Name: Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Leer een geautomatiseerde methode voor lipidebilaagvorming met polydimethylsiloxaan dunne film. Deze techniek maakt reproduceerbare membraanvorming binnen een uur mogelijk voor membraan-eiwitinteractiestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) en National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) van de National Research Foundation of Korea. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door de Inha University Research Grant.

1. Oplossing Voorbereiding <ol><li> Bereiding bufferoplossing: <ol><li> Om bufferoplossing formuleren, oplossen 1 M KCl (kaliumchloride), 10 mM Tris-HCl (tris-hydrochloride), en 1 mM EDTA (Ethyleendeniaminetetraacetaat) in gedestilleerd water en de pH instellen op 8,0. </li><li> Filter de oplossing om met een 0,20 pm filter. Te steriliseren, autoclaveren de oplossing bij 121 ° C gedurende 15 minuten. </li></ol></li><li> Bereiding van lipide-oplossing voor pre-painting: <ol><li> De lipideoplossing voor pre-painting formuleren oplossen 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn glycero-3-fosfatidylcholine) lipide (w: v) in een mengsel van 2: 8 n decaan en hexadecaan (v: v). Roer &#39;s nachts met behulp van een rotator. </li></ol></li><li> Bereiding van lipide oplossing membraanvorming: <ol><li> De lipideoplossing voor membraanvorming formuleren oplossen 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn glycero-3-fosfatidylcholine) lipide (w: v) in een mengsel van 2: 8 squalene en hexadecaan (v: v). Roer &#39;s nachts met behulp van een rotator. </li></ol></li></ol> 2. Vorming van een PDMS Thin Film <ol><li> Meng PDMS en uithardingsmiddel in een 9: 1 (w / w) verhouding in een mengkom de PDMS prepolymeer. Voeg 5 g PDMS prepolymeer een petrischaal het PDMS vormen dunne film (dikte 200-250 pm). Spread PDMS prepolymeer met behulp van een spin coater bij 800 rpm gedurende 10 seconden om een ​​dunne film te vormen. </li><li> Plaats de petrischaal in een vacuümexsiccator bij een druk van 100 mTorr gedurende 2 uur om luchtbellen te verwijderen. Het prepolymeer dunne film, bak polymeriseren in een oven gedurende 5 uur bij 70 ° C. </li><li> Om een vierkant PDMS dunne film te maken, stuurde de gepolymeriseerde PDMS dunne folie in 2 x 2 cm 2 vierkantjes. Gebruik een 500 urn micro punch om een ​​opening te maken in het midden van het PDMS dunne film. Voorstrijkverf openingen met 3% DPhPC lipideoplossing gemengd in 2: 8 n- decaan en hexadecaan. </li></ol> 3. Kamer Fabrication en Assembly <ol><li> Om de BLM kamer fabriceren, ontwerp twee symmetrische blokken van de kamer met behulp van 3D tekensoftware met buitenafmetingen van 4 cm x 1,5 cm x 1 cm en innerlijke goed afmetingen van 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17. </li><li> Craft de kamer met behulp van een PTFE-blok met een CNC-machine en volg de instructies van de fabrikant. </li></ol> 4. Kamer Assembly <ol><li> De kamer monteren, plaatst de voorgelakte-PDMS dunne film tussen de twee PTFE blokken zodanig dat de opening aan het PDMS dunne film wordt aangesloten aan de opening in de kamer. </li><li> Sluit de buitenste randen van de tank af met een cover glas met vet (het faciliteren van optische waarneming). Immobiliseer de geassembleerde kamer met behulp van bouten en moeren. LET OP: Zorg ervoor dat de kamer wordt goed afgesloten, zodat er geen vloeistof lekken. </li></ol> 5. Vorming van Membrane Voorloper met Versnelde Zelfassemblage Formation (MPES) <ol><li> Met behulp van een pipet, stort 0,5gl 0,1% DPhPC lipide gemengd in 2: 8 n decaan: hexadecaan op de opening van de PDMS dunne film geassembleerd met de kamer. </li><li> Voor gebruik opslaan van de kamer in een vriezer of koelkast beneden 10 ° C. </li></ol> 6. Membraan Formation and Verification <ol><li> Om een ​​BLM met MPES vormen, trekken de kamer uit de koelkast en op te schorten 2 ml buffer oplossing in elke kant van de kamer. Zet de kamer gereserveerd voor &lt;10 min, totdat het bevroren membraan voorloper ontdooit. </li><li> Plaats de kamer op een micromanipulator om de hoogte nauwkeurig te regelen ten opzichte van de lichtbron en de microscoop. Verlicht één zijde van de kamer als een lichtbron met een halogeen vezeloptische illuminator de opening van de PDMS dunne film voor optische waarneming van BLM vormingsproces helderen. </li><li> Anderzijds plaatst een digitale microscoop verticaal ten opzichte van de lichtbron BLM vorming observeren (20 maal vergroten0X). </li><li> Om BLM vorming bevestigen acht het midden van de opening waar de kleur helderder dan de ring. </li></ol> 7. Elektrische Recording <ol><li> Voor elektrische metingen, voor te bereiden Ag / Cl elektroden met behulp van een 208 urn dikke zilverdraad en bleekmiddel in natriumhypochloriet gedurende&gt; 1 min. Plaats de Ag / Cl elektroden in elke zijde van de kamer diep genoeg te dompelen in de bufferoplossing. </li><li> Sluit de elektroden aan op de micro-elektrode versterker. Met behulp van elektrofysiologie software, breng dan een ± 10 mV driehoekige golfvorm over het membraan om een ​​blokgolf te verwerven. Stel het toepassen van spanning door te klikken op de op V_clamp (mV) pijlen. </li><li> Noteer de elektrische eigenschappen van het membraan door te klikken op de knop record (rode stip icoon). Ga door met opnemen totdat een uniforme vierkante golf wordt waargenomen. Stoppen met de opname door te klikken op de zwarte vierkante pictogram. </li></ol> 8. Ion Channel Incorporation NIETE: Gramicidin A (gA) opneming gebeurt spontaan bij vorming van BLM, zoals gA rechtstreeks wordt toegevoegd aan de lipideoplossing. <ol><li> Om gA channel activiteiten te observeren, toe te passen 100 mV over het membraan met een frequentie van 5 kHz te meten met het potentieel van het membraan. Stel het toepassen van spanning door te klikken op de op V_clamp (mV) pijlen. </li><li> Noteer de elektrische eigenschappen van de GA-opneming van informatie door te klikken op de knop record (rode stip icoon). Ga verder het opnemen totdat het huidige sprongen wordt waargenomen. Stoppen met de opname door te klikken op de zwarte vierkante pictogram. </li><li> Na elektrische data-acquisitie, filteren de gegevens met een lage-pass Bessel-filter bij 100 Hz met behulp van een elektrofysiologie software. </li><li> Let op de huidige sprongen in de gefilterde houdt potentiële data (elke huidige sprong, ~ 0,15 NS, vertegenwoordigt dimerisatie van een gA ionkanaal) naar gA opname te controleren. </li></ol>

