Name: Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Leer intravitale fluorescentiemicroscopie om hematopoëtische cel-engraftment in beenmergniches te bestuderen. Deze methode maakt real-time visualisatie van homing en expansie in levende dieren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Imaging werd uitgevoerd in het midden van de Indiana voor biologische microscopie aan de Indiana University, geregisseerd door Dr. Ken Dunn. Het stereotaxic apparaat is een prototype ontworpen en gemaakt door Mark Soonpaa, Wells centrum voor pediatrisch onderzoek. Dit werk werd ondersteund door NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), het onderzoek van MPN Stichting (NC) en de CTSI gezamenlijke project IUSM/Notre Dame (NC).

Alle procedures waarbij het gebruik van dieren werden uitgevoerd met toestemming van de Animal Care en gebruiken Comité van Indiana University School of Medicine. Zorgen om te voldoen aan de wetgeving inzake dierlijke proefneming van het land waar het werk wordt uitgevoerd.
1. bereiding van Mx1CreRBPJ- / - ontvanger muizen
<ol><li>Kruis Mx1-Cre+ muizen met RBPJlox/lox muizen10 te verkrijgen van de Mx1-Crepositieve RBPJlox/lox muizen12 en Mx1-Cre negatieve RBPJlox/lox nestgenoten om te gebruiken als besturingselementen. Controleer of het genotype door PCR10.</li>
	<li>Gebruik van 6-8 week-oude Mx1Cre+/RBPJlox/lox en Mx1Cre-/RBPJlox/lox muizen voor het uitvoeren van de polyI:C-inductie.</li>
	<li>
Injecteren polyI:C 200 µg i.p. in Cre+ en Cre- muizen. Geef een polyI:C injectie elke andere dag gedurende 3 dagen de eerste week. Het geven van een injectie van de polyI:C de tweede week, 7 dagen na de vorige injectie (vier injecties in totaal).
	<ol>
<li>Gebruik RBPJKO (geïnduceerde Mx1Cre+/RBPJlox/lox) en RBPJWT (geïnduceerde Mx1Cre-/RBPJlox/lox) muizen als ontvangers 3 weken na de laatste injectie van de polyI:C. Opmerking: Het is aanbevolen om het gebruik van muizen geïnduceerd door pI: pC 3 weken na de injectie. De reactie van de IFNα veroorzaakt door polyI:C induceert significante veranderingen in de BM, resulterend in de uitbreiding van de immunophenotypic van HSC en uitvoer van volwassen voorlopercellen daalde in het perifeer bloed16,17. Vertegenwoordiging van het hematopoietische deelverzamelingen is genormaliseerd 3 weken na de injectie en de muizen kunnen worden gebruikt zonder de storende effecten van ontsteking. Dit protocol inductie is geoptimaliseerd voor RBPJ. Als het verwijderen van een ander gen, het inductie-protocol kan variëren afhankelijk van de constructie en verwijdering moet worden gevalideerd. We gevalideerd ~ 100% verwijdering van de RBPJ-regio tussen loxP sites door RT-PCR na een totaal van vier polyI:C injecties.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van Lys-EGFP Donor beenmergcellen voor transplantatie
<ol><li>Een Lys-EGFP muis (koolstofdioxide gevolgd door cervicale dislocatie) euthanaseren 1 of 2 h vóór de transplantatie.</li>
	<li>Spray de dierlijke lichaamsoppervlak met 70% ethanol.</li>
	<li>De chirurgische schaar gebruik te maken van een huid incisie op beide benen rond de enkel en met chirurgische pincet trek weg Pelsbereiderijen en bontwerkerijen samen om schone spierweefsel bloot te stellen.</li>
	<li>Heelkundige schaar verwijderen van zo veel spieren van de benen als mogelijk gebruiken. Met een schaar, knip de botten (bij de knie en de enkel gezamenlijk) en schoon elke resterende spierweefsel van het dijbeen en zijn verbeend met behulp van gaas sponzen. De beenderen (twee dijbeen en twee zijn verbeend) plaats in een 6-well plaat met DMEM 10% FBS.</li>
	<li>Plet de botten in een mortier met 10 mL koude 2mM EDTA PBS en Pipetteer de beenmergcellen te brengen van de cellen in één cel schorsing. Als alternatief, spoel de botten met 2 mM EDTA PBS 3 keer vanaf iedere kant met een spuit van 1 mL.</li>
