Name: Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Leer een flowcytometrische methode om glucose-opname en glucose-transporterexpressie te meten in monocytensubpopulaties uit volbloed. Dit protocol biedt snelle inzichten in immuuncelmetabolisme voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Australische Centrum voor HIV en Hepatitis Virologie Research (ACH 2) en een 2010 ontwikkelingsstoornissen subsidie ​​(CNIHR) van de Universiteit van Washington Center for AIDS Research (CFAR), een NIH gefinancierd programma onder award nummer AI027757 die wordt ondersteund door de volgende NIH Institutes en Centers (NIAID, NCI, NIMH, Nida, NICHD, NHLBI, NIA). CSP is een ontvanger van de CNIHR en ACH 2 subsidie. SMC is een ontvanger van een National Health en Medical Research Council of Australia (NHMRC) Principal Research Fellowship. De auteurs zeer erkentelijk voor de bijdrage aan het werk van het Victoriaanse operationele infrastructuur Support Program door de Burnet Institute ontvangen. Wij erkennen de hulp van Geza Paukovic en Eva Orlowski-Oliver uit de AMREP Flow Cytometry Core Faciliteit voor flowcytometrie training en technisch advies. Wij danken Angus Morgan voor media-coaching en organisatie van de video shoot. onze dankJesse Masson en Jehad Abdulaziz K. Alzahrani voor lab begeleiding tijdens de video shoot. Wij danken de inspanningen van Dr. David Simar aan de School of Medical Sciences, UNSW, Australië die kritisch methodologisch advies aangeboden. CSP danken <a href="http://www.nice-consultants.com/">www.nice-consultants.com</a> voor grafische overleg. AUTEURS &#39;BIJDRAGE: CSP bedacht het project, ontworpen en experimenten, geanalyseerd en geïnterpreteerd data, en schreef het manuscript. JJA geïnterpreteerd gegevens en schreef het manuscript. TRB schreef het manuscript. JMM geïnterpreteerd data, maakte kritische intellectuele suggesties, en het manuscript beoordeeld. SMC interpreteren van gegevens, maakte kritische intellectuele suggesties en het manuscript beoordeeld.