<ol><li>Hanke, W., Schulue, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Planar+lipid+bilayers%3A+methods+and+applications%22">Planar lipid bilayers: methods and applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+planar+lipid+bilayer+membranes+for+rapid+screening+of+membrane+active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds.</a> Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).</li>
<li>Bayley, H., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensors+inspired+by+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensors inspired by biology.</a> Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).</li>
<li>Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+microarrays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).</li>
<li>Majd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+biological+pores+in+nanomedicine%2C+sensing%2C+and+nanoelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).</li>
<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Biomimetic+Membranes+and+Their+Sensor+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications.</a> Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Ion+Channel+Activities+of+Gramicidin+A+in+the+Presence+of+Ionic+Liquids+Using+Model+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamping+by+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Patch clamping by numbers.</a> Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).</li>
<li>Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cell+membrane+structure+in+vitro+and+its+transformation+into+an+excitable+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.</a> Nature. 194, 979-980 (1962).</li>
<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).</li>
<li>Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+microelectrode-cavity+array+for+high-resolution+and+parallel+electrical+recording+of+membrane+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents.</a> Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).</li>
<li>Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+gel-bilayer+channel+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater.+Opt.+Electron%22%5BJournal%5D)">A robust gel-bilayer channel biosensor.</a> Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).</li>
<li>Ide, T., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artificial+lipid+bilayer+formed+on+an+agarose-coated+glass+for+simultaneous+electrical+and+optical+measurement+of+single+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).</li>
<li>Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-encapsulated+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-encapsulated lipid membranes.</a> J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).</li>
<li>Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Lived+Planar+Lipid+Bilayer+Membranes+Anchored+to+an+In+Situ+Polymerized+Hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel.</a> Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storable+and+shippable+lipid+bilayer+membrane+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform.</a> Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Lipid+Membrane+Formation+Using+a+Polydimethylsiloxane+Film+for+Ion+Channel+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements.</a> Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).</li>
<li>Yaws, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYaws%2C+C+%22Chemical+Properties+Handbooks%3A+Physical%2C+Thermodynamic%2C+Environmental%2C+Transport%2C+Safety%2C+and+Health+Related+Properties+for+Organic+and+Inorganic+Chemicals%22">Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals</a>. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).</li>
<li>Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWindholz%2C+M+%22The+Merck+index.+An+encyclopedia+of+chemicals+and+drugs%22">The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs</a>. , Merck & Co. (1976).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+C+%22Ion+Channel+Reconstitution%22">Ion Channel Reconstitution</a>. , Springer Science & Business Media. (1986).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-state+substructure+of+single+chloride+channels+from+Torpedo+electroplax%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).</li>
<li>Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capacity+of+black+lipid+films+and+of+lipid+bilayers+made+from+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).</li>
<li>Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+requirements+for+membrane-glass+adhesion+and+giga+seal+formation+in+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording.</a> Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Onze BLM-vormingstechniek biedt een krachtig hulpmiddel voor celmembraan- en ionkanaalstudies, in tegenstelling tot conventionele technieken die een beperkt potentieel voor industrieel gebruik hebben. We ontwikkelden een membraanvoorloper met behulp van een PDMS-dunne film en bedachten een bevroren membraanvoorloper met versnelde zelfsamenstelling.
In tegenstelling tot conventionele membraanvormingsmethoden met hydrofobe films, waar membraanvorming alleen plaatsvindt via oppervlakte-interactie...

