Name: In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Leer in vitro transcriptie-assays voor moleculaire biologie en transcriptieregulatie. Deze methode maakt directe visualisatie van transcriptieproducten mogelijk en helpt bij het testen van antibacteriële agentia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk erkent een Faculty Early Career Grant van de Universiteit van Newcastle (CM).

Let op: Experimenten gepaard met het gebruik van de radioactieve isotoop 32 P en geen werk moet worden verricht voordat alle passende veiligheidsmaatregelen voorwaarden is voldaan. In het algemeen het personeel zijn verplicht om een ​​veiligheids-cursus bij te wonen en te ondergaan onder toezicht praktijk voorafgaand aan experimenten met behulp van radioactieve reagentia. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (thermoluminescente dosimeter, veiligheidsbril, handschoenen, straling kamer lab jassen, volledige lengte broek, dichte schoenen) bij het uitvoeren van de reactie. 1. Bereiding van proefmaterialen <ol><li> Het verkrijgen van de Eiwitten Vereiste voor transcriptie assay. <ol><li> Voor het hier beschreven experiment overproduceren en zuiveren E. coli RNAP in het laboratorium zoals beschreven 11, of het verkrijgen van een commerciële bron (Materials List). Opmerking: Beide soortgelijke resultaten. Andere werkwijzen voor het zuiveren van natieve of affiniteit gelabelde RNAP kan ook worden gebruikt 12,13. Sigma / NUSA factoren kunnen worden verkregen als described in eerdere werk 14,15. </li></ol></li><li> Bereiding van diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water Let op: U kunt RNase-free water worden verkregen uit commerciële bronnen (Materials List). <ol><li> Voeg 1 ml met diethylpyrocarbonaat (DEPC) tot 1 liter gezuiverd water (0,1% v / v) en meng gedurende de nacht. </li><li> Autoclaaf DEPC water en tips tweemaal. </li></ol></li><li> DNA Template Voorbereiding <ol><li> Zuiver plasmide pSG1154 16 en / of 17 pIA226 met een plasmide zuivering kit (Materials List) volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Om de sjabloon voor run-off transcriptie assays versterken (een 360 bp fragment dat de P Xyl promoter regio), assembleren een PCR-reactie op ijs met 25 pi 2x PCR-mix (Materials List), 2 pi van elk van de primers (5 uM) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(voorwaarts) en 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (omgekeerde), 1 ui pSG1154 plasmide preparation (250 pm) en 20 pi gezuiverd water). <ol><li> Of als alternatief, voor enkele ronde transcriptie assays, versterken van een 447 bp fragment dat de λ P R promotorregio van pIA226 17. Stel een PCR reactie op ijs met behulp van 25 pi 2x PCR mix, 2 pi elk van de primers (5 uM): 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(voorwaarts) en 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (omgekeerde), 1 gl pIA226 17 plasmide voorbereiding (250 pm) en 20 pi gezuiverd water). Opmerking: Dit sjabloon mist cytosine tot 26 nt positie, dat is de 26 ste nucleotide van de transcriptie startplaats. Daarom transcriptie met deze sjabloon initiatie, promotor klaring mogelijk en blokkering bij 26 nt een stabiele transcriptie elongatie complex (EG) vormen wanneer alleen ATP, UTP en GTP in het reactiemengsel aanwezig zijn. </li></ol></li><li> Opzetten van een PCR-reactie onder de volgende omstandigheden: 95 °; C gedurende 30 sec, 50 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 30 seconden, het herhalen van 30 cycli. </li><li> Zuiver het product met behulp van een PCR clean-up kit (Materials List) volgens de instructies van de fabrikant en geëlueerd in 100 ul transcriptie buffer voor de transcriptie assay. </li><li> Bepaal de template DNA-concentratie met behulp van een fluorospectrometer (Materials List). </li></ol></li><li> NTP Voorbereiding Opmerking: NTP&#39;s kan worden verkregen bij verschillende commerciële bronnen (Materials List). <ol><li> Oplossen NTP (≥99% zuiver) in DEPC-behandeld water 1 M voorraad, aliquot 1 ml van de oplossing te maken in 1,5 ml buizen (50 ui per buisje) en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Order α- 32P UTP (3000 Ci / mmol) voorafgaand aan het experiment. 32P heeft een korte halfwaardetijd van 14,29 dagen. Opmerking: Met-alpha gelabelde UTP vermijdt de intensiteit voor banden met verschillende lengte. </li></ol></li><li> RNA Ladder Bereiding <ol><li> Monteer de following reactie bij kamertemperatuur: 0,5 ug RNA sjabloon Mix (Materials List), 80 mM HEPES buffer pH 7,5, 12 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, 0,5 mM UTP, 2 il a-32P UTP, 0,5 pi T7 RNAP (Materials List), DEPC-behandeld water tot 20 ul. </li><li> Sta reactie verlopen bij 37 ° C gedurende 1 uur. Onmiddellijk gebruiken of op te slaan bij -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding van RNA Sequencing Gel <ol><li> gelbereiding <ol><li> Reinig de platen van een sequencing gel apparaat (Materials List) tweemaal met 70% ethanol en gezuiverd water, en monteer de cel met een kam en twee afstandhouders. Opmerking: Een plaat kan worden gecoat met siliconiseerproces reagens (Materials List) om gel te verwijderen in stap 4.2 te vergemakkelijken. </li><li> Ontbinden 33,6 g ureum in 22 ml water en 16,4 ml 5x Tris / boraat / EDTA (TBE) buffer (54 g tris (hydroxymethyl) aminomethaan; 27,5 g boorzuur, 10 ml 1 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), pH 7,4 in 1 L water) met een magneetroerder. </li><li> Voeg 16 ml 40% acrylamide / bis-acrylamide-oplossing (19: 1) om de ureumoplossing en filtreer door een 0,45 urn filter. </li><li> Voeg 514 ul 10% (w / v) vers bereid ammoniumpersulfaat in water, gevolgd door 51,4 ​​ul N, N, N &#39;, N&#39;-tetramethylethyleendiamine (TEMED) aan de gefiltreerde oplossing. </li><li> Keer de geloplossing overmatige beluchting vermijden en injecteer onmiddellijk en soepel in de horizontale stand voorverpakte sequencing cel onder injectiegat. Wees voorzichtig om te voorkomen dat bellen tijdens de injectie. </li><li> Sta 