LET OP: HIV-geïnfecteerde en HIV-geïnfecteerde patiënten werden gerekruteerd uit de Infectious Diseases Unit van The Alfred Hospital in Melbourne, VIC, Australië en uit de lokale gemeenschap, respectievelijk. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers, en het onderzoek werd goedgekeurd door het Comité Alfred Hospital Research and Ethics. 1. GLUT1 celoppervlak Detection op monocyten en monocyt subpopulaties <ol><li> Het verzamelen van bloed in citraat ACD-B antistollingsmiddel buizen en beginnen de experimenten in een biologisch veiligheidskabinet binnen 1 uur van de collectie. </li><li> Voeg 100 pl bloed polypropyleenbuizen. Voeg 2 ml van 1x lyserende oplossing (zie Materials Table) buizen, terwijl op ijs, pipetteren voorzichtig te mengen. Incubeer gedurende 15 min op ijs. Centrifugeer bij 220 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Decanteren en tweemaal wassen met ongeveer 2-4 ml wasoplossing (0,5% BSA in 1x PBS) toevoegen en centrifugeren bij 220 g gedurende 5 min. </li><li> Gebruik een pijptte voorzichtig verwijderen zoveel mogelijk van de wasoplossing mogelijk. Plaats de buisjes op ijs en opnieuw te schorten in 100 pl wasoplossing. </li><li> Identificeren specifieke monocyten subpopulaties vlekken cellen met de volgende hoeveelheid antilichamen per 100 gl celsuspensie bereid in stap 1.4: 5 pl anti-CD3-PE, 5 pl anti-CD14-APC, 5 pl anti-CD16-PECy7, 5 gl GLUT1 FITC of IgG2b-FITC (isotype controle tube). </li><li> Plaats op ijs gedurende 30 minuten in het donker. Was 2 maal met wasoplossing. Vast met 200-300 gl 0,5% formaldehyde in 1 x PBS. </li><li> Analyseren op een flowcytometer opsporen van 4 kleuren binnen 24 uur in de volgende excitatie- en emissiegolflengte: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10. </li></ol> 2. glucoseopname door Monocyten <ol><li> Pipetteer 90 ul van bloed verzameld in stap 1.1 in polypropyleen buizen. Voeg 10 ul van een 14,60 pM 2-NBDG werkoplossingde 90 pl bloed (1,46 mM uiteindelijke concentratie) en flick voorzichtig te mengen. Het is cruciaal om 2-NBDG blootstelling aan licht te beperken door het bedekken buizen met aluminiumfolie. </li><li> Incubeer bij 37 ° C in het donker gedurende 15-30 minuten en daarna onmiddellijk plaats op ijs. Voeg 4 ml 1x FACS lyserende oplossing voor buizen terwijl op ijs. Centrifugeer bij 220 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Was eenmaal door toevoeging van 4 ml wasoplossing (0,5% BSA in 1 x PBS). Centrifugeer bij 220 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Giet en leg ze op ijs. </li><li> Vlek cellen met antilichamen: 5 pl anti-CD3-PE, 5 pl anti-CD14-APC en 5 pl anti-CD16-PECy7. Meng en plaats op ijs gedurende 30 minuten in het donker. LET OP: In deze periode ervoor te zorgen dat de flowcytometer is direct klaar voor analyse. Het verwerven van cellen in de volgende excitatie en emissie golflengte: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660). </li><li> Voeg 4 ml ijskoude wasbuffer (0,5% BSA in 1x PBS) buizen.Was eenmaal door centrifugatie bij 220 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Giet en voeg 200-300 ul ijs oude PBS en blijf op ijs in het donker (bedekt met aluminiumfolie). Analyseren op een flowcytometer binnen 10 min met behulp van excitatie- en emissiegolflengte instelling als in stap 2,4. </li></ol> 3. Data Acquisition and Analysis OPMERKING: Kennis van flowcytometrie en gegevensanalyse verondersteld. <ol><li> Met een flow cytometer kan tenminste 4-kleuranalyse, ingesteld compensatie behulp ongekleurd en gekleurd individueel monsters. OPMERKING: Single kleuring met een FITC-gemerkt CD4 en CD14 kunnen worden gebruikt voor GLUT1 en 2-NBDG compensatie. </li><li> Opzetten en label passende ramen vóór het verwerven van monsters. Teken een hek rond de monocyten populatie, en het verwerven van 100.000 tot 300.000 gebeurtenissen per monster bij gemiddelde tarief. 50.000 evenementen per compensatie monster is voldoende. OPMERKING: Compensatie kan voorafgaand worden uitgevoerd om te proevenverwerving of in single cell analyse software, volgens standaardprocedures. </li><li> Export en gegevens op te slaan in een geschikte locatie. Openstellen single cell analyse software zoals FlowJo of andere analyse software (Aanvullende Figuur 1) en drag-and-drop monsters als beschreven (Supplemental figuur 2). </li><li> Dubbelklik op het bestand (Aanvullende figuur 3) te openen. Teken een cirkel poort monocyten gebaseerd op voorwaartse en zijwaartse verstrooiing eigenschappen zoals getoond in figuur 1A en figuur 4 Supplemental. Dubbelklik op de monocyten populatie. Observeer en teken een kader rond de CD3 - populatie (Supplemental figuur 4). </li><li> Dubbelklik op het CD3 - bevolking. Om te observeren de monocyten subpopulaties selecteren CD14-APC op de &#39;x-as, en CD16-PECy7 op de&#39; y&#39;- as, en dienovereenkomstig te etiketteren (Aanvullende Figuur 5). </li><li> Indien er geen duidelijkepositieve en negatieve populaties, het meten van de expressie van GLUT1 of 2-NBDG opname in het specifieke monocyten subpopulaties. Bepaal de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten (MFI) van GLUT1 en 2-NBDG door het aftrekken van het isotype en geen 2-NBDG achtergrond (Supplemental figuur 6). </li><li> Wanneer gedefinieerde populaties bestaan, gebruikt de IgG2b-FITC aan de gate stellen en bepaal het percentage positieve cellen (figuur 3). LET OP: Gebruik deze procedure om de totale CD14 + monocyten te analyseren. Aangezien 2-NBDG opname doorgaans wordt gekenmerkt door een verschuiving in fluorescentie intensiteiten gegevens blijkt het best uit MFI en histogrammen. </li></ol>

