Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed

Het algemene doel van deze methodologie is om de opname van glucose en de bijbehorende transporter in verschillende monocyt-subpopulaties te meten. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen binnen het veld van de immunologie te beantwoorden, zoals: wat is het belang van het metabolisme van immuuncellen voor de uitkomst van ziekten? De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat ze snel zijn, eenvoudig uit te voeren zijn, geen reactief materiaal vereisen en slechts een klein volume bloed behoeven.

Plaats de bloedmonsters, verzameld in citraat ACD-B anticoagulantiebuizen, binnen één uur na afname in een biologische veiligheidskabinet. Voeg vervolgens 100 µL bloed van elk monster toe aan individuele polypropyleenbuisjes en behandel de cellen op ijs met twee milliliter 1X lyseringsoplossing, waarbij voorzichtig gepipetteerd wordt om te mengen. Centrifugeer de cellen na 15 minuten en volg dit met nog twee centrifugeringsstappen in wasbuffer.

Verwijder na de tweede wasbeurt met een pipet voorzichtig zoveel mogelijk van de supernatant en resuspendeer de pellets in 100 µL wasbuffer op ijs. Om de specifieke monocyten-subpopulaties te identificeren, worden de cellen gedurende 30 minuten op ijs in het donker gekleurd met vijf µL van de betreffende antilichamen per 100 µL cellen. Was de monsters na afloop van de incubatie twee keer met wasoplossing en fixeer de cellen met 200 µL 0,5% formaldehyde in PBS.

Analyseer vervolgens de cellen binnen 24 uur op een flowcytometer die in staat is om vier kleuren te detecteren. Om de glucoseopname van de monocyt-subpopulaties te beoordelen, brengt u 90 µL bloed van elk monster over in individuele polypropyleenbuisjes en voegt u 10 µL van het betreffende fluorescente glucose-analoog toe aan het bloed. Tik zachtjes tegen de buisjes om te mengen en dek de monsters af met aluminiumfolie.

Plaats de cellen vervolgens gedurende 15 tot 30 minuten bij 37 °C, gevolgd door directe overdracht naar ijs. Voeg daarna vier milliliter FACS lyseringsoplossing toe aan de buizen en centrifugeer de cellen. Voer vervolgens een tweede centrifugatie uit in wasbuffer.

Giet het supernatant af en kleur de cellen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker met de gewenste antilichamen. Was vervolgens de monsters in vier milliliter ijskoud wasbuffer, resuspendeer de pellets in 200 tot 300 microliters ijskoud PBS en analyseer de buisjes binnen 10 minuten. Gebruik voor flowcytometrische analyse eerst de ongekleurde en individueel gekleurde controlemonsters om de compensatie in te stellen.

Open vervolgens in de geschikte software voor single-cell analyse het eerste monster in een forward by side scatter plot en gate de monocyten zoals geïllustreerd. Dubbelklik daarna op de gegatete monocytenpopulatie en gate de CD3-negatieve populatie. Dubbelklik nu op de CD3-negatieve populatie en stel de x-as in om de CD14-kleuring weer te geven en de y-as om de CD16-kleuring weer te geven.

Vervolgens genereert u de juiste histogrammen om de opname van glucose of de betreffende transporter in een specifieke monocyt-subpopulatie te meten. Stel daarna, indien er gedefinieerde celpopulaties aanwezig zijn, de gate in met behulp van de controle FITC igG-monsters en bepaal het totale percentage CD14-positieve monocyten in elk monster. Hier wordt de initiële gating-strategie getoond voor het isoleren van de monocyten op basis van celverstrooiing en de uitsluiting van T-cellen door gating binnen de CD3-negatieve populatie.

De monocyten worden vervolgens gegated op basis van alleen CD14-expressie, of in combinatie met CD16 om de totale hoeveelheid monocyten of monocyten-subpopulaties te identificeren. Er kunnen verschillende populaties CD14-positieve Glut-1 glucose-transporter-positieve monocyten worden waargenomen, in het bijzonder in de circulerende witte bloedcellen van hiv-positieve personen. CD14-positieve Glut-1-positieve cellen kunnen ook worden waargenomen binnen specifieke monocyten-subsets bij hiv-niet-geïnfecteerde personen, hoewel deze populaties meer uitgesproken zijn bij hiv-positieve patiënten.

Zoals verwacht uit de expressiedata van glucosetransporteurs, wordt het glucose-analoog 2-NBDG eveneens in grotere hoeveelheden opgenomen door cellen van hiv-positieve individuen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in anderhalf uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de blootstelling aan licht in alle gebieden te beperken.

Na de opname van glucose-analogen kunnen cellen worden gekleurd met celoppervlak-antilichamen om specifieke immuunpopulaties te identificeren waarin u geïnteresseerd bent. Na de ontwikkeling kan deze methode worden gebruikt om te bepalen hoe hiv het metabolisme van immuuncellen beïnvloedt; het kan daarnaast worden verkend door andere onderzoekers in verschillende vakgebieden, zoals immunologie, virologie en kankeronderzoek. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het detecteren van glucosetransporter 1 en de glucoseopname in immuuncellen.

Vergeet niet dat bij het werken met infectieuze agentia de standaard veiligheidsprocedures moeten worden toegepast.