1-1,5 uur totdat de gel volledig is ingesteld voor gebruik in een transcriptie assay. De gel kan worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende twee of drie dagen wanneer omwikkeld met water vochtige weefsel aan de bovenkant van de cel sequencing. </li></ol></li></ol> 3. transcriptiereactie <ol><li> Transcriptie Rek onderbreken Assay <ol><li> Vorming van een transcriptie elongatie complex <ol><li> Voeg 1 ui van RNAP kern enzym (1 uM voorraad in transcriptie buffer) naar een 1,5 ml buis. </li><li> Voeg 1 pl gezuiverd sigma-70 factor (σ 70, 3 pM voorraad op transcriptie buffer) aan de RNAP en incubeer op ijs gedurende 10 min RNAP holoenzym te vormen. </li><li> Voeg 3 ul 500 nM gezuiverd matrijs DNA (λ PR promoter van het pIA226 PCR product) in transcriptiebuffer de RNAP holoenzym en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min naar de open complex. </li><li> Maak een mengsel van reactiecomponenten in een 1,5 ml buis met behulp van 5 ui 10 x transcriptiebuffer (Materials List: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCI, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 50% glycerol, pH 7,9 in DEPC behandeld water), 2 pi van 250 pM elk GTP en UTP, 1 ui 1 mM ATP en 1 pi α- 32P UTP (3000 Ci / mmol). Voeg DEPC behandeld water tot 41 ul. Neete: RNase inhibitor (Materials List) kan worden gebruikt om de RNase besmetting te minimaliseren. </li><li> Breng de gemengde oplossing aan de buis met de open complex en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min ter vorming van de transcriptie elongatie complex gestopt bij 26 nt. </li><li> Beweeg de reactie tot kamertemperatuur (~ 21 ° C) en voeg 1 pl 2,5 mg / ml rifampicine om een ​​eindconcentratie van 50 ug / ml. </li><li> Voeg 1 pl 0,1 mM gezuiverd Nuša aan het reactiemengsel en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 2 pl 250 uM CTP in het reactiemengsel tot een eindvolume van 50 pl te meten en de reactietijd met een timer. </li><li> Breng 5 ul van de reactieoplossing in 2 ui RNA gel laadbuffer (95% formamide, 0,05% broomfenolblauw en 0,05% xyleencyanol) en 30, 60, 120, 240, 480 en 1200 sec om de reactie te blussen. </li><li> Gooi de 32P UTP tips en buizen in een radioactief afval container. </li></ol></li></ol></li><li> Transcriptie initiatie Assay <ol><li> De vorming van de Open Complex <ol><li> Verdunde gezuiverde σ 70-0,5 uM. </li><li> Herhaal stap 3.1.1.1 tot 3.1.1.3 behulp 0,5 pM (in plaats van 3 uM) gezuiverd σ 70, en de DNA matrijs (P xyl promotorgebied van pSG1154 PCR product). </li></ol></li><li> Remming van transcriptie initiatie assay <ol><li> Voeg de remmer ontworpen RNAP holo formatie RNAP kern enzym voorafgaand voorkomen toevoeging van 70 σ (na stap 3.1.1.1), gevolgd door stap 3.1.1.2 en 3.1.1.3 te onderzoeken of de remmer kan holo formatie verstoren. </li><li> Als alternatief na stap 3.1.1.2, voeg de remmer om te onderzoeken of het in staat is om competitief te remmen σ 70 binding aan RNAP. </li><li> Met dezelfde hoeveelheid DMSO, het oplosmiddel van de remmer, in plaats van de remmer stock in control reacties. </li></ol></li><li> Voltooiing van de reactie <ol><li> Ontbinden heparine in water tot een voorraad concentratie van 1 mg / ml en voorraad bij -20 ° C. Opmerking: Heparine is een concurrent van DNA dat RNAP dat geen open complex heeft gevormd kunnen afzonderen. Zodra de open complex wordt gevormd, kan heparine niet in de DNA-bindingsplaats van RNAP en remmen de transcriptie van voorgevormde geopend complex. Daarom is heparine alleen vereist voor één ronde assays; Het is niet noodzakelijk voor multi-round assays. </li><li> Bereid het reactiemengsel gebruikt 5 ui 10 x transcriptiebuffer (Materials List), 1 ui 1 mg / ml heparine-oplossing, 1 ui 10 mM elk ATP, GTP en CTP, 2,5 mM UTP en 1 pl 32 α- P UTP (3000 Ci / mmol). Voeg DEPC behandeld water tot 45 ul. </li><li> Meng het reactiemengsel met de transcriptie geopende complex puls spin en incubeer bij 37 ° C gedurende 20 min. </li><li> Overdracht 10 ul van het reactiemengsel zolutie in 5 ui van RNA gel laadbuffer (95% formamide, 0,05% broomfenolblauw en 0,05% xyleencyanol) om de reactie te blussen. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. RNA Gel Running and Development <ol><li> Het uitvoeren van de Denaturing Polyacrylamide Gel <ol><li> Voer het gel bij 50 ° C en 50 W in 1x TBE buffer gedurende ongeveer 1,5 uur tot de temperatuur van de gel en de buffer is stabiel bij 50 ° C. </li><li> Warmte monsters bij 90 ° C gedurende 30 seconden en zet ze op ijs vóór het laden op het gel. </li><li> samples lading in de putjes op de bovenkant van de gel langs een rijstrook met 2 pl RNA ladder (1: 100 verdunning). </li><li> Voer de gel bij 50 W en 50 ºC in 1x TBE buffer tot de broomfenolblauw kleurstof langs de gel bereikt ~ 03/02. </li></ol></li><li> gel Behandeling <ol><li> Open langzaam en voorzichtig scheiden de bovenste plaat uit de sequencing cel. Wees extra voorzichtig om te voorkomen dat het breken van de gel. </li><li> Cut chromatography papier (Materials List) om de gel grootte overeenkomen van boven naar broomfenol blauwe kleurstof. Gebruik een geigerteller om de geschatte positie van radioactief gelabeld RNA-transcripten te bevestigen. </li><li> bedekken voorzichtig de gel met het filter, en druk stevig totdat de gel hecht aan het filter papier. Afgesneden en gooi de onderkant van de gel radioactief afval als de niet opgenomen NTPs ren naar de onderkant van de gel, die erg warm worden. </li><li> Plaats een vergelijkbare grootte stuk filtreerpapier op het droogbed van een vacuüm droger, en voorzichtig leg de gel-gecoat papier op het met de gel naar boven. </li><li> Bedek de gel met een plasticfolie en droog bij 60 ° C gedurende 1,5 uur. </li><li> Wikkel de andere zijde van de gel bekleed filterpapier met plastic folie en plaats op een fotostimuleerbare fosforplaat in de beeldvormende geval, met de juiste belichtingstijd, die kan variëren van 1 uur tot overnacht afhankelijk van de reactie-efficiëntie. </li><li> Afbeelding de fosfor plaat met behulp vaneen beeldvormer scanner volgens de instructies van de fabrikant. Bepaal de relatieve intensiteit band met behulp van ImageJ software volgens de software handleiding. </li><li> Gebruik een geigerteller om de radioactieve besmetting in het werkgebied controleren, veeg de verdachte items en met weefsel en een reinigingsmiddel en gooi het weefsel in de afvalcontainer. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+by+RNA+polymerase%3A+recognition+of+regulatory+signals+during+RNA+chain+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation.</a> J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).</li>