<ol><li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).</li>
<li>Woollard, K. J., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+in+atherosclerosis%3A+subsets+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions.</a> Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).</li>
<li>Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages+in+cancer%3A+development+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages in cancer: development and functions.</a> Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).</li>
<li>Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+as+regulators+of+inflammation+and+HIV-related+comorbidities+during+cART%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART.</a> J Immunol Res. 2014, 569819(2014).</li>
<li>Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Metabolism+in+T+Cells+and+Monocytes%3A+New+Perspectives+in+HIV+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis.</a> EBioMedicine. , (2016).</li>
<li>Cheng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-+and+HIF-1alpha-mediated+aerobic+glycolysis+as+metabolic+basis+for+trained+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity.</a> Science. 345, 1250684(2014).</li>
<li>Maratou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transporter+expression+on+the+plasma+membrane+of+resting+and+activated+white+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells.</a> Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).</li>
<li>Freemerman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+macrophages%3A+glucose+transporter+1+%28GLUT1%29-mediated+glucose+metabolism+drives+a+proinflammatory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype.</a> J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).</li>
<li>Gonnella, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi+sarcoma+associated+herpesvirus+%28KSHV%29+induces+AKT+hyperphosphorylation%2C+bortezomib-resistance+and+GLUT-1+plasma+membrane+exposure+in+THP-1+monocytic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line.</a> J Exp Clin Cancer Res. 32, 79(2013).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transporter+1-expressing+proinflammatory+monocytes+are+elevated+in+combination+antiretroviral+therapy-treated+and+untreated+HIV%2B+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects.</a> J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).</li>
<li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical%2C+intermediate%2C+and+nonclassical+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118, e16-e31 (2011).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116, e74-e80 (2010).</li>
<li>Belge, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proinflammatory+CD14%2BCD16%2BDR%2B%2B+monocytes+are+a+major+source+of+TNF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF.</a> J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).</li>
<li>Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cytokine+expression+in+human+blood+monocyte+subpopulations%3A+a+polymerase+chain+reaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis.</a> Blood. 87, 373-377 (1996).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD14%2B+CD16%2B+blood+monocytes%3A+their+role+in+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation.</a> J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZiegler-Heitbrock%2C+L+%22Macrophages%3A+Biology+and+Role+in+the+Pathology+of+Diseases%22">Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases</a>. , Springer. 3-36 (2014).</li>
<li>Dimitriadis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+glucose+transport+and+its+regulation+by+insulin+in+human+monocytes+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry.</a> Cytometry A. 64, 27-33 (2005).</li>
<li>Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitative+glucose+transporter+gene+expression+in+human+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+macrophages%3A+a+role+for+GLUT+isoforms+1%2C+3%2C+and+5+in+the+immune+response+and+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation.</a> Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).</li>
<li>Stibenz, D., Buhrer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+L-selectin+surface+expression+by+various+leukocyte+isolation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures.</a> Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).</li>
<li>Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+regulation+of+glucose+transport+in+a+monocyte-macrophage+cell+line%3A+Glut-3+affinity+for+glucose+is+enhanced+during+the+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst.</a> Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).</li>
<li>Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin-mediated+glucose+uptake+in+monocytes+of+short+children+with+intrauterine+growth+retardation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation).</a> Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).</li>
<li>Yoshioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescent+derivative+of+glucose+applicable+to+the+assessment+of+glucose+uptake+activity+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).</li>
<li>Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+transport+of+a+fluorescent+glucose+analogue+by+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glucose+metabolic+activity+is+associated+with+CD4%2B+T-cell+activation+and+depletion+during+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection.</a> AIDS. 28, 297-309 (2014).</li>
<li>Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+regulates+T+cell+activation%2C+differentiation%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions.</a> Frontiers in immunology. 6, (2015).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+glucose+metabolism+in+CD4+and+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+reviews+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells.</a> International reviews of immunology. , 1-12 (2015).</li>
<li>Palmer, C. S., Crowe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+monocyte+metabolism+impact+inflammation+and+aging+during+chronic+HIV+infection%3F%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+research+and+human+retroviruses%22%5BJournal%5D)">How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?</a> AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).</li>
<li>McFadden, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stress+is+a+barrier+to+Epstein-Barr+virus-mediated+B-cell+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).</li>
<li>Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentations+of+glucose+uptake+and+glucose+transporter-1+in+macrophages+following+thermal+injury+and+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice.</a> Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Oxidation+Is+Critical+for+CD4%2B+T+Cell+Activation+in+a+Mouse+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus.</a> Journal of immunology. , 80-90 (2016).</li>
<li>Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+metabolism+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">T-cell metabolism in autoimmune disease.</a> Arthritis research & therapy. 17, 29(2015).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+CD4%2B+T+cell+metabolism+reverses+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus.</a> Science translational medicine. 7, 274ra218(2015).</li>
<li>Barbera Betancourt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Phosphoinositide+3-Kinase+p110delta+Does+Not+Affect+T+Cell+Driven+Development+of+Type+1+Diabetes+Despite+Significant+Effects+on+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production.</a> PloS one. 11, e0146516(2016).</li>
<li>Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitative+glucose+transporters%3A+Implications+for+cancer+detection%2C+prognosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%3A+clinical+and+experimental%22%5BJournal%5D)">Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment.</a> Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).</li>
<li>Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+pathogenicity+and+virion+production+are+dependent+on+the+metabolic+phenotype+of+activated+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells.</a> Retrovirology. 11, 98(2014).</li>
<li>Taylor, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D1+Couples+CD4%2B+T+Cell+Activation+to+c-Myc-Dependent+Deoxyribonucleotide+Pool+Expansion+and+HIV-1+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication.</a> PLoS Pathog. 11, e1004864(2015).</li>
<li>Loisel-Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glut1-mediated+glucose+transport+regulates+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Role+and+Characterization+of+Immunometabolism%3A+Relevance+to+HIV+Pathogenesis%2C+Serious+Non-AIDS+Events%2C+and+a+Cure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure.</a> J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven protocol Gegevens een eenvoudige methode om glucose transporter expressie en fluorescerende glucose analoge opname door monocyten en monocyt subpopulaties in volbloed onderzocht. Door beoordeling 2-NBDG opname in volbloed, deze techniek maakt soortgelijke omstandigheden als in vivo. Een eerdere studie onderzocht 6-NBDG opname in monocyten gescheiden van volbloed door dichtheidscentrifugatie 17. Echter, deze studie niet onderzocht monocyten subpopulaties en scheiding van monocyten u...