Kunstmatige lipide dubbellaag membraan of zwarte lipide membraan (BLM), is een belangrijk instrument voor het ophelderen van mechanismen van celmembranen en ionkanalen, alsmede voor het begrijpen van interacties tussen ionen ionenkanalen en / moleculen. 1-7 Hoewel de patch-clamp-methode wordt vaak beschouwd als de gouden standaard voor het celmembraan studies, is bewerkelijk en vereist zeer bekwame operators voor ionkanaal metingen. 8 Terwijl kunstmatig bereide lipide dubbellaag membranen zijn ontstaan ​​als alternatieve instrumenten voor het ionkanaal studies, 9,10 ze worden ook geassocieerd met moeizame processen en specifieke deskundigheid. Bovendien membranen zijn gevoelig voor mechanische storingen. Daarom lipide bilaag technologieën die tot dusver beperkte praktische toepassingen. 11 Om de betrouwbaarheid en duurzaamheid van lipide dubbellaag membranen Costello et al. 12 en Ide en Yanagida verbeteren <sup&gt; 13 hebben een vrijstaande lipidedubbellaag ondersteund door hydrogels bedacht. Ondanks de verbeterde levensduur echter (&lt;24 uur), werd dubbellaag robuustheid niet verbeterd. Jeon et al. 14 bedacht een hydrogel ingekapseld membraan (HEM) met intieme hydrogel-lipide bilaag contact, wat resulteert in verhoogde levensduur (tot enkele dagen). Om de levensduur van de HEM verder te verhogen, Malmstadt en Jeon et al. Creëerde een hydrogel ingekapseld membraan met hydrogel-lipidebindende via in-situ covalente conjugatie (cgHEM). 15 In beide systemen membraan levensduur aanzienlijk verhoogd (&gt; ​​10 dagen) . De membraanvorming systemen niet voldoende robuust en kan niet worden opgeslagen of afgeleverd indien vereist deskundigheid vrij die door het gebruik van de lipide bilagen. De ontwikkeling van een lipide bilaag platform is vooral draaide om het verhogen van de robuustheid en de levensduur van BLMs. Hoewel de levensduur van BLMs is substantially verbeterde recent zijn de toepassingen beperkt door een gebrek transporteerbaarheid en houdbaarheid. Om deze problemen te overwinnen, Jeon et al. Creëerde een houdbare membraan systeem en introduceerde een membraan precursor (MP). 16 Om een MP bouwen, bereidden zij een mengsel van n- decaan en hexadecaan die 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn glycero-3-fosfatidylcholine) van het vriespunt van de lipideoplossing zodat het zou bevriezen bij ~ 14 ° C (beneden kamertemperatuur, typisch boven koelkasttemperatuur) regelen. In dit experiment werd de MP verdeeld over een kleine opening op een polytetrafluorethyleen (PTFE) film en vervolgens in een koelkast bij 4 ° C bevroren. Wanneer de MP tot kamertemperatuur werd gebracht, de MP ontdooid en een lipide bilaag werd automatisch gevormd, waardoor de deskundigheid doorgaans geassocieerd met membraanvorming. Echter, het slagingspercentage van BLM gemaakt van de MP was zo laag als ~ 27%, en het membraan formation keer was inconsistent (30 min tot 24 uur), de praktische toepassingen ervan te beperken. In deze studie wordt een polydimethylsiloxaan (PDMS) dunne film gebruikt in plaats van een conventionele hydrofobe dunne films (PTFE, polyoxymethyleen, polystyreen) tot (a) controle fabricagetijd en (b) verhogen de slaagkans van BLM formatie eerder door Ryu gemeld et al. 17 Hierin membraanvorming werd vergemakkelijkt door extractie van oplosmiddelen door de poreuze aard van PDMS en de benodigde tijd voor membraanvorming werd succesvol gecontroleerd in deze studie. In dit systeem, omdat de lipideoplossing werd geabsorbeerd in de dunne PDMS film, werd een consistente membraanvorming tijd bereikt. Bovendien werd membraanlevensduur verlengd door langzame absorptie van oplosmiddelen in het PDMS dunne film, een gevolg van de toevoeging van squaleen aan de lipideoplossing. Voerden we optische en elektrische metingen te controleren of membranen gevormd onder toepassing van deze techniek zijn geschikt voor iop kanalen studies.