<li>Burgess, R. R., Anthony, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+sigma+docks+to+RNA+polymerase+and+what+sigma+does%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).</li>
<li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+intrinsic+transcription+termination+by+N+and+NusA%3A+the+basic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms.</a> Cell. 107 (4), 437-449 (2001).</li>
<li>Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NusA+N-terminal+domain+is+necessary+and+sufficient+for+enhancement+of+transcriptional+pausing+via+interaction+with+the+RNA+exit+channel+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase.</a> J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).</li>
<li>Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+RNA+polymerase+and+the+elongation+factor+NusA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA.</a> RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).</li>
<li>Artsimovitch, I., Henkin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+to+analysis+of+transcription+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches to analysis of transcription termination.</a> Methods. 47 (1), 37-43 (2009).</li>
<li>Decker, K. B., Hinton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+at+the+core%3A+Similarities+among+bacterial%2C+archaeal%2C+and+eukaryotic+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases.</a> Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).</li>
<li>Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+easy+to+stop+RNA+polymerase%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Is it easy to stop RNA polymerase?</a> Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).</li>
<li>Murakami, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+bacterial+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structural biology of bacterial RNA polymerase.</a> Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).</li>
<li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transcription+as+a+target+for+antibacterial+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).</li>
<li>Yang, X., Ma, C., Lewis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector+system+that+allows+simple+generation+of+mutant+Escherichia+coli+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase.</a> Plasmid. 75, 37-41 (2014).</li>
<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+large+scale+purification+of+Escherichia+coli+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase.</a> J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).</li>
<li>Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-overexpression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+subunits+allows+isolation+and+analysis+of+mutant+enzymes+lacking+lineage-specific+sequence+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).</li>
<li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transcription+inhibitor+of+RNA+polymerase+holoenzyme+formation+by+structure-based+drug+design%3A+From+in+silico+screening+to+validation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation.</a> ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).</li>
<li>Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase-induced+remodelling+of+NusA+produces+a+pause+enhancement+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex.</a> Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).</li>
<li>Lewis, P. J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+vectors+for+controlled+expression+and+dual+labelling+of+protein+fusions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis.</a> Gene. 227 (1), 101-110 (1999).</li>
<li>Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pausing+by+bacterial+RNA+polymerase+is+mediated+by+mechanistically+distinct+classes+of+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).</li>
<li>Vassylyev, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+bacterial+RNA+polymerase+holoenzyme+at+2.6+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution.</a> Nature. 417, 712-719 (2002).</li>
<li>Artsimovitch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+transcription+regulation+by+alarmone+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp.</a> Cell. 117 (3), 299-310 (2004).</li>
<li>Bordier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+rifampicin-resistant+RNA+synthesis+by+rifampicin-RNA+polymerase+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+lett%22%5BJournal%5D)">Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes.</a> FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).</li>
<li>Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+assay+to+measure+the+real-time+kinetics+of+nucleotide+incorporation+during+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation.</a> J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In alle organismen, transcriptie strak gereguleerd proces. In vitro transcriptie assays zijn ontwikkeld om een platform voor het testen van de effecten van transcriptiefactoren, kleine moleculen en transcriptie remmers. Bij deze werkwijze document, een bepaling voor algemene bacteriële transcriptie beschreven. Transcriptie assays gecombineerd met sequentie gelelektroforese transcripten zijn zeer belangrijk voor mechanistische studies mocht visualisatie van de transcriptie producten langs een tijdlijn toestaan. ...