Monocyten zijn een belangrijk onderdeel van de menselijke aangeboren immuunsysteem die snel gemobiliseerd naar plaatsen van infectie en ontsteking 1. Activatie van monocyten is kritisch voor het beperken van acute schade door ziekteverwekkers en is centraal in de pathogenese van een aantal chronische ziekten, waaronder atherosclerose 2, 3 kanker, HIV en 4,5. Het metabolisme van rustende en geactiveerde monocyten verschilt dramatisch, met rustende monocyten gebruik oxidatief metabolisme en geactiveerde monocyten gebruikmaking glycolytische stofwisseling (dwz fermentatie van glucose tot lactaat) 6. Activatie van monocyten induceert expressie van glucose transporters die zorgt voor verhoogde glucoseopname voor glycolytische stofwisseling 7. Monocyt glucose transporter 1 (GLUT1) is een dergelijke transporteur opgereguleerd tijdens activatie en zijn expressie is aangetoond dat leidt tot de productie van pro-inflammatoire cytokines in vitro en in vetweefsel van obese muizen 8. Infectie van een monocytische cellijn door Kaposi-sarcoom geassocieerd herpesvirus leidt tot cellulaire opregulatie van GLUT1 9, en we onlangs bleek dat tijdens chronische hiv-infectie een verhoogd percentage van GLUT1 uitdrukken monocyten tijdens onbehandeld en antiretrovirale therapie behandeld infectie 10 aanwezig zijn. Samengevat, deze studies tonen aan dat glucose en glycolytische metabolisme door monocyten zijn belangrijke aspecten van vele ontstekingsziekten. Dus een eenvoudige methode om monocyten GLUT1 expressie en glucose meten die homeostase en ontstekingsziekte waarschijnlijk van nut zijn voor een groot aantal onderzoekers. Menselijke monocyten zijn heterogeen, wordt samengesteld uit drie verschillende subsets die door differentiële expressie van het celoppervlak markers CD14 en CD16 11,12 kunnen worden onderzocht. Classical monocyten drukken een hoog niveau van CD14, maar niet uit te drukken CD16 (CD14 ++ CD16 -), tussenproduct monocyten een hoog niveau van CD14 en een tussenliggend niveau van CD16 (CD14 ++ CD16 +) en niet-klassieke monocyten een lage CD14 en een hoog niveau van CD16 (CD14 + CD16 ++). Monocyten die CD16 tot expressie zogenaamde CD16 + monocyten, die vergeleken met CD16 - monocyten hoge expressie van inflammatoire cytokines en het vermogen om beter te presenteren antigenen 13,14. Ongeveer 10% van de monocyten CD16 tijdens homeostase met hogere percentages waargenomen gedurende 15 inflammatie. Monocyt subpopulaties houden bepaalde ziektetoestanden en mogelijk bruikbare biologische markers van de ziekte en ziekteprogressie 16. Ons doel was om een ​​methode die glucose transporter expressie en glucose-opname door humane monocyten en monocyt subpopulaties onder omstandigheden zo dicht mogelijk bij phy kan meten identificerensiological voorwaarden mogelijk. Eerdere studies gemeten monocyten glucose transporter expressie en opname van glucose 17,18, hoewel deze methoden geïsoleerde monocyten die kunnen hebben veranderd eiwitexpressie in vergelijking met fysiologische omstandigheden 19 onderzocht, en geen eerdere studie heeft de menselijke monocyten subpopulaties onderzocht. Gebruik van multi-parametrische flowcytometrie beschrijven we een werkwijze glucose transporter expressie en opname van de fluorescente glucose analoge 2-NBDG van totale monocyten en monocyt subpopulaties onderzocht (op basis van CD14 en CD16 expressie) binnen het gehele ongemanipuleerd bloed.

