGs&#39; en &#39;forager HPGs&#39;, respectievelijk, en vergelijk genexpressie in de HPGs tussen verpleegkundige bijen en voedermachines (deel 4). </li></ol></li></ol> 2. Injectie van 20E <ol><li> Verzamel verpleegkundige bijen van de typische kolonies als descrIBED in de procedure 1.6.1. Opmerking: HPGs kan niet in deze bijen worden onderzocht als de bijen worden gehouden. </li><li> Verdoven de bijen bij 4 ° C in de koelkast (niet op ijs). Opmerking: Het duurt ongeveer 30 minuten naar de anesthesie te bereiken. Als de anesthesie wordt verkort, dient het aantal bijen in de kooi verlaagd tot 1-3 bijen per kooi. </li><li> Met behulp van een pincet, immobiliseren de bijen op tandheelkundige wax geplaatst op een petrischaal. </li><li> Injecteer 1 ul van 20E-oplossing in de voorste aspect van het hoofd met behulp van een injectie tip gemaakt van een gekalibreerde capillaire micropipet met een glazen naald trekker. <ol><li> Los op in ethanol 20E-insecten zoutoplossing (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2) mengsel (1: 4) bij 2,5 ug / ul. </li><li> Sluit de injectie tip om een ​​rubberen slang, en sluit een gele micropipet tip naar de andere kant van de buis. </li><li> Plaats 1 pl 20E-oplossing op parafilm met behulp van een micropipet, houdt u de gele micropipet tip in de mond, eend de oplossing in de injectie tip te trekken. </li><li> Steek de injectie tip in de basis van de antennes, en injecteer de oplossing door te blazen door de gele micropipet tip. Opmerking: De in deze stap protocol is de representatieve injectiemethode, maar het gebruik van de injectiemachine wordt aanbevolen om veiligheidsredenen noodzakelijk 20. </li></ol></li><li> Achter de geïnjecteerde bijen in insectencellen kooien bij 33-36 ° C (de ideale temperatuur is 35 ° C) onder donkere en vochtige omstandigheden (&gt; 60% relatieve vochtigheid) gedurende 1 of 3 dagen. Supply honing-watermengsel (1: 1) aan de bijen. Indien nodig, tel overleven bijen na de injectie. </li></ol> 3. De toepassing van Methoprene <ol><li> Verzamel de kammen die poppen van de typische kolonies bevatten nadat alle aanhangend volwassen bijen worden verwijderd met een borstel. Incubeer de kammen van 33-36 ° C (de ideale temperatuur is 35 ° C) in vochtige omgevingen (&gt; 60% relatieve vochtigheid) gedurende 1 dag. </li><li&gt; Verzamel nieuw opgedoken bijen uit de verzamelde kammen en verf markeringen toepassen op hun thoraces behulp plakkaatverf, zoals beschreven in het protocol voor het bereiden van single-cohort kolonies. Zet de gemarkeerde bijen aan hun kolonies. </li><li> Na 6 dagen, het verzamelen van geschilderde werknemers (6 dagen oud) uit de koloniën. Pick-up geschilderd werknemers uit de raten door die hun thoraces met een pincet. </li><li> Verdoven de bijen bij 4 ° C in de koelkast (niet op ijs) volgens de procedure 2,2. Met een pincet, het immobiliseren bijen op dentale was geplaatst op een petrischaaltje toepassing 1-5 pl methopreen oplossing (50-250 ug / ul) opgelost in aceton om het hoofd met een micropipet. Gebruik een filter tip die bestand is tegen aceton. Opmerking: Aceton kan de schadelijke effecten op bijen die leidt tot de dood. Als de hoge bijensterfte waargenomen, wordt de reductie van het volume aceton op 1 ul van de minimaal aanbevolen. </li><li> Achter de bijen in insectencellen kooien bij 33-36 ° C (de ideale temperature is 35 ° C) gedurende 7 dagen onder donkere en vochtige omstandigheden (&gt; 60% relatieve vochtigheid). Supply honing-watermengsel (1: 1) aan de bijen. Indien nodig, tel overleven bijen na lokale applicatie. Opmerking: In dit artikel overleven bijen geteld 7 dagen na het aanbrengen (tabel 3). </li></ol> 4. RNA-extractie en kwantitatieve RT-PCR <ol><li> Verdoven bijen en ontleden HPGs zoals beschreven in de stappen 1.7.1 tot en met 1.7.4. </li><li> Verzamel de HPGs ontleed in een microcentrifuge buis op droogijs en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Voeg 400 ul van het serum van eiwitdenaturatie. Opmerking: Dit reagens is in de handel verkrijgbaar (zie de tabel van de Materials). </li><li> Homogeniseer de HPG weefsels met behulp van een draagbare elektrische mixer met een homogenisatie stamper die past in een microcentrifugebuis. Gehomogeniseerd bij een rotatiesnelheid van 300 rpm gedurende ongeveer 1 min op ijs te breken en lyseren weefselcellen. tabel van de Materials). </li><li> Voeg 80 ul chloroform en meng goed. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer de microcentrifuge buizen bij 14.170 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Breng de waterige fase naar een nieuwe buis. Voeg een gelijk volume isopropanol en 1 ui glycogeen (5 mg / ml). Incuberen bij -20 ° C gedurende ten minste 20 min. </li><li> Centrifugeer de microcentrifuge buizen bij 14.170 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. </li><li> Voeg 400 pl 75% ethanol aan de pellet en meng gecentrifugeerd microcentrifugebuizen bij 14.170 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. Herhaal deze procedures nog eens. </li><li> Air-droog de pellet gedurende 5-10 min en dan oplossen in 10 pi RNase-vrij water. Opmerking: de volledige drogen van de pellet kan onoplosbaarheid van het RNA pellet veroorzaken in het water. Dus de pellet die enigszins vochtig is geschikt vooroplossen. </li><li> Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer zoals NanoDrop of dergelijke. </li><li> Behandel 500 ng totaal RNA met 2,0 U DNase I incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten om verontreinigend genomisch DNA afbreken. </li><li> Reverse-transcriberen 200 ng DNase I behandelde RNA en voert real time PCR met behulp van commercieel verkrijgbare kits (zie de lijst in de tabel van Materialen en reagentia) en genspecifieke primers (mrjp2, 5&#39;-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 &#39;en 5 &#39;-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3&#39;, Hbg3, 5&#39;-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 &#39;en 5&#39;-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3&#39;). Voer de PCR als volgt: [95 ° C x 30 seconden + (95 ° C x 5 seconden + 60 ° C x 15 seconden + 72 ° C x 20 seconden) x 45-55 cycli]. </li><li> Normaliseren van de hoeveelheid transcript met die van elongatie factor 1α-F2 (EF1α˗F2) of ribosomaal eiwit 49 (rp49) 9,16,21,22. Deze genen zijn betrouwbaar controle genes voor het analyseren van genexpressie in de HPGs behulp qRT-PCR. </li><li> Voer tweezijdige t-test om de significante verschillen tussen de twee groepen experiment (verpleegkundige bijen vs. vroegrijpe voedermachines,-20E behandelde bijen versus controle bijen en-methopreen behandeld bijen versus controle bijen) met behulp van statistische software te detecteren. Opmerking: Als F-toets neemt de homogeniteit van variantie, kan t-toets gebruikt. Zo niet, dan kan Welch t-test worden gebruikt. </li></ol>

