Name: Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Leer hoe je M-CSF-gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen kweekt met behulp van leukapherese en centrifugale elutriatie. Deze methode minimaliseert donorafhankelijkheid en zorgt voor consistente celculturen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het Department of Transfusion Medicine, Clinical Center, National Institutes of Health, leverde elutriated monocyten. Dit werk werd ondersteund door het Intramural Research Program, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health.

Leukaferese werd uitgevoerd onder een menselijk onderwerp onderzoeksprotocol door een National Institutes of Health Institutional Review Board goedgekeurd uitgevoerd. 1. Isolatie en cryopreservatie van monocyten <ol><li> Verkrijgen mononucleaire cellen door leukaferese van humane donoren en verrijken monocyten door continue tegenstroom centrifugatie elutie van mononucleaire cellen zoals beschreven in de referenties 7,8. Verkrijgen ongeveer 100 x 10 6 cellen elutriated (ongeveer 80 - 90% monocyten) in elutratie buffer die door de fabrikant. Aantal cellen met een hemocytometer. </li><li> Centrifuge monocyten in een 15 ml polypropyleen buis bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in FBS vervolgens dimethylsulfoxide tot een uiteindelijke concentratie van 90% FBS / 10% dimethylsulfoxide en 50 x 10 6 cellen / ml bereiken. </li><li> Voeg elke ml celsuspensie to een individuele cryovial. </li><li> Plaats de cryovials in een cel bevriezen houder en overbrengen naar een -80 ° C vriezer gedurende 24 uur alvorens naar een vloeibare stikstof cryovial opslagtank voor langdurige opslag. </li></ol> 2. Differentiatie van monocyten tot macrofagen <ol><li> Dooi een cryovial van de cellen door het snel overbrengen naar een 37 ° C waterbad en dan onmiddellijk te verwijderen wanneer de cel suspensie ongeveer 70% is ontdooid. </li><li> Onmiddellijk na volledig ontdooien bij kamertemperatuur, breng de 1 ml cryovial inhoud in 50 ml 37 ° C opgewarmd Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium met 2 mM L-glutamine, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukine-10 (IL-10) en 10% FBS (volledig medium). </li><li> Overdracht 25 ml van monocyten suspensie in elk van twee 75 cm 2 plastic celkweek kolven. </li><li> Incubeer kweken in een 37 ° C celkweek incubator met 5% CO2 / 95% lucht gedurende 48 uur. </li><li> Spoel de cultures 3 maal met 10 ml RPMI 1640 medium (voorverwarmd tot 37 ° C) voorzichtig verwijderen van het kweekmedium te voorkomen loskomen elke losjes verbonden cellen. </li><li> Na spoelen, voeg vers compleet medium, het veranderen medium elke 2 dagen tot monocyten differentiëren en vermenigvuldigen voldoende om confluent worden. Dit vergt ongeveer een week van de cultuur. </li></ol> 3. Oogsten Macrofagen experimenten starten <ol><li> Spoel gedifferentieerde macrofagen in kolf 3 maal met 10 ml voorverwarmd 37 ° C Dulbecco&#39;s fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + voordat 10 ml voorverwarmd 37 ° C 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing. </li><li> Cuvette in celkweek incubator gedurende 10 - 15 min waarna ongeveer 90% van de macrofagen moeten rond en losgemaakt. Verifieer dit door microscopisch onderzoek van de kolf. </li><li> Voeg 10 ml RMPI 1640 medium dat 10% FBS tot stop trypsine. </li><li> Breng de macrofaag celsuspensie uit de kolf in een 50 ml polypropyleen buis, centrifuge 300 xg gedurende 5 min en gooi het supernatant. </li><li> Voorzichtig resuspendeer de macrofagen in 1 ml compleet medium. </li><li> Meng 10 pl macrofaag celsuspensie met 10 pi trypan blauwe oplossing en bepaal macrofaag celaantal en levensvatbaarheid (gewoonlijk&gt; 95%) met een hemocytometer. </li><li> Op basis van het aantal cellen (gewoonlijk ongeveer 15-18 x 10 5 macrofagen), voeg extra compleet medium om de gewenste zaaien celdichtheid bereiken. Opmerking: 1 x 10 5 macrofagen in 1,5 ml medium per putje van een 12-wells plaat zal een bijna-confluente cultuur te produceren. </li><li> Na enten macrofagen incubeer overnacht in een 37 ° C celkweek incubator met 5% CO2 / 95% lucht celhechting mogelijk. Vervolgens beginnen gewenste experimenten. </li></ol>