<table><tbody><tr><td>VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulantbuizen</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>455094</td><td></td></tr><tr><td>5 ml steriele polypropyleenbuizen</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit runder serum (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyde oplossing</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS lysing oplossing (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>Verdun BD FACS lysing oplossing 1/10 met gedeïoniseerd water voor werkconcentratie (bewaar tot 1 week bij 4 &deg;C)</td></tr><tr><td>anti-CD3-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555340</td><td></td></tr><tr><td>anti CD14-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555399</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16-PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557744</td><td></td></tr><tr><td>anti-Glut1-FITC</td><td>R &amp; D Systems</td><td>FAB1418F</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b-FITC</td><td>R &amp; D Systems</td><td>IC0041F</td><td></td></tr><tr><td>2-NBDG</td><td>Life technologies</td><td>N13195</td><td>Suspensie 5 mg van 2-NBDG in 1 ml gedeïoniseerd water om een 14.60 mM stock oplossing te maken (bewaar tot 6 maanden bij 4 &deg;C). Om de werkconcentratie van 2-NBDG te maken, verdun stock 1/100 met 1x DPBS. Dek af met folie. (bewaar tot 1 week bij 4 &deg;C)</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline (1x)</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td>Voor het maken van wasoplossing, voeg 0,5 g BSA toe per 100 ml DPBS (bewaar tot 2 weken bij 4 &deg;C)</td></tr></tbody></table>