<table><tbody><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Voor bufferoplossing</td></tr><tr><td>Tris-hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td>Voor bufferoplossing</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td>Voor bufferoplossing</td></tr><tr><td>n-decaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44074-U</td><td>Voor lipide-oplossing</td></tr><tr><td>Hexadecaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-76-3</td><td>Voor lipide-oplossing</td></tr><tr><td>Squaleen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3626</td><td>Voor lipide-oplossing</td></tr><tr><td>Gramicidine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11029-61-1</td><td>Membraaneiwit</td></tr><tr><td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td>Voor membraanvorming</td></tr><tr><td>Sylgard 184a en 184b elastromeerkit</td><td>Dow Corning Asia</td><td></td><td>Voor het produceren van een PDMS-dunne film</td></tr><tr><td>0,2 &mu;m filter</td><td>Satorius stedim</td><td>16534----------K</td><td>Om bufferoplossing te filteren</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FinePCR</td><td>AG</td><td>Om lipide homogeen op te lossen</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Biofree</td><td>BF-60AC</td><td>Om bufferoplossing te steriliseren</td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Shinu Mst</td><td>SP-60P</td><td>Om PDMS-prepolymer te verspreiden</td></tr><tr><td>Vacuumdessiccator</td><td>Welch</td><td>2042-22</td><td>Om luchtbellen in PDMS-prepolymer te verwijderen</td></tr><tr><td>500 &mu;m&nbsp; pons</td><td>Harris Uni-Core</td><td>0,5</td><td>Om een opening in de PDMS-dunne film te maken</td></tr><tr><td>CNC-machine</td><td>SME trading</td><td>SME 2518</td><td>Om de kamer voor membraanvorming te fabriceren</td></tr><tr><td>Halogeenvezeloptisch verlichtingsmiddel</td><td>Motic</td><td>MLC-150C</td><td>Om de opening van de PDMS-dunne film te verlichten voor optische observatie</td></tr><tr><td>Digitaal microscoop</td><td>Digital blue</td><td>QX-5</td><td>Om de vorming van lipide-dubbellaagmembranen optisch te observeren</td></tr><tr><td>Elektrode</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>Om membraanvorming elektrisch te observeren</td></tr><tr><td>Micro-elektrode versterker (Axopatch versterker)</td><td>Axon Instruments</td><td>Axopatch 200B Versterker</td><td>Om de capaciteit van het membraan te meten (beschreven als micro-elektrode versterker in het manuscript)</td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde lipidebilaagmembraan vorming met behulp van een polydimethylsiloxane thin film