Transcriptie is het proces waarbij RNA wordt gesynthetiseerd uit een specifieke DNA-matrijs. In eukaryote cellen zijn er drie verschillende RNAPs: RNAP I transcribeert rRNA precursors, RNAP II verantwoordelijk is voor de synthese van mRNA en bepaalde kleine nucleaire RNA&#39;s worden gesynthetiseerd 5S rRNA en tRNA wordt uitgevoerd door RNAP III. In bacteriën, is er slechts één RNAP verantwoordelijk voor de transcriptie van alle klassen van RNA. Er zijn drie fasen van de transcriptie: initiatie, verlenging en beëindiging. Transcriptie is een van de meest gereguleerde processen in de cel. Elke fase in de transcriptie cyclus vertegenwoordigt een controlepost voor de regulering van genexpressie 1. Bij het ​​opstarten, RNAP te associëren met een sigma factor holo vormen, die nodig is om het enzym aan specifieke plaatsen tussen genoemd promoters 2 een open promoter complex. Vervolgens werd een grote suite van transcriptiefactoren verantwoordelijk zijn voor de regulering oactiviteiten f RNAP tijdens de verlenging en beëindiging fasen. De transcriptiefactor hier onderzocht is de sterk geconserveerd en essentiële eiwitten, Nusa. Het is betrokken bij het ​​reguleren van transcriptie pauzeren en terminatie, evenals anti-beëindiging tijdens rRNA synthese 3-5. In vitro transcriptie assays zijn ontwikkeld als krachtige hulpmiddelen om de complexe regulerende stappen bestuderen bij transcriptie 6. In het algemeen wordt een lineair fragment van DNA omvattende een promotergebied vereist als de matrijs voor transcriptie. De DNA-matrijs wordt doorgaans gegenereerd door PCR of door het lineariseren van een plasmide. Gezuiverde eiwitten en NTP&#39;s (waaronder een radioactief gemerkte NTP voor detectie doeleinden) worden dan toegevoegd en product geanalyseerd volgens de vereiste incubatietijd. Met behulp van geschikte templates en reactie-omstandigheden, hebben alle stadia van transcriptie onderzocht met behulp van deze aanpak, die gedetailleerde moleculaire karakterisering van transcr heeft ingeschakeldiption in de afgelopen halve eeuw 7. In combinatie met informatie over de 3-dimensionale structuur van RNAP is het ook mogelijk zijn om het moleculaire mechanisme van transcriptie remming door antibiotica en antibiotica leads sonde, en deze informatie in de ontwikkeling van nieuwe, verbeterde geneesmiddelen 8-10. In dit werk geven we voorbeelden van hoe transcriptie assays kunnen worden gebruikt voor het regulatiemechanisme van transcriptie elongatie / beëindiging factor Nuša en hoe het werkingsmechanisme van een nieuwe transcriptie-initiatie remmer lood kan worden bepaald.