een eenvoudige flowcytometrische methode om te meten glucose opname en glucose transporter expression voor monocyten subpopulaties in volbloed

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocyten zijn aangeboren immuuncellen die kan worden geactiveerd door pathogenen en ontsteking geassocieerd met bepaalde chronische ontstekingsziekten. Activatie van monocyten induceert effectorfuncties en een gelijktijdige verschuiving van oxidatieve naar glycolytische stofwisseling die gepaard gaat met verhoogde glucose transporter expressie. Deze verhoogde glycolytische stofwisseling wordt ook waargenomen voor de geoefende immuniteit van monocyten, een vorm van aangeboren immunologisch geheugen. Hoewel in vitro onderzoek protocollen glucose transporter expressie en glucose opname door monocyten zijn beschreven, zijn geen onderzocht door multi-parametrische flowcytometrie in volbloed. We beschrijven een multi-parametrische flowcytometrische protocol voor het meten van fluorescentie glucose analoge 2-NBDG opname in volbloed door totale monocyten en de klassieke (CD14 ++ CD16 -), tussenproduct (CD14 ++ CD16 +) en niet-klassieke ( CD14 + CD16 ++) monocytsubpopulaties. Deze methode kan worden gebruikt om glucose transporter expressie en glucoseopname voor totale monocyten en monocyt subpopulaties bij homeostase en ontstekingsziekten onderzocht en kunnen eenvoudig worden aangepast om glucoseopname andere leukocyten en leukocyten subpopulaties binnen bloed onderzocht.

Compensatie moet worden uitgevoerd voor individuele fluorochromen fluorescentie spillover voorkomen. Monocyten worden eerst verrijkt door venstertijd gebaseerd op voorwaartse en zijwaartse verstrooiing. De plots gepresenteerde vertegenwoordigers van ten minste zes onafhankelijke experimenten uitgevoerd op volbloed dat bij zes of meer deelnemers zoals eerder beschreven 10 Figuur 1A toont de eerste gating van monocyten door cel verstrooiing en uitsluiting van T-...

Monocyten zijn integrale componenten van het menselijke aangeboren immuunsysteem die afhankelijk zijn van glycolytisch metabolisme wanneer geactiveerd. We beschrijven een flowcytometrieprotocol om glucosetransporterexpressie en glucoseopname door totale monocyten en monocytensubpopulaties in vers volbloed te meten.

Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Het algemene doel van deze methodologie is om de opname van glucose en de bijbehorende transporter in verschillende monocyt-subpopulaties te meten. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen binnen het veld van de immunologie te beantwoorden, zoals: wat is het belang van het metabolisme van immuuncellen voor de uitkomst van ziekten? De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat ze snel zijn, eenvoudig uit te voeren zijn, geen reactief materiaal vereisen en slechts een klein volume bloed behoeven.Plaats de bloedmonsters, verzameld in citraat ACD-B anticoagulantiebuizen, binnen één uur na afname in een biologische veiligheidskabinet. Voeg vervolgens 100 µL bloed van elk monster toe aan individuele polypropyleenbuisjes en behandel de cellen op ijs met twee milliliter 1X lyseringsoplossing, waarbij voorzichtig gepipetteerd wordt om te mengen. Centrifugeer de cellen na 15 minuten en volg dit met nog twee centrifugeringsstappen in wasbuffer.Verwijder na de tweede wasbeurt met een pipet voorzichtig zoveel mogelijk van de supernatant en resuspendeer de pellets in 100 µL wasbuffer op ijs. Om de specifieke monocyten-subpopulaties te identificeren, worden de cellen gedurende 30 minuten op ijs in het donker gekleurd met vijf µL van de betreffende antilichamen per 100 µL cellen. Was de monsters na afloop van de incubatie twee keer met wasoplossing en fixeer de cellen met 200 µL 0,5% formaldehyde in PBS.Analyseer vervolgens de cellen binnen 24 uur op een flowcytometer die in staat is om vier kleuren te detecteren. Om de glucoseopname van de monocyt-subpopulaties te beoordelen, brengt u 90 µL bloed van elk monster over in individuele polypropyleenbuisjes en voegt u 10 µL van het betreffende fluorescente glucose-analoog toe aan het bloed. Tik zachtjes tegen de buisjes om te mengen en dek de monsters af met aluminiumfolie.Plaats de cellen vervolgens gedurende 15 tot 30 minuten bij 37 °C, gevolgd door directe overdracht naar ijs. Voeg daarna vier milliliter FACS lyseringsoplossing toe aan de buizen en centrifugeer de cellen. Voer vervolgens een tweede centrifugatie uit in wasbuffer.Giet het supernatant af en kleur de cellen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker met de gewenste antilichamen. Was vervolgens de monsters in vier milliliter ijskoud wasbuffer, resuspendeer de pellets in 200 tot 300 microliters ijskoud PBS en analyseer de buisjes binnen 10 minuten. Gebruik voor flowcytometrische analyse eerst de ongekleurde en individueel gekleurde controlemonsters om de compensatie in te stellen.Open vervolgens in de geschikte software voor single-cell analyse het eerste monster in een forward by side scatter plot en gate de monocyten zoals geïllustreerd. Dubbelklik daarna op de gegatete monocytenpopulatie en gate de CD3-negatieve populatie. Dubbelklik nu op de CD3-negatieve populatie en stel de x-as in om de CD14-kleuring weer te geven en de y-as om de CD16-kleuring weer te geven.Vervolgens genereert u de juiste histogrammen om de opname van glucose of de betreffende transporter in een specifieke monocyt-subpopulatie te meten. Stel daarna, indien er gedefinieerde celpopulaties aanwezig zijn, de gate in met behulp van de controle FITC igG-monsters en bepaal het totale percentage CD14-positieve monocyten in elk monster. Hier wordt de initiële gating-strategie getoond voor het isoleren van de monocyten op basis van celverstrooiing en de uitsluiting van T-cellen door gating binnen de CD3-negatieve populatie.De monocyten worden vervolgens gegated op basis van alleen CD14-expressie, of in combinatie met CD16 om de totale hoeveelheid monocyten of monocyten-subpopulaties te identificeren. Er kunnen verschillende populaties CD14-positieve Glut-1 glucose-transporter-positieve monocyten worden waargenomen, in het bijzonder in de circulerende witte bloedcellen van hiv-positieve personen. CD14-positieve Glut-1-positieve cellen kunnen ook worden waargenomen binnen specifieke monocyten-subsets bij hiv-niet-geïnfecteerde personen, hoewel deze populaties meer uitgesproken zijn bij hiv-positieve patiënten.Zoals verwacht uit de expressiedata van glucosetransporteurs, wordt het glucose-analoog 2-NBDG eveneens in grotere hoeveelheden opgenomen door cellen van hiv-positieve individuen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in anderhalf uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de blootstelling aan licht in alle gebieden te beperken.Na de opname van glucose-analogen kunnen cellen worden gekleurd met celoppervlak-antilichamen om specifieke immuunpopulaties te identificeren waarin u geïnteresseerd bent. Na de ontwikkeling kan deze methode worden gebruikt om te bepalen hoe hiv het metabolisme van immuuncellen beïnvloedt; het kan daarnaast worden verkend door andere onderzoekers in verschillende vakgebieden, zoals immunologie, virologie en kankeronderzoek. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het detecteren van glucosetransporter 1 en de glucoseopname in immuuncellen.Vergeet niet dat bij het werken met infectieuze agentia de standaard veiligheidsprocedures moeten worden toegepast.