<ol><li>Wilson, E. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+EO+%22The+insect+societies%22">The insect societies</a>. , Harvard university press. (1971).</li>
<li>Winston, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+ML+%22The+biology+of+the+honey+bee%22">The biology of the honey bee</a>. , Harvard university press. (1987).</li>
<li>Lindauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ein+Beitrag+zur+Frage+der+Arbeitsteilung+im+Bienenstaat%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+vergleichende+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat.</a> Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).</li>
<li>Sakagami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+uber+die+Arbeitsteilung+in+einen+Zwergvolk+der+Honigbienen.+Beitrage+zur+Biologie+des+Bienenvolkes%2C+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Jap+J+Zool%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L.</a> I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).</li>
<li>Kubo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+the+expression+of+hypopharyngeal-gland+proteins+of+the+worker+honeybees+%28Apis+mellifera+L.%29+with+age+and%2For+role%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role.</a> J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).</li>
<li>Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+the+mode+of+gene+expression+of+the+hypopharyngeal+gland+cells+with+an+age-dependent+role+change+of+the+worker+honeybee+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L.</a> Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).</li>
<li>Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+amylase+and+glucose+oxidase+in+the+hypopharyngeal+gland+with+an+age-dependent+role+change+of+the+worker+honeybee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L).</a> Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).</li>
<li>Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+cDNA+and+analysis+of+expression+of+the+gene+for+alpha-glucosidase+from+the+hypopharyngeal+gland+of+the+honeybee+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L.</a> Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).</li>
<li>Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+in+the+hypopharyngeal+glands+of+worker+honeybees+%28Apis+mellifera+L.%29+associated+with+an+age-dependent+role+change%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change.</a> Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).</li>
<li>Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+and+genetic+control+of+behavioral+integration+in+honey+bee+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies.</a> Science. 246 (4926), 109-112 (1989).</li>
<li>Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juvenile+hormone+paces+behavioral+development+in+the+adult+worker+honey+bee%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Behav%22%5BJournal%5D)">Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee.</a> Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).</li>
<li>Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+gene+action+across+different+time+scales+on+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Influence of gene action across different time scales on behavior.</a> Science. 296 (5568), 741-744 (2002).</li>
<li>Lehman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera%29%3A+the+role+of+tyramine+beta-hydroxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase.</a> J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).</li>
<li>Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+bee+PTEN--description%2C+developmental+knockdown%2C+and+tissue-specific+expression+of+splice-variants+correlated+with+alternative+social+phenotypes%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes).</a> PLoS One. 6 (7), e22195(2011).</li>
<li>Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+in+the+brain+predict+behavior+in+individual+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees.</a> Science. 302 (5643), 296-299 (2003).</li>
<li>Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+Gene+Expression+Profiles+of+the+Hypopharyngeal+Gland+of+Worker+Honeybees+in+Association+with+Worker+Behavior+and+Hormonal+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors.</a> PLoS One. 10 (6), e0130206(2015).</li>
<li>Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+ecdysteroid-regulated+gene+E74+of+the+honeybee+in+ovary+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain.</a> Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).</li>
<li>Takeuchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+gene%2C+Mblk-1%2C+that+encodes+a+putative+transcription+factor+expressed+preferentially+in+the+large-type+Kenyon+cells+of+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain.</a> Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).</li>
<li>Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcR-A+expression+in+the+brain+and+ovary+of+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L).</a> Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).</li>
<li>Yamane, T., Miyatake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+female+mating+receptivity+and+activation+of+oviposition+in+two+Callosobruchus+species+due+to+injection+of+biogenic+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines.</a> Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).</li>
<li>Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+changes+in+phototaxis%3A+a+possible+role+for+the+foraging+gene+in+honey+bee+division+of+labor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor.</a> J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).</li>
<li>Danforth, B. N., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+factor-1+alpha+occurs+as+two+copies+in+bees%3A+implications+for+phylogenetic+analysis+of+EF-1+alpha+sequences+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects.</a> Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).</li>
<li>Pandey, A., Bloch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juvenile+hormone+and+ecdysteroids+as+major+regulators+of+brain+and+behavior+in+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees.</a> Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voorbereiding van de single-cohort kolonies Hier beschrijven we het protocol dat in onze vorige studie 16 enkelvoudige-cohort kolonies bereiden voor analyse van HPG fysiologie verband met de verschuiving van de rol van werkbijen. Verpleegkundige bijen en vroegrijpe verzamelaars dat de procedures 1,6-1,7 en Figuur 2 beschreven criteria voldoen werden waargenomen in de single-cohort kolonies (tabel 1). De foto in figuur 2 zou nuttig...