<table><tbody><tr><td>De eiwitten verkrijgen die nodig zijn voor transcriptie-assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>Bereiding van met DEPC behandeld water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>diethyl pyrocarbonaat (DEPC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrij water&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA-sjabloon voorbereiding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&nbsp;Plus&nbsp;SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR-primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP-voorbereiding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>NTP's met hoge zuiverheid</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-32P UTP&nbsp;</td><td>PerkinElmer&nbsp;&nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>Radioactief compound</td></tr><tr><td>RNA ladder voorbereiding&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0,1&ndash;1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Gel voorbereiding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;&nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>ureum&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethaan&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>boorzuur&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraazijnzuur&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>ammoniumpersulfaat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethyleendiamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptie-assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicine&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>formamide&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>bromofenolblauw&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>xyleencyaanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>heparine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptiebuffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp;3MM Chr Chromatografiepapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Radioactief ontsmettingsmiddel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Gelbehandeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio+ imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro transcriptie testen en hun toepassing in drug discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcriptie assays ontwikkeld en op grote schaal gebruikt voor vele jaren de moleculaire mechanismen van transcriptie bestuderen. Dit proces vereist meerdere subeenheden DNA-afhankelijke RNA polymerase (RNAP) en een aantal transcriptiefactoren die fungeren om de activiteit van RNAP moduleren tijdens genexpressie. Sequencing gelelektroforese radiogelabeld transcripten op gedetailleerde mechanistische informatie over transcriptie verloopt en welke parameters kan beïnvloeden verschaffen. In dit artikel beschrijven we het protocol te onderzoeken hoe de essentiële verlengingsfactor Nuša reguleert transcriptie onderbreken, evenals een methode om een ​​antibacterieel middel gericht transcriptie-initiatie door remming van RNAP holo vorming identificeren. Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt als een platform voor de ontwikkeling van additionele benaderingen voor het werkingsmechanisme van de transcriptiefactoren die nog onduidelijk, evenals nieuwe antibacteriële agen staandts richt transcriptie dat is een weinig gebruikte drug target in antibiotische onderzoek en ontwikkeling.