	<li>Het beenmergcellen filteren met behulp van een 70-µm filter in een centrifugebuis 15 mL. Spoel filter met 2-3 mL PBS. Draai de cellen naar beneden 10 min op 460 x g, resuspendeer de cellen in 10 mL van de verse DMEM 10% FBS.</li>
	<li>Tellen van beenmergcellen op een hemocytometer en aanpassen van de concentratie aan 1.5 x 107 cellen/mL in IMDM zonder serum. 3 x 106 cellen per dier worden gebruikt met een volume van 200 µL. Ongeveer 1/3 cellen van totale BM zijn myeloïde GFP + cellen. Laat de cellen op ijs totdat u voor injectie. Gebruik 0,5 x 105 cellen om te bepalen van GFP expressie door FACS9.</li>
</ol>3. het beenmerg transplantatie van Lys-GFP cellen in RBPJKO muizen
<ol><li>Bedwingen ontvangende muizen in een kooi van de taart. Bestralen muizen met een dodelijke dosis gammastraling (1.200 Rad) op een Cs-137-irradiator. Een split dosis protocol gebruiken: 900 rads's avonds gevolgd door 300 rads de volgende ochtend (16 h uit elkaar).</li>
	<li>Verplant de dodelijk bestraalde RBPJWT en RBPJKO ontvangende muizen 5-6 uur na de tweede dosis straling. Injecteren van BM cellen geoogst van Lys-EGFP muizen bij een concentratie van 3 x 106 cellen per dier via staart veneuze injectie (zie details voor het oogsten van de cellen in de sectie 2).</li>
	<li>Afbeelding van onafhankelijke cohorten van getransplanteerde muizen door IVFM op verschillende tijdstippen: 24 h, en weken 2, 4 en 6, zoals beschreven hieronder (zie punt 4 & 5 voor in vivo imaging procedure).</li>
</ol>4. chirurgische voorbereiding Intravital Imaging
<ol><li>Steriliseren chirurgische instrumenten. Twee fijne pincet (één rechte, een hoek), een paar fijne schaar en een paar van de houders van de naald. Voorbereiding operatieve gebied met alle voorzieningen die nodig zijn voor de procedure.</li>
	<li>Geef de muis een IP-injectie van ketamine cocktail verdoving (Xylazine 2,5-5 mg/kg + acepromazine 1.0-2.5 mg/kg + ketamine 90-100 mg/kg) met behulp van een 26-28 G naald-spuit.  Dier elke 15 min tijdens de procedure zal worden gecontroleerd en verdoving zal zo nodig op ¼ van de oorspronkelijke dosis worden aangevuld.</li>
	<li>Plaats de muis op een goede warmtebron (37 ° C verwarming pad, dier beschermd tegen direct contact met de verwarming pad) en visueel controleren de respiratoire tarief.</li>
	<li>Controleer met behulp van de teen reflexen knijpen reactie. Zorg ervoor dat het dier volledig onder verdoving voordat u begint met een chirurgische ingrepen.</li>
	<li>Gebruik een 26-28 gauge naald spuit geven muizen een staart veneuze injectie van een fluorescerende vasculaire marker (Dextran, 100 μl van 20 mg/mL oplossing).</li>
	<li>Dierenarts oog zalf toepassen op beide ogen. Clip het dorsale oppervlak van het hoofd van het dier met kleine elektrische tondeuse. Toepassing van een ontharing crème voor 5 min. gebruik gaas sponzen te verwijderen van de crème en daarna spoelen met zout. Prep de schone hoofdhuid met 70% alcohol, met behulp van een wattenstaafje.</li>
	<li>Gebruik fijne Tang en schaar om een kleine middellijn huid incisie (10-20 mm) op de hoofdhuid om het onderliggende oppervlak van de dorsale schedel bloot te stellen. Gebruik de chirurgische zijde 5-0 om twee verblijf hechtingen in de huid aan elke kant van de incisie, maken een klep om de calvarium voor imaging bloot te stellen.</li>
	<li>Plaats de muizen op hun rug en de blootgestelde hoofdhuid in een glazen bodem schotel gevuld met Microscoop olie dompelen. Vervoer van het dier aan de mutiphoton imaging kamer.</li>
	<li>Plaats van het dier in het werkgebied van de microscoop met de calvarium op de glazen schotel boven de doelstelling geplaatst en dan bedek met een 37° C verwarming pad (dier moet worden beschermd tegen direct contact met hitte).</li>
</ol>5. in Vivo hoge resolutie beeldvorming van de muis Calvarium