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Een kunstmatige lipide dubbellaag of zwarte lipide membraan (BLM), is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van ionkanalen en eiwitinteracties alsook voor biosensor-toepassingen. Echter, conventionele BLM vorming technieken hebben een aantal nadelen en ze vereisen vaak specifieke expertise en tijdrovend proces. Met name de conventionele BLMs last hebben van lage formatie slagingspercentages en inconsistent membraan vorming van de tijd. Hier tonen we een houdbaar en transporteerbaar BLM formatie systeem met een gecontroleerde uitdunnen-out tijd en verbeterde BLM snelheid van vorming door het vervangen van conventioneel gebruikte films (polytetrafluorethyleen, polyoxymethyleen, polystyreen) naar polydimethylsiloxaan (PDMS). In dit experiment wordt een poreuze gestructureerd polymeer zoals PDMS gebruikte dunne. Bovendien, in tegenstelling tot gebruikelijke oplosmiddelen met lage viscositeit, het gebruik van squaleen toegelaten gecontroleerd uitdunnen tijd via slow oplosmiddelabsorptie door PDMS, verlengen membraanlevensduur. in addition, door toepassing van een mengsel van squaleen en hexadecaan, het vriespunt van het lipide-oplossing werd verhoogd (~ 16 ° C) bovendien membraan voorlopers werden geproduceerd die oneindig kan worden opgeslagen en gemakkelijk getransporteerd. Deze membraan voorlopers hebben BLM vorming van &lt;1 uur gereduceerd en behaalde een BLM vorming tarief van ~ 80%. Bovendien ion channel experimenten met gramicidine A toonde de haalbaarheid van het membraan systeem.

Optimalisatie van MPES Solution Samenstelling Verschillende samenstellingen van lipiden en oplosmiddelen werden getest met succes reconstitueren lipide bilaag membranen van MPES. Het MP systeem met een mengsel van n- decaan en hexadecaan met 3% DPhPC 14 vertoonde een lage membraanvorming (~ 27%) succes. Bovendien, als de PDMS film continu geëxtraheerd lipideoplossing, was het noodzakelijk om oplosmiddelsamenstelling een intact lipide dubbellaag...

We tonen een opgeslagen of vervoerd lipidedubbellaag formatie systeem. Een lipide dubbellaag membraan kan worden gevormd binnen 1 uur meer dan 80% succes als een bevroren membraan precursor tot omgevingstemperatuur wordt gebracht. Dit systeem tijdrovend proces en deskundigheid geassocieerd met ionkanalen verminderen.

Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van een methode die kan worden gebruikt om de geautomatiseerde vorming van lipidendubbellagen te bestuderen met behulp van een polydimethylsiloxaan-dunne film. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van nanobiosensoren met betrekking tot interacties tussen membranen en eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de vorming van de lipidendubbellaag geautomatiseerd en reproduceerbaar is.Bereid eerst de bufferoplossing voor door kaliumchloride, tris-hydrochloride en EDTA in gedestilleerd water te mengen. Stel vervolgens de pH van de oplossing in op 8,0. Filtreer daarna de oplossing met een 0,2 micron filter en autoclaveer de oplossing bij 121 °C gedurende 15 minuten.Bereid vervolgens de lipidoplossing voor het voorstrijken door 3% van het lipide op te lossen in een mengsel bestaande uit twee delen undecaan en acht delen hexadecaan naar volume. Roer de oplossing gedurende de nacht met een rotator. Bereid daarnaast de lipidoplossing voor de membraanvorming door 0,1% van het lipide op te lossen in hetzelfde mengsel van twee delen undecaan en acht delen hexadecaan naar volume

automated-lipid-bilayer-membrane-formation-using-polydimethylsiloxane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Ondersteunde lipide dubbellagen en natuurlijke membraan deeltjes zijn handig systemen die de eigenschappen van celmembranen kunnen benaderen en diverse analytische strategieën worden opgenomen. Hier laten we een werkwijze voor het bereiden microarrays samengesteld ondersteunde lipide-bilaag beklede SiO2 parels, fosfolipide vesicula of natuurlijke membraan deeltjes.