De Europese honingbij, Apis mellifera, is een eusocial insect met een goed georganiseerde samenleving 1. Werkbijen (arbeids kaste) worden betrokken bij verschillende taken aan kolonie activiteit te behouden en deze taken veranderen al naar gelang de leeftijd van de werknemer honingbij na eclosion, die wordt aangeduid als leeftijdsgebonden arbeidsverdeling 2-4. Jonge werknemers (&lt;13 dagen oud) verzorgen van het broed in de korf door het afscheiden van royal jelly (verpleegkundige bijen), terwijl oudere werknemers (&gt; 15 dagen oud) nectar en stuifmeel te verzamelen buiten de korf (verzamelaars) 2-4. De fysiologie van de arbeiders veranderingen in verband met deze rol shift. Bijvoorbeeld, de functie van de hypofarynx klieren (HPGs), gekoppeld exocriene klieren in de kop, veranderingen in samenwerking met de rol verschuiving van verpleging tot 2,5 voederen. Verpleegster bijen HPGs vooral te synthetiseren grote royal jelly eiwitten, die belangrijke bestanddelen van bee melk. Aan de andere kant, forager HPGs hoofdzakelijksynthetiseren koolhydraat metaboliserende enzymen, zoals α-glucosidase III om nectar honing verwerken door het omzetten van sucrose in glucose en fructose. Onze eerdere studies is gebleken dat de expressie van mrjp2, die een belangrijke royal jelly eiwit en Hbg3 codeert, waarbij α-glucosidase III, codeert veranderingen in de rol shift 6-9. Om te bepalen of de fysiologische veranderingen van de werknemer weefsels, waaronder de HPGs, wordt geassocieerd met de functie shift of de leeftijd van de arbeiders, zou het nuttig zijn de populatie samenstelling van een bijenkolonies manipuleren, zodanig dat één cohort bereiden kolonies waar werknemers van bijna dezelfde leeftijd uit te voeren verschillende taken 10,11. Robinson et al. (1989) beschreven een werkwijze voor het vaststellen van een cohort-kolonie 10. Single-cohort kolonies bevatten aanvankelijk een koningin en 0-2 dagen oude werknemers. Enkele dagen na de oprichting van de kolonies, de werknemers van de almost dezelfde leeftijd aannemen verschillende taken. Sommige werknemers voeren verpleegkundige taken in de typische kolonies, terwijl andere werknemers foerageergebied taken eerder dan gebruikelijk uit te voeren en zijn dus vroegrijpe verzamelaars genoemd. Genexpressie vergelijkingen tussen verpleegkundige bijen en vroegrijpe voedermachines zou nuttige informatie over de rol bijbehorende fysiologie van werknemer weefsels 12-16 bieden. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het bereiden één cohort kolonies voor analyse van de rol- en / of leeftijdgebonden fysiologie van HPGs 16. Ook korte beschrijving hoe de genexpressie van mrjp2 en Hbg3 onderzocht met kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (RT-PCR) voor het HPG fysiologie evalueren. Naast de analyse werknemer fysiologie in enkelvoudige kolonies cohort onderzoek van het endocriene systeem is belangrijk voor het analyseren van de regelgeving van rollen geassocieerde worker fysiologie. Juveniel hormoon (JH), die known als de &#39;status quo&#39; hormoon in insectenlarven, versnelt de verschuiving in de rol van verpleegkundige tot foerageren in werkbijen 11. Bovendien ecdyson, die bekend staat als het vervellen hormoon tijdens metamorfose, betrokken zouden kunnen zijn in de rol shift genen die coderen ecdyson signaalmoleculen zijn uitgedrukt in de mushroom bodies, een hogere midden van de werknemer hersenen 17-19. Daarom hebben we ook beschrijven gedetailleerd protocol gebruikt in onze vorige studie 16 werknemers met 20E behandelen, die een actieve vorm van ecdyson en methopreen, een JH analoog, voor de analyse van het effect van het endocriene systeem HPG fysiologie (expressie van mrjp2 en Hbg3).