Transcriptie efficiëntie kan worden bepaald door de mate van straling in de banden op verschillende tijdstippen. De pauzeren test om de functie van Nusa factor mogelijk visualisatie van de pauze, beëindiging te testen, en run-off producten (Figuur 1A). In aanwezigheid van het N-terminale domein van NUSA (Nusa NBD; aminozuurresten 1-137), werd het uiterlijk van de RNA-producten aanzienlijk vertraagd vergeleken met de controleproef ontbreken NUSA. Deletie van aminozuurresi...

In dit manuscript beschrijven we een protocol om transcriptie en de remmende activiteit van antibacteriële middelen die zich richten op bacteriële transcriptie functioneel te onderzoeken.

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Het algemene doel van deze in vitro transcriptie-assay is om de complexe reguleringsstappen tijdens de transcriptie te bestuderen door een platform te bieden voor het testen van de effecten van transcriptiefactoren, kleine moleculen en transcriptieremmers. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de moleculaire biologie, zoals de precieze mechanismen die verbonden zijn met transcriptieregulatie, de functie van transcriptiefactoren met onbekende mechanismen en de effecten van normale transcriptieremmers. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het directe visualisatie mogelijk maakt van alle transcriptieproducten over een tijdlijn vanaf een enkele RNA-sequencinggel.Begin deze procedure door de platen van een sequentiegelapparaat twee keer te reinigen met 70% ethanol en gezuiverd water. Zet de cel in elkaar met een kam en twee spacers. Los 33,6 gram ureum op in 22 milliliter water en 16,4 milliliter vijf keer TBE-buffer met behulp van een magnetische roerder.Voeg 16 milliliters van een 40% acrylamide-oplossing toe aan de ureumoplossing en filter dit door een 0,45 micrometer filter. Voeg aan de gefilterde oplossing 514 microliters van een vers bereide

