Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Het algemene doel van deze procedure is om de in vivo aanplant van getransplanteerde bloedcellen in de botmergnishen van de ontvanger te visualiseren en te meten. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de visualisatie van cellulaire processen zoals homering, expansie en lokalisatie naar verschillende botmergnishen van donorhematopoietische cellen na transplantatie mogelijk maakt. In combinatie met de ontwikkelde diermodellen kan deze aanpak helpen bij het definiëren van moleculaire paden die cruciaal zijn voor hematopoëtische celregeneratie.

In tegenstelling tot histologie of andere beeldvormingstechnieken, maakt intravitale microscopie het mogelijk om cel-tot-cel interacties in een levend dier op cellulair niveau en in realtime vast te leggen. We besloten om deze methode te gebruiken om te bepalen of de beenmergomgeving de aanvankelijke plaats was van de ontwikkeling van de myeloproliferatieve ziekte veroorzaakt door verlies van Notch-signalering. Uitdagingen voor mensen die nieuw zijn in deze techniek zijn het minimaliseren van ademhalingsartefacten, optimaal positioneren en stabiliseren van het hoofd en het voorkomen van beeldverzadiging.

Een tot twee uur voorafgaand aan de transplantatie, spuit een gelyseerd EGFP-muis met 70% ethanol. Gebruik vervolgens chirurgische schaar om een incisie te maken in de huid van elke poot rond de enkel en chirurgische pincetten om de huid en vacht samen te verwijderen om het schone spierweefsel bloot te leggen. Verwijder zoveel mogelijk spierweefsel uit de poten.

Snij vervolgens de botten bij de kniegewrichten en enkels en gebruik gaasjes om eventueel overgebleven spierweefsel van de femurs en tibiae te verwijderen. Spoel de schoongemaakte botten af in een zes-wellplaat bevattende DMEM gesupplementeerd met 10%FBS. Breng vervolgens alle vier achterpootbotten over in 10 milliliter koude EDTA in PBS in een mortel en verpletter de botten met een stamper.

Tritureer de beenmergcellen om een single-cel suspensie te verkrijgen en zeef de slurry door een 70 micron filter in een 15 milliliter centrifugeerbuisje. Spoel het filter af met twee tot drie milliliter PBS. Centrifugeer vervolgens de cellen en resuspendeer het pellet in 10 milliliter vers DMEM plus 10%FBS.

Voor de injectie, centrifugeer de celsuspensie en tel en pas de concentratie van cellen aan tot 1,5 keer 10 tot de zevende cellen per milliliter in IMDM zonder serum. Plaats de cellen op ijs. Vijf tot zes uur na de tweede dosis bestraling, injecteer drie keer 10 tot de zesde beenmergcellen in de staartvene van elk bestraalde ontvangerdier.

Voeg het juiste tijdstip na transplantatie toe. Plaats de verdovende ontvangermuis op een verwarmingskussen van 37 graden Celsius en bevestig het ontbreken van reactie op teenprik. Breng zalf aan op de ogen van het dier en toedien 100 microliter van de juiste fluorescente marker via de staartvene.

Gebruik vervolgens kleine elektrische clippers om het haar van de dorsale oppervlakte van het hoofd van het dier te verwijderen, gevolgd door het aanbrengen van een ontharingscreme. Verwijder na vijf minuten de crème met gaasjes en spoel eventuele resterende oplossing af met zoutoplossing. Desinfecteer de hoofdhuid met een met 70% ethanol doordrenkte wattenstaafje.

Gebruik vervolgens fijne pincetten en schaar om een 10 tot 20 millimeter middellijn huidincisië op de hoofdhuid te maken om het onderliggende dorsale schedeloppervlak bloot te leggen. Gebruik 5-0 chirurgische zijde om twee fixatienaalden aan elke kant van de incisie te plaatsen om een flap te creëren om het calvarium voor beeldvorming bloot te leggen. Breng een druppel olie aan op de blootgestelde schedel.

Met de muis in rugligging, dompel de blootgestelde schedel onder in een glazen bodemschaal gevuld met microscoop olie. Plaats vervolgens het dier op een multifoton beeldvormingsplatform met het calvarium boven het objectief en bedek het dier met een verwarmingskussen van 37 graden Celsius. Het is essentieel dat het hoofd in de juiste positie blijft gedurende de multifoton beeldverwerving.

Gebruik een stereotactisch apparaat of zet de muis vast met tape zoals gepast. Gebruik een omgekeerd confocale systeem gewijzigd voor multifoton beeldvorming, stem de twee foton laser af op 830 nanometer. Open vervolgens de geschikte software voor beeldverwerving.

Onder het menu voor verwervingsinstellingen, bevestig dat de eenrichtings scanmodus is geselecteerd en stel de scan snelheid in op vier microseconden per pixel, de beeldsnelheid op 512 bij 512 pixels en de zoom op 1,5. Selecteer de 20X watt in een 0,95 objectief. Open het venster met de kleurstoffenlijst en selecteer twee foton.

Selecteer vervolgens de RDM690 spiegel in het microscoopbesturingsvenster. In het lichtpad en het dice venster, selecteer de laser unit twee doos om te controleren of de twee foton lasersluiter open is. Selecteer EPI Lamp en kies de B/G EPI filter kubus.

Focus vervolgens het objectief op het specimen om de vasculaire stroom in het calvarium beenmergnis te visualiseren, met behulp van de bifurcatie van de centrale ader en de coronaire naad als referentiepunten. Gebruik de niet-gedescanneerde modus, selecteer drie externe detectoren en beeld het specimen af met een scan snelheid van vier microseconden per pixel zonder gemiddelde en een constante laservermogen en detectorversterking om het volledige dynamische bereik van de detector te benutten met minimale verzadiging. Na het verzamelen van een reeks secties door de diepte van het weefsel, opent u de geschikte toegewijde 3 tot 4D beeldkwantitatieve en visualisatiesoftware.

Visualiseer interactief de Z-stacks met behulp van het juiste 3D renderalgoritme volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik vervolgens de spot object segmentatie module om de GFP cellen te segmenteren en pas stack rekenkundige verwerking toe om de valse positieve GFP cellen in de groene en rode kanalen te elimineren. Gebruik ten slotte de oppervlakte segmentatie module om de segmentatie van het vaatwerk en botoppervlak te herstellen, waarbij X spanningsafstandsalgoritmen van spot naar oppervlak worden toegepast om de afstanden van de cellen naar elk van de distale opper