<ol><li>Een omgekeerde confocal systeem aangepast voor multiphoton imaging gebruiken (Zie materialen tabel). De instructies van de fabrikant volgende tune een laser 2-foton 830 nm, plaats een 20 X W, NB 0.95 objectief in de Microscoop neus stuk en controleer de laser beam uitlijning. Opmerking: Rechtop Microscoop systemen worden meestal gebruikt voor deze studies, maar een omgekeerde multiphoton systeem kan ook worden gebruikt. In deze studie werd een aangepaste ontworpen atraumatische stereotaxic apparaat gebruikt. Hoewel er verschillende verkrijgbare stereotaxic apparaten voor rechtop Microscoop systemen, is er geen commercieel beschikbare stereotaxic apparaat voor een omgekeerde Microscoop systeem gericht op het beveiligen van de schedel van de muis. Als alternatief voor een aangepaste stereotaxic apparaat, kan de schedel worden beveiligd in positie boven de doelstelling met behulp van verschillende methoden van tape of lijm voor stabiliteit.</li>
	<li>Open een afbeelding acquisitie software. In de "overname-instellingen" Controleer paneel als een directionele scanmodus is geselecteerd. De snelheid van het scannen naar 4 µs/pixel, framesnelheid op 512 x 512 pixels instellen en zoom om 1,5. 20 X W NB 0.95 doelstelling selecteren in de lijst met beschikbare lenzen van de doelstelling overeenkomen met de lens geplaatst in het neusstuk.</li>
	<li>Toegang tot de "kleurstof lijst" van de "Image Acquisition" Configuratiescherm en selecteer "Twee-foton". Open het venster "Licht pad & kleurstoffen" en selecteer DM690-980 excitatie DM. Open de sluiter van de laser 2P door het controleren van het selectievakje in de Laser-Unit 2. Selecteer in het venster "Microscoop Controller" RDM690 spiegel.</li>
	<li>Selecteer "EPI LAMP", kies B/G epi-filter kubus en richten de doelstelling op het model om te visualiseren vasculaire stroom en de calvarium het beenmerg niche, met als referentie de bifurcatie voor de centrale ader (a) en de coronaire hechtdraad (b) (figuur 2A).</li>
	<li>
Het verzamelen van beelden met behulp van niet-descanned modus. Selecteer drie externe detectoren: bet detector1 voor het verzamelen van de SHG signaal van collageen (emissie filter - 430/100 nm), GaAsP detector2 verzamelen GFP signaal (emissie filter - 525/50) en GaAsP detector3 voor het verzamelen van signaal van de TRITC-dextran (emissie filter - 605/90 nm).
	<ol>
<li>Uitvoeren van beeldvorming op een scanfrequentie van 4μs/pixel met geen gemiddeld om te minimaliseren van fototoxiciteit. Het verzamelen van beelden op een constante laser macht en detector winst aangepast voor het gebruik van het volledige dynamische bereik van de detector met minimale verzadiging.</li>
		<li>Aantal secties door de diepte van het weefsel (60 x 1 μm Z-stacks) ophalen in 6 regio's van de calvarium het beenmerg. Instellingen voor stap grootte van 1 μm gebruiken, zoom 1.5 en 512 x 512 pixels framegrootte (423 µm x 423 µm). Opmerking: Over het geheel genomen totale tijd die nodig is om het imago van een muis is 1-1,5 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. kwantitatieve analyse
<ol><li>Uitvoeren van de afbeelding kwantificatie en 3D-reconstructies met behulp van een speciale 3D / 4D beeld kwantificatie en visualisatie software volgens de aanwijzingen van de fabrikant (Zie Materialen tabel). Visualiseer interactief Z-stacks in 3D met behulp van maximale intensiteit projectie (MIP), alpha-mix of schaduw projectie volume rendering algoritmen.</li>
	<li>Segment GFP cellen met behulp van de "Spot Object segmentatie module". Stapel rekenkundige verwerking (kanaal aftrekken) om valse positieve graaf van GFP cellen (dit elimineert signaal van bot cellen weergeven van sterke fluorescentie in groene en rode kanalen) toepassing.</li>
	<li>Segmentatie van therapieën en bot oppervlakte met behulp van de module oppervlakte segmentatie uitvoeren Indien nodig, berekenen van afstanden van cellen naar een van de bovenstaande oppervlakken door toepassing van X-spanning algoritmen "afstand van plek naar oppervlakte" genoemd.</li>
</ol>