in-vitro-transcription-assays-and-their-application-in-drug-discovery

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

We ontwikkelden een kwantitatieve DNA-bindende ELISA gebaseerde bepaling om transcriptiefactor interactie met DNA te meten. Hoge specificiteit voor de RUNX2 eiwit werd bereikt met een consensus DNA-herkenning oligonucleotide en specifieke monoklonale antilichaam. Colorimetrische detectie met een enzym-gekoppelde antilichaam substraat reactie werd gevolgd in real time.

Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole en haar freebase analoge vertonen een lage micromolaire cel cytotoxiciteit. Dit manuscript beschrijft een RNA transcriptie reactie, beeldvorming RNA met ethidiumbromide gekleurde gel en kwantificeren RNA met UV-Vis spectroscopie, teneinde transcriptie remming te bepalen door corroles en toont een eenvoudige methode voor de beoordeling antikanker kandidaat eigenschappen.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatische test te meten transcriptie Remming van gallium (III) en H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Hier wordt real-time monitoring van het metabolisme van tumorcellen, gecombineerd met een in vivo kippenembryo chorio-allantoïsche membraan (CAM) model van metastase, gebruikt om nieuwe anti-kanker doelen/middelen te evalueren op hun vermogen om tumorcellen te sensitiviseren voor DNA-beschadigende chemotherapeutica.

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Geneesmiddelresistentie voor gerichte therapeutica is wijdverbreid en de noodzaak om resistentiemechanismen te identificeren - voor of na de eerste klinische verschijnselen - is essentieel voor het geleiden alternatieve klinische strategieën. Hier presenteren we een protocol te koppelen afleiding van resistente lijnen in vitro sequentiebepaling ontdekking van deze mechanismen te bespoedigen.

Invoer van<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance Testen: maximaliseren van het potentieel voor het blootleggen van klinisch relevante resistentiemechanismen

In dit werk bieden we een experimentele workflow van hoe actieve enhancers kunnen worden geïdentificeerd en experimenteel gevalideerd.

Voorspelling en Validatie van Gene Regulatory Elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur Induced embryonale stamcellen Differentiatie

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

We presenteren een protocol om mRNA vertaling verordening in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen met behulp van in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay studie. De analyse kan voor het bestuderen van Vertaal regelgeving door CIS-elementen van een mRNA worden gebruikt, met inbegrip van 5 '-onvertaalde regio (Utr) en 3 '-UTR. Verschillende Vertaal initiatie modi kunnen ook worden onderzocht met behulp van deze methode.

In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen

Hier presenteren we een protocol voor de in vitro selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren (ETR's) met een hoge, langdurige, stabiele, on-target uitschakelingsefficiëntie en een lage genoombrede, off-target activiteit. Deze workflow maakt het mogelijk om een initieel, complex repertoire van kandidaat-ETR's terug te brengen tot een shortlist, geschikt voor verdere evaluatie in therapeutisch relevante settings.

In vitro Selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren voor gerichte epigenetische uitschakeling

Dit protocol beschrijft een workflow van ex vivo of in vitro celculturen tot transcriptomische gegevensvoorverwerking voor kosteneffectieve transcriptoomgebaseerde geneesmiddelenscreening.

Kostenefficiënte transcriptomische screening van geneesmiddelen

Leer in vitro transcriptie-assays voor moleculaire biologie en transcriptieregulatie. Deze methode maakt directe visualisatie van transcriptieproducten mogelijk en helpt bij het testen van antibacteriële agentia.

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery (Video) | JoVE Journal

/search?query=transcriptie-elongatiecomplex

/search?query=transcriptie-inhibitiemethode

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery

Meer video's verkennen