<table><tbody><tr><td>UNIPOSCA</td><td>Mitsubishi potlood</td><td>PC-5M</td><td>Markerpen voor het aanbrengen van markeringen op bijen&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>20-hydroxyecdysone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Methopreen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33375</td><td></td></tr><tr><td>Fokkerij insectenkoker</td><td>IRIS OHYAMA</td><td>CP-SS</td><td></td></tr><tr><td>Electromotion mixer&nbsp;</td><td>ISO</td><td>23M-R25</td><td>homogenisatie van weefsel</td></tr><tr><td>TRIZol Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>het reagens voor totale RNA-extractie</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Takara</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT reagenskit</td><td>Takara</td><td>RR037A</td><td>het reagens voor reverse transcriptie</td></tr><tr><td>SYBR Premix ExTaq II</td><td>Takara</td><td>RR820A</td><td>het reagens voor real-time PCR</td></tr><tr><td>LightCycle 1.2 Instrument</td><td>Roche</td><td>12011468001</td><td>het instrument voor real-time PCR</td></tr><tr><td>LightCycle Capillaires (20&mu;l)</td><td>Roche</td><td>4929292001</td><td>het materiaal voor real-time PCR</td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de single-cohort colonies and hormoon behandeling van werkbijen analyseer physiology geassocieerd met rol en / of endocriene systeem