Vorming van biomembraan Microarrays met een zuigmond-gebaseerde Vergadering Methode

Microfluïdische jetting tegen een druppel-interface lipide bilaag een betrouwbare manier om vesicles te genereren controle over membraan asymmetrie, incorporatie van transmembraan eiwitten en inkapseling materiaal. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen waarbij gecompartimenteerd biomoleculen gewenst bestuderen.

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

We presenteren een experimenteel protocol naar een ondersteunde lipidebilaag op vaste substraten te vormen zonder gebruik van lipide blaasjes. We tonen een eenstaps werkwijze op een lipide dubbellaag op siliciumdioxide en goud en ondersteunde membranen met cholesterol verrijkte domein voor verschillende biologische toepassingen te vormen.

Biomembraan Fabrication door de Solvent-geassisteerde lipidedubbellaag (SALB) Methode

De generatie van microfluïdische dubbele emulsies omvat doorgaans apparaten met een patroon van bevochtigbaarheid of op maat gemaakte glazen onderdelen. Hier beschrijven we de fabricage en het testen van een geheel uit polydimethylsiloxaan (PDMS) bestaande dubbele emulsiegenerator die geen oppervlaktebehandeling of gecompliceerde fabricageprocessen vereist en die in staat is om dubbele emulsies tot 14 µm te produceren.

Dubbele Emulsion Generation Met een Polydimethylsiloxaan (PDMS) Co-axiale Flow Focus Device

Solid-ondersteund, eiwit-vrij, dubbele fosfolipide dubbelgelaagde membranen (DLBM) kunnen worden omgezet in complexe en dynamische lipide nanobuis netwerken en kunnen dienen als 2D onderop modellen van het endoplasmatisch reticulum.

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

We rapporteren een protocol voor het produceren van een hybride lipide membraan op de water/lucht interface door het smeren van de lipide bilayer met koper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) moleculen. Het resulterende hybride lipidemembraan heeft een lipide/CuPc/lipide sandwichstructuur. Dit protocol kan ook worden toegepast op de vorming van andere functionele nanomaterialen.

Self-Assembly van hybride lipid membranen doped met hydrofobe organische moleculen op de Water / Air Interface

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de binding, mobiliteit en assemblage van afzonderlijke moleculen op kunstmatige overvolle lipidemembranen uit te voeren en te analyseren met behulp van single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopie.

Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Hier wordt een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem ontwikkeld om een synthetisch membraan te bieden met een gedefinieerde kromming die de karakterisering van eiwitten met krommingsdetectievermogen in vitro mogelijk maakt.

Een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem voor de studie van membraankrommingsgevoelige eiwitten in vitro

Het huidige protocol beschrijft octanol-assisted liposome assembly (OLA), een microfluïdische techniek om biocompatibele liposomen te genereren. OLA produceert monodisperse, micron-sized liposomen met efficiënte inkapseling, waardoor onmiddellijke experimenten op de chip mogelijk zijn. Dit protocol is naar verwachting bijzonder geschikt voor synthetische biologie en synthetisch celonderzoek.

On-chip octanol-geassisteerde liposoomassemblage voor bio-engineering

Dit protocol presenteert een verbeterde ontvormprocedure voor de Polydimethylsiloxane (PDMS) dubbelgiettechniek door siliconenolie te introduceren als een niet-klevende barrière tussen PDMS-lagen. In tegenstelling tot plasma- of chemische oppervlaktemodificatiemethoden, vereist deze aanpak geen gespecialiseerde of dure apparatuur, waardoor het een toegankelijker en kosteneffectiever alternatief is.

Verbeterd dubbel gieten van polydimethylsiloxaan (PDMS) via behandeling met siliconenolie voor dicht opeengepakte replicatie van microstructuren

Leer een geautomatiseerde methode voor lipidebilaagvorming met polydimethylsiloxaan dunne film. Deze techniek maakt reproduceerbare membraanvorming binnen een uur mogelijk voor membraan-eiwitinteractiestudies.

Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film

Meer video's verkennen