<ol><li>Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+polarization+of+macrophages+in+inflammation%3A+blood+monocytes+versus+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages.</a> Front. Immunol. 5, 683(2014).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).</li>
<li>Akagawa, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).</li>
<li>Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF%29+and+macrophage+CSF-dependent+macrophage+phenotypes+display+differences+in+cytokine+profiles+and+transcription+factor+activities%3A+implications+for+CSF+blockade+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation.</a> J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).</li>
<li>Strasser, E. F., Eckstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+leukocyte+collection+and+monocyte+isolation+for+dendritic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture.</a> Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+enrichment+from+leukapheresis+products+by+using+the+Elutra+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator.</a> Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Anzinger, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+low-density+lipoprotein+uptake+by+macrophage+colony-stimulating+factor-differentiated+human+macrophages+is+mediated+by+macropinocytosis+and+micropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+receptor-independent+low+density+lipoprotein+uptake+and+cholesterol+accumulation+by+macrophages+differentiated+from+human+monocytes+with+macrophage-colony-stimulating+factor+%28M-CSF%29%5BTitle%5D)+AND+%22+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF).</a> J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).</li>
<li>Freeman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG1-mediated+generation+of+extracellular+cholesterol+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains.</a> J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).</li>
<li>Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-independent+fluid-phase+pinocytosis+mechanisms+for+induction+of+foam+cell+formation+with+native+low-density+lipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles.</a> Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA1+contributes+to+macrophage+deposition+of+extracellular+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol.</a> J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).</li>
<li>Ong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+cholesterol-rich+microdomains+generated+by+human+macrophages+and+their+potential+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport.</a> J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).</li>
<li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li>
<li>Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+inhibits+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-dependent+human+monocyte+survival+at+the+early+stage+of+the+culture+and+inhibits+the+generation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages.</a> J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).</li>
<li>Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+monocytes+from+whole+blood+by+density+gradient+centrifugation+and+counter-current+elutriation+followed+by+cryopreservation%3A+six+years%27+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).</li>
<li>Weiner, R. S., Normann, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integrity+of+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Functional integrity of cryopreserved human monocytes.</a> J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).</li>
<li>Hansen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+phagocytic+functions+in+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).</li>
<li>Seager Danciger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+large+scale+isolation%2C+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis%2C+cellular+adhesion+assays%2C+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).</li>
<li>Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+contamination+of+apolipoprotein+A-I%3A+effect+on+macrophage+proliferation--a+cautionary+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale.</a> Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het genereren van gedefinieerde typen macrofaag kan een deel van de tegenstrijdige resultaten verkregen door de onderzoekers bij het bestuderen van macrofaag biologie te verduidelijken. Het gebruik van verschillende kweekomstandigheden en differentiatiefactoren genereren primaire humane macrofagen kan leiden tot zeer verschillende typen macrofaag, een feit dat niet kan worden gewaardeerd door de onderzoeker. Bijvoorbeeld, macrofagen soms gegenereerd uit humane monocyten gebruiken, wordt geen serum, humaan serum alleen, ...