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Honingbijenwerksters zijn betrokken bij verschillende taken met betrekking tot het handhaven van de kolonieactiviteit. De taken van de werksters veranderen naargelang hun leeftijd (leeftijdsgebonden arbeidsverdeling). Jonge werksters zijn bezig met het verzorgen van de broed (verzorgende bijen), terwijl oudere werksters nectar en pollen verzamelen (verzamelaars). De fysiologie van de werksters verandert in verband met deze rolverschuiving. Zo verandert de belangrijkste functie van de hypofaryngeale klieren (HPG's) van de secretie van belangrijke koninginnegelei-eiwitten (MRJP's) naar de secretie van koolhydraatmetaboliserende enzymen. Omdat de taken van de werksters veranderen naarmate ze ouder worden in typische kolonies, is het moeilijk om de fysiologische veranderingen die optreden met veroudering te onderscheiden van die welke optreden met de rolverschuiving. Om de fysiologische veranderingen in werksterressens, inclusief de HPG's, in verband met de rolverschuiving te bestuderen, zou het nuttig zijn om de honingbijenkoloniepopulatie te manipuleren door enkelcohortkolonies voor te bereiden waarin werksters van bijna dezelfde leeftijd verschillende taken uitvoeren. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van enkelcohortkolonies voor deze analyse. Zes tot acht dagen na de voorbereiding van de enkelcohortkolonie verschijnen er vroegrijpe verzamelaars die eerder dan normaal verzameltakken uitvoeren in de kolonie. Representatieve resultaten wezen op rolgerelateerde veranderingen in HPG-genexpressie, wat duidt op een rolgerelateerde HPG-functie. Naast het manipuleren van de koloniepopulatie is analyse van het endocriene systeem belangrijk voor het onderzoeken van de rolgerelateerde fysiologie. Hier beschrijven we ook een gedetailleerd protocol voor het behandelen van werksters met 20-hydroxyecdysone (20E), een actieve vorm van ecdysone, en methopreen, een juveniele hormoon-analogon. De overlevingssnelheid van de behandelde bijen was voldoende om genexpressie in de HPG's te onderzoeken. Genexpressieveranderingen werden waargenomen als reactie op 20E- en/of methopreenbehandeling, wat suggereert dat hormoonbehandelingen fysiologische veranderingen van de HPG's induceren. Het protocol voor hormoonbehandeling dat hier wordt beschreven, is geschikt voor het onderzoeken van hormonale effecten op de werksterrefysiologie.