<ol><li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li>
<li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li>
<li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li>
<li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li>
<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een experimenteel ontwerp geoptimaliseerd om te bestuderen van de kinetiek van hematopoietische cellen engraftment door Intravital TL microscopie. In deze studie, werd de uitbreiding van myeloïde voorlopercellen in een WT BM of in een inkeping signalering van defecte BM gevolgd in het bot calvarium door volgende Lys-GFP positieve myeloïde cellen na BMT in RBPJWT of RBPJKO ontvangers. Deze aanpak wordt voorgesteld als een model dat kan worden toegepast om soortgelijke vragen te stellen, bijvoorbeel...

Intravital multiphoton fluorescentie microscopie (IVFM) is een krachtige beeldvormende techniek waarmee de hoge resolutie, real-time imaging van weefsels met diepte tot 1mm, afhankelijk van het weefsel. Wanneer toegepast op de calvarium van de muis, laat het observeren van het gedrag van de hematopoietische cellen binnen de BM in een niet-invasieve manier omhoog tot en met 60-100 μm11. Deze benadering wordt hier gebruikt om te bepalen van de kinetiek van de engraftment van normale myeloïde voorlopercellen in de BM van RBPJ knock-out muizen ontbreekt canonieke Notch signalering.
Recente werk van onze fractie aangetoond dat defecte canonieke Notch signalering in de BM communicatie leidt tot een myeloproliferatieve-achtige ziekte12. Verlies van Inkeping signalering werd verkregen door voorwaardelijke schrapping van het DNA-bindende domein van RBPJ, de kritische transcriptiefactor stroomafwaarts van canonieke uitsparing signalering, met behulp van de Mx1-Cre geïnduceerde recombinatie10. In deze studie werd de Mx1-Cre/RBPJlox/lox muizen model gebruikt. Voorwaardelijke schrapping van het DNA-bindende motief van RBPJ leidt tot het verlies van signalering van alle Notch receptoren. In het model van de Mx1-Cre, Cre expressie wordt gedreven door de promotor van de Mx1 geactiveerd bij toediening van polyI:C, resulterend in de inductie van verwijdering van de gerichte gen in cellen van het bloed zo goed zoals in stromale onderdelen van meerdere organen, met inbegrip van BM, de milt en de lever.
Mx1-Cre+/RBPJlox/lox en Mx1-Cre-/RBPJlox/lox muizen geïnduceerde met polyI:C (visualisering aangegeven als RBPJKO en RBPJWT, respectievelijk) dodelijk waren bestraald en met normale, wild type hematopoietische cellen getransplanteerd. Vanaf week 4 na de transplantatie, ontwikkeld RBPJKO ontvangers belangrijke leukocytose gevolgd door splenomegalie. Hoewel RBPJKO muizen gepresenteerd verhoogd percentage van myeloïde voorlopercellen in de BM tijdens week 8 na de transplantatie en op latere tijdstippen, openbaarde analyse van BM op weken 4 en 6 niet opvallende verschillen in hun myeloïde celinhoud in vergelijking met controle RBPJWT ontvangers. Deze observatie, samen met het feit dat de Mx1-Cre wordt uitgedrukt in verschillende hematopoietische organen, de vraag gesteld of de BM communicatie directe invloed gehad op de opening van het myeloproliferatieve fenotype.
Om te bepalen of de BM een kritieke eerste site van ziekte ontwikkeling was, werd IVFM van de muis calvarium gebruikt in combinatie met BM transplantatie (BMT), het model van de knock-out RBPJ, en een tracking systeem afkomst. Transgene muizen EGFP uiten onder de controle van de specifieke lysozym promotor (Lys-GFP)9 werden gebruikt om het verkrijgen van de donor cellen die tijdens BM imaging na BMT kon worden gevisualiseerd. Lysozym expressie is specifiek voor myeloïde cellen en Lys-GFP markeert cellen van de gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMP) voor de volwassen granulocyt-13.
