Gebruik van een batterij van chemische en ecotoxicologische methoden voor de beoordeling van de werkzaamheid van Afvalwaterbehandeling processen te verwijderen Estrogenic Potentie

Het algemene doel van de hier beschreven reeks tests, waaronder analytische chemie en in vitro- en in vivo-methoden, is het bepalen van de effectiviteit van opkomende en nieuwe technologieën voor afvalwaterzuivering om oestrogene verontreinigingen te verwijderen. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de milieukunde, bijvoorbeeld bij het selecteren van de meest effectieve processen voor afvalwaterzuivering bij een variërende oestrogene potentie van afvalwater. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze gevoelig zijn voor zeer lage concentraties van actieve verbindingen, waardoor de beste technologieën om het aquatisch leven te beschermen kunnen worden aangetoond.

De procedures worden gedemonstreerd door postdoctoral fellow Dr. Chris Green, promovendus Angela Pinzon, research fellow Dr. Alice Baynes en senior research technician Nicola Beresford. Het SPE-proces vereist strikte aandacht voor schoonmaak en orde om monstercontaminatie te voorkomen. Reinig alle buizen, kranen en fritten vooraf met methanol.

Bevestig vóór het analyseren van de monsters de overdrachtslijnen aan het extractieverdeelstuk en spoel het gehele systeem met gedeïoniseerd water. Om de monsters te analyseren, bevestigt u eerst de wegwerpliners van de klep en vervolgens de styreen-divinylbenzeen SPE-cartridges. Pipetteer daarna vijf milliliter ethylacetaat in elk reservoir om de cartridges te conditioneren.

Zorg er tijdens deze stap voor dat de SPE is afgesloten. Zet vervolgens de vacuumpomp aan voor een stroomsnelheid van 10 millimeters per minuut. Voordat de kolommen uitdrogen, worden vijf milliliter methanol en daarna vijf milliliter water geladen.

Het is zeer belangrijk dat de SPE-cartridges niet uitdrogen. Zodra het water grotendeels is doorgelopen, schakelt u de pomp uit en vult u elk cartridge-reservoir aan met water. Sluit vervolgens 1/8 inch PTFE-slangen aan tussen de cartridge-reservoirs en de glazen monsterflesjes.

Schakel nu het vacuüm over naar een stroomsnelheid van minder dan 10 milliliters per minuut en laat het volledige monster door de cartridge lopen. Droog vervolgens de SPE-cartridges grondig, totdat de inhoud van de cartridge van kleur verandert. Gebruik hiervoor een vacuüm of een gasstroom.

Plaats nu schone, droge, glazen opvangbuisjes van 10 milliliter in een rek en plaats het rek in het extractiemanifold. Controleer of elke liner zich boven een buisje bevindt. Vul de monsterreservoirs met twee keer vier milliliter, voor een totaal van acht milliliter dichloormethaan, schakel de vacuümpomp in en laat de vloeistof door de SPE in de opvangbuisjes stromen.

Gebruik vervolgens een concentrator om het volume in alle opvangbuisjes te reduceren tot 1 milliliter. Overbreng elk monster naar een autosampler-buisje en concentreer deze verder tot 100 microliters met behulp van stikstof-blowdown-apparatuur. De volgende stap in het proces is het gebruik van GPC om macromoleculaire interferenties te verwijderen.

Injecteer eerst 95 µL van het geëlueerde monster-extract in de HPLC die is uitgerust met GPC. Concentreer het GPC-extract tot 200 µL met behulp van een concentrator en een stikstofverdampingsapparaat, en vul het vervolgens aan tot twee milliliter met hexaan. Bevestig vervolgens wegwerpbare klepliningsschijven, amino-purple cartridges en cartridge-reservoirs aan het SPE-manifold, en plaats daaronder de glazen opvangbuisjes van 10 milliliter.

Laad nu twee milliliters hexaan in elke cartridge om deze te conditioneren en gooi het oplosmiddel weg. Laad vervolgens het GPC-monsterextract in het reservoir en trek dit erdoorheen. Zet het opgevangen extract apart en plaats het vial terug in het rek om de wassing op te vangen.

Leid vervolgens twee milliliter van 30 procent volume/volume ethylacetaat en hexaan door de cartridgelabel. Voeg daarna nog twee milliliter ethylacetaat en hexaan toe, gooi de verzamelbuisjes met de wasoplossing weg en plaats het verzamelbuisje van 10 milliliter terug in het rek. Voeg nu twee milliliter van 50 procent volume/volume ethylacetaat en aceton toe aan het reservoir en start de pomp bij een lage stroomsnelheid, lager dan twee milliliter per minuut.