Een overzicht van het protocol voor het bereiden één cohort kolonies is weergegeven in figuur 1A. Tijdsverloop van de experimenten van het voorbereiden van single-cohort kolonies aan collectie proeven is weergegeven in figuur 1B. Arbeiders die de gedragscriteria voor verzorgingsgedrag of fourageergedrag voldaan werden verzameld uit één-cohort kolonies en HPG ontwikkeling werd geschat deze werknemers Tabel 1 toont de indeling van HPG ontw...

Hier beschrijven wij onze gedetailleerde protocol voor de voorbereiding van de single-cohort bijenvolken - een nuttig instrument voor het analyseren van de role-geassocieerde werknemer fysiologie. We beschrijven ook gedetailleerde protocollen voor de behandeling van werknemers met juveniele hormoon en ecdyson de betrokkenheid van deze hormonen in de regulatie van de werknemer gedrag en / of fysiologie te evalueren.

Voorbereiding van de Single-cohort Colonies and Hormoon Behandeling van werkbijen Analyseer Physiology geassocieerd met Rol en / of endocriene systeem

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

Het algemene doel van deze procedures is om de fysiologie van werksters van de honingbij te onderzoeken in relatie tot de rol van de werksters en de status van hun endocriene systeem. Het is een methode die veelvuldig is gebruikt voor de analyse van het gedrag van werksters en kan ook helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de relatie tussen fysiologie en de rol van honingbij-werksters. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze relatief eenvoudig uit te voeren is.Om twee kolonies met een enkele cohort te creëren, begint u met drie standaardkolonies en verzamelt u pas uitgekomen werksters uit elk van deze drie kolonies. Inspecteer de kolonies regelmatig met een pincet op de aanwezigheid van puby in de afgedekte perifere cellen met bruine ogen en gepigmenteerde cuticulae. Zodra deze zijn gevonden, zal het grootste deel van de puby in de volgende paar dagen uitkomen.Borstel vervolgens de volwassen bijen van de ramen en verwijder de ramen uit de kolonie. Plaats één zodanige raam van elk van de drie kolonies in een lege kleine afkoker. Richt twee van deze afkokers in en incubeer deze bij 33 degrees Celsius met een relatieve vochtigheid van ten minste 60%. Verzamel

preparation-single-cohort-colonies-hormone-treatment-worker-honeybees

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We laten zien hoe je een gedrags-farmacologie methode te implementeren in een appetitief olfactorische conditionering paradigma in de honingbijen (Apis mellifera) door systemische toediening van drugs. Deze methode maakt het mogelijk onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan leren en geheugen vorming in een eenvoudige en betrouwbare manier.

Behavioural Farmacologie in klassieke conditionering van de Proboscis Extension Response in Honingbijen ( Apis mellifera)

In honingbij werknemers, ouder worden, hangt af van sociaal gedrag in plaats van op chronologische leeftijd. Hier laten we zien hoe de werknemer-typen met zeer verschillende veroudering patronen kan worden verkregen en voor cellulaire veroudering geanalyseerd.

Het verkrijgen van exemplaren met vertraagd, versneld en Reversed Aging in de Honey Bee Model

Het Proboscis Extension Response (PER) conditioneringsprotocol, ontwikkeld voor de honingbij (Apis mellifera), biedt een ecologisch relevante en gemakkelijk kwantificeerbare manier om verschillende mechanismen van leren bij veel insectensoorten te bestuderen.

Een Proboscis Extension Response Protocol voor het onderzoeken van Behavioral Plasticiteit in Insecten: Toepassing op Basic, Biomedische en Landbouwkundig Onderzoek

Microbiële consortia binnen bumble bee-hives verrijken en behouden van pollen voor larven van de honingbij. Met behulp van de volgende generatie sequencing, samen met laboratorium en veld gebaseerde experimenten, dit manuscript wordt beschreven protocollen gebruikt om te testen van de hypothese dat fungicide residuen veranderen de stuifmeel microbiome, en de kolonie demografie, uiteindelijk leidde tot de kolonie verlies.