IVFM van de BM op verschillende tijdstippen aangetoond dat Lys-GFP cellen homed op dezelfde manier naar de geadresseerden BM van RBPJWT en RBPJKO, maar uitgebreid en sneller geaccepteerd in de BM van RBPJKO ontvangers. Dit verschil was dramatisch op het eerdere tijdstip (week 2) en daalde na verloop van tijd (weken 4 en 6). Echter bij deze latere tijdstippen, evaluatie van het hematopoietische compartiment in de dezelfde ontvanger toonde een gestage toename in het aantal myeloïde cellen circuleren in de PB en gelokaliseerd in de milt van RBPJKO muizen, met vermelding van een verhoogde productie van cellen van de BM in de circulatie. Onderzoek van Lys-GFP cellen lokalisatie in het BM van getransplanteerde muizen op 6 weken bleek dat myeloïde cellen verder van de therapieën in de communicatie van de RBPJKO dan in het besturingselement woonden.
Collectief, de combinatie van IVFM met deze specifieke diermodellen geboden inzichten in de dynamiek van de engraftment van myeloïde cellen in de RBPJKO BM-communicatie. De proefopzet en kwantitatieve benadering hier beschreven wordt voorgesteld als een paradigma die kan worden toegepast om soortgelijke vragen. Bijvoorbeeld, kunnen het gebruik van andere cel specifieke afstamming bijhouden van modellen, zoals RAG1-GFP14 of Gata1-GFP15 muizen, naar aanleiding van het gedrag van lymfoïde of erythroid progenitorcellen, respectievelijk in de BM.

```html
<table><tbody><tr><td>Ketamine cocktail</td><td>IU School of Medicine</td><td></td><td>Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg</td></tr><tr><td>TRITC dextran</td><td>Tdb Consultancy</td><td>TD150-100mg</td><td>Andere kleur dextran kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Andis haartrimmer</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-323 75</td><td></td></tr><tr><td>Gaasje sponzen</td><td>Med Vet International</td><td>PK224</td><td>4-laags, 2 x 2</td></tr><tr><td>Nair ontharingscreme</td><td>Commerciële winkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoutoplossing</td><td>Med Vet International</td><td>RXSAL-POD1LT</td><td>0,9% natriumchloride polyfles</td></tr><tr><td>Insuline-sering</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td>28 g, 1/2 cc</td></tr><tr><td>Fijne pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>00108-11, 00109-11</td><td>rechte pincet, schuine pincet</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhouder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>5-0 zijdedraad</td><td>Fisher Scientific</td><td>MV-682</td><td>Ander niet-resorbeerbaar hechtdraad kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>WillCo- glazen bodemschaal</td><td>WillCo</td><td>GWSt-5040</td><td></td></tr><tr><td>Olie voor optische microscoop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxische stagesteun&nbsp;</td><td>IU School of Medicine</td><td>Aangepast ontwerp</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1000 confocale microscoopsysteem&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objectief&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klein verwarmingskussen</td><td>Commerciële winkel</td><td></td><td>Zoo Med reptiel verwarmingskussen</td></tr><tr><td>Imaris 8.1 beeldvormingssoftware</td><td>Bitplane</td><td></td><td>3/4 D Beeldvisualisatie en Analyse software</td></tr></tbody></table>
```