Het bestuderen van gekweekte macrofagen is een nuttig model om de functie van deze cellen in ontstekingen te begrijpen, zoals die optreedt in atherosclerotische plaques. Wanneer het onderzoek zich richt op menselijke ziekten waarbij macrofagen betrokken zijn, is het nuttig om primaire menselijke macrofagen te bestuderen in plaats van niet-menselijke macrofagen om soortverschillen te vermijden. Ook kunnen de effecten van celtransformatie worden vermeden door primaire macrofagen te gebruiken in plaats van macrofagencellenlijnen. Voor dit doel dienen macrofagen die gedifferentieerd zijn uit monocyten geïsoleerd uit menselijk bloed, als een manier om primaire menselijke macrofagen te verkrijgen.
Weefselmacrofagen kunnen ofwel resident zijn in weefsels of afkomstig zijn van monocyten die naar het weefsel migreren en differentiëren tot macrofagen 1. Er zijn twee soorten menselijke monocyte-afgeleide macrofagen gedefinieerd die niet alleen verschillen in morfologie, maar ook in genexpressie en celfunctie 2. Deze twee typen worden verkregen uit monocyten die worden gedifferentieerd tot macrofagen in aanwezigheid van M-CSF + foetaal bovien serum (FBS) en monocyten die worden gedifferentieerd tot macrofagen in aanwezigheid van granulocyte-macrofaagkoloniestimulerend factor (GM-CSF) + FBS 2-6. In onze ervaring (ongepubliceerde observatie) genereert het gebruik van menselijk serum in plaats van FBS de GM-CSF-type, ongeacht of M-CSF of GM-CSF in het differentiatiemedium is opgenomen. M-CSF type macrofagen zijn meestal langer dan GM-CSF type macrofagen, die lijken op gebakken eieren in hun morfologie. Onderzoekers moeten zich realiseren dat menselijke M-CSF en GM-CSF monocyte-afgeleide macrofagen niet hetzelfde zijn als de zogenaamde M1 en M2 muis beenmerg-afgeleide macrofagen 6.
Tijdens onderzoek met humane monocyte-afgeleide M-CSF gedifferentieerde macrofagen, ondervonden we moeilijkheden met betrekking tot de beschikbaarheid van monocyten om experimenten te starten en variatie in de verkregen celdichtheden van macrofagen tijdens de differentiatie van monocyten in macrofagen. Om deze problemen te overwinnen, hebben we het volgende protocol ontwikkeld waarin monocyten worden ingevroren totdat ze nodig zijn voor gebruik, en monocyten worden in bulk gedifferentieerd in macrofagen die vervolgens uit kweekkolven kunnen worden verwijderd en ingeplant op gewenste celdichtheden om meer uniforme culturen te verkrijgen van experiment tot experiment.

<table><tbody><tr><td>Cellbind 12-well culture plate</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated</td><td>Greiner Bio-One North America</td><td>658157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 culture medium</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>15-040-CM</td><td>opgewarmd tot 37 &deg;C</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-10&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS zonder Ca2+ en Mg2+&nbsp;</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropyleen conische buis</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-verbeterde lichte hemocytometers</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp; Co. KG</td><td>610031</td><td>http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html</td></tr><tr><td>CoolCell LX celvriescontainer</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td>andere vriescontainers zouden ook geschikt moeten zijn voor deze stap</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>7400</td><td>elke vloeibare stikstoftank zou geschikt moeten zijn</td></tr></tbody></table>

cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor gedifferentieerde human monocyt-afgeleide macrofagen

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Een protocol wordt gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Voor het starten van experimenten worden verse of bevroren monocyten gedurende 1 week gekweekt in kolven met M-CSF om hun differentiatie in macrofagen te induceren. Vervolgens kunnen de macrofagen worden geoogst en gezaaid in kweekputjes bij vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten. Het gebruik van gedefinieerde aantallen macrofagen in plaats van gedefinieerde aantallen monocyten om macrofaagculturen voor experimenten te starten, levert macrofaagculturen op waarin de gewenste celdichtheid consistenter kan worden bereikt. Het gebruik van cryobewaarde monocyten vermindert de afhankelijkheid van donorbeschikbaarheid en produceert homogenere macrofaagculturen.

De levensvatbaarheid van vers of gecryopreserveerde monocyten was hoger dan 95%, bepaald met Trypan Blue kleuring 9. Figuur 1 en Figuur 2 vergelijkt bij lagere en hogere vergrotingen, respectievelijk, de voortgang van verse en gecryopreserveerd (dwz bevroren) monocytdifferentiatie tot macrofagen. Merk op dat de verse opzichte van gecryopreserveerde monocyten tonen een subpopulatie differentiëren monocyten die niet ver...

Er wordt een protocol gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Het protocol maakt gebruik van cryopreservatie van monocyten gekoppeld aan hun bulkdifferentiatie in macrofagen. Vervolgens kunnen de geoogste macrofagen worden gezaaid in kweekputjes bij de vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten.