Empirische, Metagenomic en computationele technieken verlichten de mechanismen door welke fungiciden compromis Bee gezondheid

Dit manuscript beschrijft meerdere protocollen voor het toedienen van farmacologische middelen aan de bijen, waaronder eenvoudige niet-invasieve methoden voor vrij vliegende bijen, evenals meer invasieve varianten die precies gelokaliseerde behandeling van ingehouden bijen mogelijk.

Neurofarmacologische Manipulatie van ingetogen en vrij vliegende Honingbijen,<em&gt; Apis mellifera</em

Hier presenteren we een methode om zowel een individuele honingbij als een bijenkolonie voedsel te geven dat besmet is met pesticiden. De procedure evalueert het effect van pesticiden op individuele honingbijen door in vivo voeding van een basislarvenvoeding en ook op de natuurlijke toestand van de bijenkolonie.

Het evalueren van het effect van Environmental Chemicals over Honey Bee ontwikkeling van het individu naar Colony Level

Het verlies van honingbijkolonies is een uitdaging om de bestuivingsdiensten te bestuderen. Huidige beschermingspraktijken van de bestuderende instanties garanderen een alternatieve aanpak om het contact van honingbijen tegen schadelijke pesticiden met behulp van afweermiddelen te beperken. Hier bieden we gedetailleerde methodes voor een visuele tracking protocol om afschermingen voor bijen te screenen.

Video Tracking Protocol voor Screen Deterrent Chemistries voor Honingbijen

Subletale doses van pesticiden kunnen van invloed zijn op de kolonies op manieren die moeilijk op te sporen met behulp van alleen visuele of periodieke methoden. Methoden voor het meten van de totale volwassen bee massa, brood en voedselbronnen door weging netelroos en korf onderdelen en frames te fotograferen, en installeren sensoren, worden geleverd. Data-analyse wordt ook behandeld.

Toezicht op de gevolgen van de kolonie-niveau van blootstelling van de subletale bestrijdingsmiddelen voor bijen

Fungicide sprays op tweezaadlobbige planten kunnen Solitaire bijen aan hoge concentraties van stuifmeel overgedragen fungicide residuen blootstellen. Met behulp van laboratorium gebaseerde experimenten waarbij in vitro-gefokte bijen larven, deze studie onderzoekt de interactieve effecten van de consumptie van fungicide-behandelde stuifmeel afkomstig van planten van de host en niet-host.

In Vitro Fokken van Solitaire bijen: een instrument voor de beoordeling van larvale risicofactoren

Hier beschrijven we twee protocollen: ten eerste om grote hoeveelheden niet-omhulde virusdeeltjes van honingbijen te vermeerderen, te extraheren, te zuiveren en te kwantificeren, inclusief een methode voor het verwijderen van honingbijpoppen en ten tweede om de effecten van virale infectie te testen met behulp van een zeer herhaalbare kooibioassay met hoge doorvoer.

Bereiding van virusverrijkt entmateriaal voor orale infectie van honingbijen (Apis mellifera)

Dit protocol is ontwikkeld om het begrip te vergroten van hoe agrochemicaliën de reproductie van honingbijen(Apis mellifera)beïnvloeden door methoden vast te stellen om honingbijenkoninginnen en hun werkverzorgers bloot te stellen aan agrochemicaliën in een gecontroleerde, laboratoriumomgeving en zorgvuldig hun relevante reacties te volgen.

Beoordeling van agrochemisch risico voor gepaarde honingbijenkoninginnen

Leer hoe je single-cohort kolonies van honingbijen voorbereidt en behandelt met juveniel hormoon en ecdysone. Deze methode analyseert de fysiologie van werkbijen in relatie tot hun rol en endocriene systeem.

Voorbereiding van de Single-cohort Colonies and Hormoon Behandeling van werkbijen Analyseer Physiology geassocieerd met Rol en / of endocriene systeem (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding van de Single-cohort Colonies and Hormoon Behandeling van werkbijen Analyseer Physiology geassocieerd met Rol en / of endocriene systeem

Meer video's verkennen