intravital fluorescent microscopie (ivfm) te combineren met genetische modellen om te studeren van engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Een groeiende hoeveelheid bewijs geeft aan dat normale Haematopoiese wordt geregeld door verschillende microenvironmental signalen in de BM, waaronder gespecialiseerde cellulaire niches modulerende kritische hematopoietische stamcellen (HSC) functies1,2. Inderdaad, een meer gedetailleerd beeld van de hematopoietische communicatie nu ontstaat, waarin het endosteale en de endothelial nissen vormen functionele eenheden voor de regulering van normale HSC en hun nakomelingen3,4,5 . Nieuwe studies is gebleken dat het belang van gerelateerde cellen, adipocytes en neuronale cellen in het onderhouden en reguleren van HSC functie6,7,8. Bovendien zijn er aanwijzingen dat cellen van verschillende geslachten, d.w.z. myeloïde en lymfoïde cellen, huis en wonen in specifieke niches communicatie in het BM. Echter, een volledige toewijzing van de BM-communicatie en de inzittenden is nog in volle gang.
Transgene muis stammen uiting lineage specifieke fluorescerende markers of muizen genetisch gemanipuleerde om gebrek aan geselecteerde moleculen in bepaalde cellen van de BM-niche zijn nu beschikbaar. Knock-out en afstamming bijhouden van modellen, in combinatie met de benaderingen van de transplantatie, bieden de mogelijkheid om te verfijnen van de kennis over de rol van specifieke "niche" cellen voor gedefinieerde hematopoietische populaties, zoals HSC, B-cellen, T-cellen, myeloïde cellen en erythroid cellen. Deze strategie kan verder worden Potentiation door de samenvoeging van het gebruik van twee-foton microscopie van de calvarium. Door middel van in vivo de beeldvorming van de hoge resolutie en 3D-weergave van de BM-calvarium, kunnen we nu juist de locatie waar specifieke hematopoietische deelverzamelingen thuis in de BM en evalueren van de kinetiek van hun expansie na verloop van tijd bepalen. Hier, worden Lys-GFP transgene muizen (markering myeloïde cellen)9 en RBPJ knock-out muizen (ontbreekt canonieke Notch signalering)10 gebruikt in combinatie met IVFM om te bepalen van de engraftment van myeloïde cellen een inkeping defecte BM communicatie.

