Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film

Het algemene doel van deze procedure is om een methode te beschrijven die kan worden gebruikt om geautomatiseerde lipide-dubbellaagvorming te bestuderen met behulp van een dunne polydimethylsiloxaanfilm. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het gebied van nanobiosensoren met betrekking tot membraan-eiwitinteracties. Het grote voordeel van deze techniek is dat de vorming van de lipide-dubbellaag geautomatiseerd en reproduceerbaar is.

Om te beginnen, bereidt u de bufferoplossing voor door kaliumchloride, tris-hydrochloride en EDTA te combineren in gedistilleerd water. Pas vervolgens de PH van de oplossing aan tot 8,0. Filtreer vervolgens de oplossing met een 0,2 micronfilter en autoclaveer de oplossing gedurende 15 minuten bij 121 graden Celsius.

Bereid vervolgens de lipideoplossing voor voor het voorbeschilderen door 3%van het lipide op te lossen in een mengsel bestaande uit twee delen ondecaan en acht delen hexadecaandeel volgens volume. Roer de oplossing een nacht lang met een rotator. Bereid ook de lipideoplossing voor voor membraanvorming door 0,1%van het lipide op te lossen in hetzelfde mengsel van twee delen ondecaan en acht delen hexadecaandeel volgens volume.

Roer deze oplossing ook een nacht lang met een rotator. Om een PDMS-dunne film te bereiden, mengt u negen delen prepolymer met één deel verhardingsmiddel in een mengbeker. Plaats vijf gram van dit mengsel in een petrischaal en spin coat de schaal gedurende 10 seconden bij 800 tpm om een film te vormen met een dikte van 200 tot 250 micron.

Plaats vervolgens de petrischaal in een vacuümdesiccator en zuig een vacuüm van 100 millitorr gedurende twee uur om de resterende luchtbellen te verwijderen. Bak vervolgens de dunne film gedurende vijf uur in een oven bij 70 graden Celsius om de PDMS te polymeriseren. Nadat het is afgekoeld, snijd de gepolymeriseerde dunne film in vierkantjes van twee centimeter bij twee centimeter en gebruik een pons met een diameter van 500 micron om een kleine opening in het midden van het vierkant te maken.

Gebruik vervolgens een micropipet om de openingen voor te beschilderen met één microliter van de 3%lipideoplossing. Om de zwarte lipide membraankamer te maken, ontwerpt u twee symmetrische blokken voor de kamer met behulp van 3D-tekensoftware. Vervolgens fabriceert u de kamer met behulp van een blok PTFE en een CNC-machine.

Om de kamer te assembleren, plaatst u de voorbeschilderde PDMS-dunne film tussen de twee PTFE-blokken, zodat de opening op de PDMS-dunne film gecentreerd is met het gat in de kamer. Gebruik afdekglas en vacuümvet om de buitenranden van de kamer af te dichten. Eenmaal afgesloten, immobiliseert u de geassembleerde kamer met behulp van moeren en bouten.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de kamer goed afgesloten is, zodat er geen vloeistoflekkage is. Gebruik een pipet om 0,5 microliter van de 0,1%lipideoplossing op de opening van de PDMS-dunne film af te zetten, geassembleerd met de kamer. Plaats vervolgens de kamer in een gekoelde omgeving onder de 10 graden Celsius en bewaar deze totdat deze nodig is.

Om een zwarte lipide membraan te vormen met versnelde zelfassemblage, haalt u de kamer uit de koelkast en voegt u twee milliliter van de bufferoplossing toe aan elke kant van de kamer. Laat de kamer gedurende 10 minuten staan totdat de bevroren membraanprecursor ontdooit. Plaats vervolgens de kamer op een micromanipulator om de hoogte ten opzichte van de lichtbron en de microscoop nauwkeurig te regelen.

Gebruik een halogeenvezeloptische verlichter om een kant van de kamer te verlichten om de opening van de PDMS-dunne film te verlichten. Plaats aan de andere kant een 20x objectief in lijn met de opening en observeer het centrum waar de kleur helderder wordt dan de ring. Voor elektrische meting bereidt u zilverchloride-elektroden voor door een zilverdraad met een dikte van 208 micrometer gedurende ten minste één minuut in een oplossing van natriumhypochloriet te plaatsen.

Verbind vervolgens de elektroden met een micro-elektrode-versterker. Plaats vervolgens de zilverchloride-elektroden in elke kant van de kamer, zodat ze zich in de bufferoplossing bevinden. Gebruik elektrofysiologisch software om een driehoekige golfvorm van 10 millivolt over het membraan toe te passen om een vierkant golfvorm te verkrijgen.

Neem de elektrische eigenschappen van het membraan op door op de opnameknop te klikken. Blijf opnemen totdat een uniforme vierkant golfvorm wordt waargenomen. Stop vervolgens met opnemen door op het zwarte vierkantpictogram te klikken.

Er kunnen twee methoden worden gebruikt om gramicidin A in de lipide-dubbellaag op te nemen. Ten eerste kan gramicidin A direct worden toegevoegd aan de lipideoplossing voordat de lipideoplossing op de opening van de PDMS-dunne film wordt uitgespreid. Ten tweede kan gramicidin A-oplossing worden toegevoegd aan de kamer wanneer een lipide-dubbellaag zich vormt.

Om gramicidin A-kanaalactiviteiten waar te nemen, brengt u 100 millivolt aan over het membraan met een monstersnelheid van 5 kilohertz om het houdpotentiaal van het membraan te meten. Neem de elektrische eigenschappen op zoals eerder gedaan door op de opnameknop te klikken. Zodra ionkanaalactiviteiten worden getoond, blijf opnemen totdat verschillende stroomjumps worden waargenomen om de incorporatie van het ionkanaal te bevestigen.

Eenmaal bevestigd, stopt u met opnemen door op het zwarte vierkantpictogram te klikken. Wanneer de opname is voltooid, filtert u de gegevens met een laagdoorlaatbesselfilter van 100 hertz met behulp van elektrofysiologisch software. Observeer de stroomjumps in de gefilterde houdpotentiaalgegevens.

Deze sprongen vertegenwoordigen de dimerisatie van een gramicidin A-ionkanaal. Toen de bevroren membraanprecursor naar kamertemperatuur werd gebracht om te ontdooien, werd de lipide-dubbellaagvorming gefaciliteerd door extractie van hydrofobe oplosmiddelen in de PDMS-dunne film. Deze reeks afbeeldingen toont de vorming van