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Het algemene doel van deze procedure is om de beschikbaarheid van monocyten te verbeteren en de variatie in de verkregen celdichtheden te minimaliseren tijdens de MCSF-geïnduceerde differentiatie van menselijke bloedmonocyten tot macrofagen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de biologie van menselijke macrofagen. Het belangrijkste voordeel van deze tactiek is dat kweeksystemen van uit menselijke monocyten afgeleide macrofagen gemakkelijk kunnen worden verkregen, met een verminderde afhankelijkheid van de beschikbaarheid van donoren.Daarnaast kunnen de gewenste macrofaagceldichtheid en homogene culturen consistent worden bereikt. Om deze procedure te starten, worden de mononucleaire cellen via leukaferesis verkregen van menselijke donoren, waarna de monocyten worden verrijkt door continue counterflow centrifugale elutrie van mononucleaire cellen. Tel vervolgens de cellen met behulp van een hemocytometer.Centrifugeer vervolgens de monocyten vijf minuten bij kamertemperatuur in een polypropyleen buis van 15 milliliter. Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in FBS, gevolgd door dimethylsulfoxide, om een uiteindelijke concentratie van 90%FBS, 10%Dimethyl Sulfoxide en 50 × 10⁶ cellen per milliliter te bereiken. Voeg vervolgens één milliliter van de celresuspensie toe aan een individueel cryovial.Plaats de cryovials in een celvriescontainer en breng deze 24 uur lang over naar de vriezer van -80 °C. Verplaats de container na 24 uur naar een vloeibare stikstoftank voor langdurige bewaring. Ontdooi in deze stap een cryovial met cellen door deze kortstondig in een waterbad van 37 °C te houden.Wanneer de celsuspensie voor ongeveer 70% is ontdooid, dient deze onmiddellijk uit het waterbad te worden gehaald en op kamertemperatuur te worden gebracht. Nadat de celsuspensie volledig is ontdooid, wordt één milliliter van de inhoud van de cryovial overgebracht naar 50 milliliters RPMI 1640-medium met twee millimol L-glutamine, 50 nanogram per milliliter M-CSF, 25 nanogram per milliliter IL-10 en 10% FBS bij 37 graden Celsius. Vervolgens worden 25 milliliters van de monocytensuspensie overgebracht naar twee plastic kweekflessen van 75 vierkante centimeter.Incubeer de culturen 48 uur bij 37 °C. Let erop dat het medium pas na 48 uur wordt vervangen; anders hechten de cellen zich niet goed en worden ze weggespoeld. Spoel de culturen na 48 uur drie keer met 10 ml voorverwarmd RPMI 1640-medium.Verwijder voorzichtig het kweekmedium om te voorkomen dat losjes gehechte cellen worden losgemaakt. Voeg vervolgens volledig medium toe en kweek de cellen gedurende één week. Ververs het medium elke twee dagen totdat de monocyten efficiënt differentiëren en prolifereren om confluent te worden.Spoel nu de gedifferentieerde macrofagen in de kolf drie keer met 10 milliliters DPBS zonder calcium en magnesium bij 37 degrees Celsius. Voeg vervolgens 10 milliliters 0.25%Trypson EDTA-oplossing bij 37 degrees Celsius toe. Plaats de kolf daarna gedurende 10 tot 15 minuten in een celkweekincubator.Hierna zouden ongeveer 90% van de macrofagen rond moeten zijn geworden en losgelaten. Voeg vervolgens 10 milliliters RPMI 1640-medium met 10% FBS toe om de trypsinisatie te stoppen. Gebruik indien nodig een cell lifter om de cellen volledig te verwijderen.Soms blijven bij deze procedure veel macrofagen aan het oppervlak gehecht. Deze macrofagen kunnen na trypsinisatie worden verwijderd door een cell lifter over het oppervlak van de kolf te bewegen. Breng vervolgens de suspensie van macrofagen uit de kolf over naar een polypropyleen buis van 15 milliliter.Centrifugeer het mengsel vijf minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Resuspendeer vervolgens de macrofagen voorzichtig in één milliliter compleet medium. Voeg op basis van het celgetal extra compleet medium toe om de gewenste zaaidichtheid van de cellen te bereiken.Plate daarna de macrofagen in 1,5 milliliter medium per well van een 12-well plaat. 1 × 10⁵ cellen in 1,5 milliliter medium per well resulteert gewoonlijk in een bijna confluente cultuur. Incubeer de macrofagen na het uitplaten een nacht bij 37 °C om celadhesie mogelijk te maken voordat ze in experimenten worden gebruikt.Deze figuur toont de microscopische contrastbeelden van cryopreserveerde verse monocyten tijdens hun door MCSF geïnduceerde differentiatie tot macrofagen bij lage vergroting. De beelden van de monocyten zijn genomen op dag drie en zeven van de kweek in de kolf, en op dag acht, één dag na het oogsten en opnieuw uitplaten in de 12-wells kweekplaat. Hier wordt de vergelijking getoond tussen verse en cryopreserveerde monocyten die zijn gebruikt om macrofagen te produceren bij hoge vergroting.De fase-contrast vacuolen zijn macropinosomen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe menselijke monocyten met MCSF cryopreserveert en vervolgens differentieert tot macrofagen. Vervolgens kunnen de macrofagen bij de gewenste celdichtheden worden gekweekt voor experimenten.