Nadat de vloeistof is doorgetrokken, voegt u nog eens twee milliliters 50 procent ethylacetaat toe aan het reservoir. Gebruik vervolgens een concentrator om het volume van het extract te reduceren tot één milliliter. Draag de monsteroplossing daarna over naar een kleiner glazen vial en gebruik stikstofstroomapparatuur om het extract te verdampen tot incipiente droogte. Voeg 100 microliters methanol toe, meng het monster goed en draag het over naar een autosampler-vial met een insert van 0,3 milliliter.

Voer vervolgens een LC-MS/MS-analyse van het extract uit. Bereid de dag voor aanvang van de assay vers groeimedium voor en inoculeer dit met de tenax-dock van de gebruikte HER-stam. Bereid de volgende dag de assay voor door seriële verdunningen van 100 microliter van de testchemicaliën of effluent-extracten te maken, gevolgd door een E2-standaardcurve in ethanol.

Breng nu aliquots van 10 µL over naar een gelabelde steriele 96-wellplaat. Laat de plaat vervolgens onafgedekt om de ethanol te laten verdampen. Bereid daarna 50 mL groeimedium voor, met 0,5 mL CPRG-oplossing.

Meet de troebelheid van de 24 uur oude gistcultuur bij 620 nanometer om de celdichtheid te schatten. Voeg vervolgens 40 miljoen gistcellen toe aan de 50 milliliters assaymedium. Overbreng het geïnoculeerde assaymedium naar een steriele trog en gebruik een multichannelpipet om 200 microliters medium naar elke put van de assayplaat over te brengen.

Plaats het deksel van de assayplaat terug, dicht de randen af met plakband en schud de assayplaat gedurende twee minuten krachtig met een plaatshaker. Incubeer de plaat vervolgens bij 32 Celsius in een natuurlijk geventileerde warmtekast. Herhaal na drie dagen incubatie het schudden en laat de gist vervolgens ongeveer een uur bezinken.

Meet tot slot de lichtabsorptie van de monsters bij 540 en 620 nanometer. Watermonsters van een conventionele afvalwaterzuiveringsinstallatie om het slibproces te activeren, werden geanalyseerd met behulp van negatieve ion electrospray LCMS, waarbij ethinylestradiol aanwezig was in een concentratie boven het voorspelde effectloze niveau. Door gebruik te maken van geavanceerde waterzuivering, zoals korrelactieve kool, of GAC, was het mogelijk om de ethinylestradiolspiegels aanzienlijk te verlagen.

Alle afvalwaterextracten werden geanalyseerd met een isotopisch gelabelde interne standaard, rode piek, om kwantificatie mogelijk te maken. De gist-oestrogeen-screeningsassay was duidelijk gevoelig voor de standaard estradiol, maar vertoonde geen respons op de ethanol, wat in feite de blanco is. De gist-screeningscellen reageerden duidelijk op het effluent van het proces met actief slib, terwijl het met GAC behandelde effluent een verminderde respons produceerde, hoewel dit nog steeds biologisch actiever was dan de blanco.

Met deze innovatieve technologie voor afvalwaterzuivering werden zowel de concentratie ethanolestradiol, weergegeven in het blauw, als de oestrogene activiteit, weergegeven in het groen, significant verlaagd door een gecombineerde behandeling met waterstofperoxide en TAML. Afvalwaterzuiveringsinstallaties zijn de belangrijkste bron van oppervlaktewaterverontreiniging met oestrogene stoffen. Nieuwe methoden voor waterzuiveringsprocessen om deze effluenten te verbeteren vereisen grondige testen van de oestrogene activiteit.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in een reeks chemische en ecotoxicologische tests die nodig zijn om de oestrogene activiteit in watermonsters te meten. Het is uiterst belangrijk om ervoor te zorgen dat de contaminatie van monsters en extracten wordt geminimaliseerd door een zorgvuldige hantering van de monsters en extracten. Zo bevatten veelgebruikte kunststoffen oestrogene verbindingen; daarom is het essentieel om negatieve controles op te nemen om chemische contaminatie te controleren, en positieve controles om te verifiëren dat de extractiemethode heeft gewerkt en dat er een goede terugwinning is van toegevoegde oestrogenen.