Cohorten van 2 RBPJKO en 2 RBPJWT ontvangers waren beeld in een afzonderlijke imaging sessie op verschillende tijdstippen: 24 h en 2, 4 en 6 weken na de transplantatie van cellen van de BM Lys-GFP (werkstroom wordt geïllustreerd in figuur 1A).
In elke muis, werden de beelden verkregen uit 6 standaard regio's van de calvarium van BM, geïdentificeerd door hun positie ten opzichte van de bifurcatie voor de centrale...

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Het algemene doel van deze procedure is om de in vivo aanplant van getransplanteerde bloedcellen in de botmergnishen van de ontvanger te visualiseren en te meten. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de visualisatie van cellulaire processen zoals homering, expansie en lokalisatie naar verschillende botmergnishen van donorhematopoietische cellen na transplantatie mogelijk maakt. In combinatie met de ontwikkelde diermodellen kan deze aanpak helpen bij het definiëren van moleculaire paden die cruciaal zijn voor hematopoëtische celregeneratie.In tegenstelling tot histologie of andere beeldvormingstechnieken, maakt intravitale microscopie het mogelijk om cel-tot-cel interacties in een levend dier op cellulair niveau en in realtime vast te leggen. We besloten om deze methode te gebruiken om te bepalen of de beenmergomgeving de aanvankelijke plaats was van de ontwikkeling van de myeloproliferatieve ziekte veroorzaakt door verlies van Notch-signalering. Uitdagingen voor mensen die nieuw zijn in deze techniek zijn het minimaliseren van ademhalingsartefacten, optimaal positioneren en stabiliseren van het hoofd en het voorkomen van beeldverzadiging.Een tot twee uur voorafgaand aan

combining-intravital-fluorescent-microscopy-ivfm-with-genetic-models

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Monocyten zijn belangrijke regulatoren van aangeboren immuniteit en spelen een cruciale rol bij de vernieuwing van het perifere mononucleaire fagocytische systeem en in geval van ontsteking. Dit manuscript beschrijft de procedure van realtime beeldvorming van het muiscalvaria beenmerg om het mechanisme van monocytmobilisatie te bestuderen.

Tracking muisbeenmerg Monocyten<em&gt; In Vivo</em

Het protocol beschrijft een nieuw model voor een muis dijbeenraamkamer dat kan worden gebruikt om de beweging van cellen in het beenmerg in vivo te volgen. Intravitale multifotonfluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om drie componenten van het dijbeenmerg (vaatstelsel, collageenmatrix en neutrofielen) in de tijd te beeldvormen.

Dijbeen Window Chamber Model voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Tracking in het Muizen Bone Marrow

Een methode om verschillende gehumaniseerde beenmergnissen in muizen te creëren en te leven, wordt gepresenteerd. Op basis van de ondersteunende niche die door menselijke mesenchymale cellen is gecreëerd, induceert de toevoeging van menselijke endotheelcellen de vorming van menselijke vaten, terwijl de toevoeging van rhBMP-2 de vorming van chimerisch volwassen weefsel van humane muizen veroorzaakt.

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Dit protocol beschrijft de intrafemorale injectie van enkele hematopoëtische of leukemische stamcellen, waaronder gen-bewerkte cellen, in muizenxenotransplantaatmodellen, die niet alleen de snelle en veilige transplantatie van cellen mogelijk maken, maar ook seriële analyses van het beenmerg.

Vereenvoudigde intrafemorale injecties met levende muizen maken continue beenmerganalyse mogelijk

Intrafemorale injecties maken de implantatie van een klein aantal hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) mogelijk door de cellen direct in de beenmergholte te plaatsen. Hier beschrijven we een experimenteel protocol van intrafemorale injectie van menselijke HSPC's in immunodeficiënte muizen.

Intrafemorale injectie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen in immuungecompromitteerde muizen 

Intravitale microscopie maakt het mogelijk om dynamische biologische processen zoals weefselregeneratie en tumorontwikkeling te bestuderen. Het calvariale beenmerg, een zeer dynamisch weefsel, biedt inzicht in hematopoëse en vasculaire functie. Het gebruik van een biocompatibel 3D-geprint hoofdfixatie-implantaat maakt repetitieve longitudinale beeldvorming mogelijk, waardoor ons begrip van weefseldynamiek en de micro-omgeving van de tumor wordt verbeterd.

Intravitale longitudinale beeldvorming van vasculaire dynamiek in het calvariale beenmerg

Leer intravitale fluorescentiemicroscopie om hematopoëtische cel-engraftment in beenmergniches te bestuderen. Deze methode maakt real-time visualisatie van homing en expansie in levende dieren mogelijk.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches (Video) | JoVE Journal

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Meer video's verkennen