culture-macrophage-colony-stimulating-factor-differentiated-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the priming of primary monocytes into macrophages. Primary human monocytes can be isolated and differentiated to an M1-like pro-inflammatory phenotype using the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) or to an M2-like anti-inflammatory phenotype using the macrophage colony-stimulating factor (M-CSF).

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

In this video, we demonstrate a procedure to induce the differentiation and polarization of peripheral blood-derived monocytes into M1 or M2 macrophages. Incubation with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, lipopolysaccharide, and interferon‐gamma yields pro-inflammatory M1 macrophages, while incubation with macrophage colony-stimulating factor and interleukin-4 induces anti-inflammatory M2 macrophage production.

Differentiation and Polarization of Monocyte-Derived Cells into Macrophage-Like Cells

Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te...

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Beendermergcellen gekweekt met granulocyte macrophage colony stimulerende factor (GM-CSF) genereren een heterogene cultuur die macrofagen en dendritische cellen (DC's) bevat. Deze methode benadrukt het gebruik van MHCII en hyaluronan (HA) binding om macrofagen te onderscheiden van de DC's in de GM-CSF cultuur. Macrofagen in deze cultuur hebben veel overeenkomsten met alveolaire macrofagen.

Generatie en identificatie van GM-CSF Afgeleide alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen van de muis beenmerg

Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

Hier is een protocol voor het opsporen van macrofaag extracellulaire trap (met) productie in levende celcultuur met behulp van microscopie en fluorescentie kleuring. Dit protocol kan verder worden uitgebreid om specifieke MET eiwit markers te onderzoeken door immunofluorescentie kleuring.

In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

M2-achtige tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) zijn geassocieerd met tumorprogressie en slechte prognose bij kanker. Dit protocol dient als een gedetailleerde gids om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen reproduceerbaar te differentiëren en te polariseren in M2-achtige macrofagen. Dit model is de basis om de ontstekingsremmende effecten van TAM in de tumormicro-omgeving te onderzoeken.

Macrofaagdifferentiatie en polarisatie in een M2-achtig fenotype met behulp van een menselijke monocytachtige THP-1 leukemie cellijn

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen.

Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

Monocyten en macrofagen zijn zeer plastische en herprogrammeerbare immuuncellen die cruciaal zijn voor gezondheid en ziekte. Ze detecteren en reageren op een breed scala aan stimuli door specifieke differentiatieprogramma's en fenotypes aan te nemen. We hebben een in-vitro model gestandaardiseerd om macrofagen polarisatie en herprogrammering te bestuderen, wat een waardevol hulpmiddel voor onderzoek biedt.

Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

Leer hoe je M-CSF-gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen kweekt met behulp van leukapherese en centrifugale elutriatie. Deze methode minimaliseert donorafhankelijkheid en zorgt voor consistente celculturen.

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

Meer video's verkennen