a-simple-flow-cytometric-method-to-measure-glucose-uptake-glucose

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit protocol beschrijft een snelle techniek om de translocatie van GLUT4 kwantificeren van het cytoplasma naar de plasmamembraan van de cellen door flowcytometrie.

Kwantitatieve meting van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan door middel van flowcytometrie

This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

This video demonstrates a flow cytometry-based technique using two fluorochromes to identify CD4+ and CD8+ T cells, γδ T cells, B cells, natural killer (NK) cells, and monocytes in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Upon incubating the cells with fluorochrome-conjugated antibodies against the surface markers, the cell subsets are identified using an optimal flow cytometric gating strategy.

A Flow Cytometry Assay to Identify Immune Cell Subsets in Peripheral Blood Mononuclear Cells

Deze studie vergelijkt twee verschillende methoden voor het isoleren van humane monocyten voor het verkrijgen van in vitro dendritische cellen (DC's). Monocyten worden geselecteerd door adhesie of negatief verrijkt door magnetische scheiding. De monocytenopbrengst en levensvatbaarheid, samen met de levensvatbaarheid van MDDC, proliferatie en CD11c/CD14-oppervlaktemarkeringsuitdrukking, zullen worden vergeleken tussen beide methoden.

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Dit protocol geeft een analyse van de macrofage subpopulaties in het centraal zenuwstelsel van het volwassen muis door middel van flowcytometrie en is nuttig voor het bestuderen van meerdere markers die door deze cellen worden uitgedrukt.

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Een stroom cytometry gebaseerde cellulaire bindende test wordt beschreven die voornamelijk als een instrument voor screening gebruikt wordt ter identificatie van stoffen die een remmende werking van de binding van een fluorescently geëtiketteerde CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) aan de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay te identificeren van verbindingen die Binding van Fluorescently-geëtiketteerden CXC Chemokine Ligand 12 aan CXC Chemokine Receptor 4 verstoren

Hier presenteren we een protocol voor het karakteriseren van monocyt deelverzamelingen door volbloed stroom cytometry. Het gaat hierbij om overzichten hoe gate de subsets kunt weergeven en beoordelen van hun uitdrukking van oppervlakte markers en geven een voorbeeld van de beoordeling van de uitdrukking van de M1 (inflammatoire) en M2 markers (ontstekingsremmer).

Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

Hier presenteren we een geïntegreerde protocol die maatregelen monocyt subpopulatie mensenhandel onder stroom in vitro door gebruik van specifieke oppervlakte markers en confocal fluorescentie microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt om te verkennen sequentiële werving stappen ook over andere subtypen van de leukocyten met behulp van andere specifieke oppervlakte markers profile.

Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro

Hier presenteren we twee protocollen om microgliale inslokking van vGLUT1-positieve synapsen en pHRodo Red-gelabelde ruwe synaptosomen te kwantificeren met behulp van flowcytometrie.

Kwantificering van microgliale inslokking van synaptisch materiaal met behulp van flowcytometrie

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

Leer een flowcytometrische methode om glucose-opname en glucose-transporterexpressie te meten in monocytensubpopulaties uit volbloed. Dit protocol biedt snelle inzichten in immuuncelmetabolisme voor immunologisch onderzoek.

Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed (Video) | JoVE Journal

Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed

Meer video's verkennen