Name: Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Leer CARS-microscopie implementeren op een standaard multiphoton laser scanning microscoop met Ti:sapphire en OPO lasers. Deze labelvrije methode maakt chemisch selectieve beeldvorming van levende cellen mogelijk voor biologisch en neuro-wetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, Frankrijk) bedanken voor de lening van de snelle oscilloscoop en erkennen de financiële steun van Montpellier RIO Imaging (MRI). HR erkent ANR-subsidies France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) en France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructuurnetwerken voor coherente Raman-beeldvormingsontwikkelingen. Dit werk werd hoofdzakelijk ondersteund door een European Research Council-subsidie (FP7-IDEAS-ERC 311610) en een INSERM - AVENIR-subsidie aan NT.

<ol><li>Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValeur%2C+B+%22Molecular+Fluorescence%3A+Principles+and+Applications%22">Molecular Fluorescence: Principles and Applications</a>. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+imaging+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JOSA+B%22%5BJournal%5D)">Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy.</a> JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).</li>
<li>Yelin, D., Silberberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+scanning+third-harmonic-generation+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology.</a> Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+Second-Harmonic+Generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li>
<li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).</li>
<li>Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).</li>
<li>Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+imaging+and+scoring+of+collagen+in+fibrotic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues.</a> Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+Instrumentation%2C+theory%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications.</a> J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).</li>
<li>Volkmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+and+microspectroscopies+based+on+coherent+anti-Stokes+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+D%3A+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy.</a> J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).</li>
<li>Evans, C. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+chemical+imaging+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).</li>
<li>Mukamel, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMukamel%2C+S+%22Principles+of+nonlinear+optical+spectroscopy%22">Principles of nonlinear optical spectroscopy</a>. , Oxford University Press. New York. (1995).</li>
<li>Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope.</a> Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).</li>
<li>Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vibrational+imaging+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering.</a> Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).</li>
<li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+%28CARS%29+and+Stimulated+Raman+Scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipid+metabolism+in+live+Caenorhabditis+elegans+using+fingerprint+vibrations%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+and+applications+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology.</a> Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).</li>
<li>Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diffusion+in+the+human+nail+measured+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).</li>
<li>Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+molecular+cutaneous+absorption+in+human+skin+using+label+free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy.</a> J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).</li>
<li>Kano, H., Hamaguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-nonlinear+optical+imaging+of+a+living+cell+using+a+supercontinuum+light+source+generated+from+a+photonic+crystal+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber.</a> Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).</li>
<li>Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+parametric+oscillator-based+light+source+for+coherent+Raman+scattering+microscopy%3A+practical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview.</a> J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106(2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimodal+platform+for+nonlinear+optical+microscopy+and+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy.</a> Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).</li>
<li>Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Photonics+Rev%22%5BJournal%5D)">Multimodal nonlinear optical microscopy.</a> Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).</li>
<li>Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multimodal+nonlinear+optical+microscopy+reveals+fundamental+insights+of+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development.</a> Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).</li>
<li>Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+imaging+of+atherosclerotic+lesions+using+multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007(2007).</li>
<li>Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+disease+and+enlightening+biomedicine%3A+Raman+spectroscopy+as+a+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool.</a> Analyst. 138, 3871-3884 (2013).</li>
<li>A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator">http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator</a> (2015).</li>
<li>Ozçelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pals1+is+a+major+regulator+of+the+epithelial-like+polarization+and+the+extension+of+the+myelin+sheath+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves.</a> J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).</li>
<li>Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+saturated+and+unsaturated+lipids+by+wide-field+CARS-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy.</a> Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).</li>
<li>Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+spectra+measurement+of+olive+oil+and+other+vegetable+oils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils.</a> J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).</li>
<li>King, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy%3A+normal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Handb.+Clin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy: normal structure.</a> Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).</li>
<li>Monsma, P. C., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoroMyelin+Red+is+a+bright%2C+photostable+and+non-toxic+fluorescent+stain+for+live+imaging+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin.</a> J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).</li>
<li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).</li>
<li>Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chasing+lipids+in+health+and+diseases+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vib.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).</li>
<li>Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal%2C+3D+in+vivo+imaging+of+sebaceous+glands+by+coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+normal+function+and+response+to+cryotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy.</a> J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De meest uitdagende gedeelte van het werk is de tijd synchroniseren van de laserstralen. Het vereist een snelle fotodiode gecombineerd met een snelle oscilloscoop, maar slechts een ruwe overlapping in de tijd kan worden uitgevoerd op het eerste. Dan is een verdere aanpassing van enkele cm is vereist. Tenslotte micrometer beweegt met een lineaire translatietafel maakt het uitvoeren van de uiteindelijke fijnafstelling van de vertragingslijn lengte teneinde het CARS kan activeren. Dit signaal wordt in een smal traject van ...

Optische microscopie is een belangrijke techniek voor destructieve visualisatie van dynamische processen in levende biologische systemen met een subcellulaire resolutie. Fluorescentiemicroscopie is momenteel de meest populaire imaging contrast gebruikt in levende cellen door zijn hoge specificiteit en gevoeligheid 1. Een groot palet van fluorescerende probes is ontstaan ​​(exogene kleurstoffen, genetisch gecodeerde eiwitten, halfgeleider nanodeeltjes). Verschillende sample belichting fluorescerende gebaseerde technieken bloeide (zoals confocale of twee-foton microscopie) voor 3D beeldvorming uit te voeren en een grootste nadeel van deze techniek is fotobleken 2 verminderen. Andere beperkingen zijn de verplichting fluorofoor labeling aangezien de meeste moleculaire soorten niet intrinsiek fluorescerend en bijgevolg worden fluoroforen moeten kunstmatig worden geïntroduceerd in de afgebeelde monster. Deze kunstmatige manipulatie kan in het bijzonder storend zijn voor kleine moleculen of induceert pottiële foto-toxiciteit. Deze redenen maken fluorescentiemicroscopie niet goed geschikt voor in-vivo observaties. Derhalve wordt de toepassing van optische beeldvorming met een hoge gevoeligheid en specifieke moleculaire contrasten zonder gebruik van fluorescerende moleculen in biomedische wetenschap zeer wenselijk. Verschillende niet-lineaire optische beeldvorming zonder etikettering of vlekken ontstaan, met inbegrip van de tweede-harmonische generatie (SHG) 3,4 en derde-harmonische generatie (THG) 5. SHG microscopie werd gebruikt om het structurele regeling op supramoleculaire niveau zoals microtubuli of collageen 6. THG wordt opgewekt uit optische heterogeniteiten als interface tussen een waterig medium en lipiden 7. THG werd ook aangetoond dat het myeline 8,9. Beide technieken kunnen worden uitgevoerd op een twee-foton fluorescentiemicroscoop en vereisen slechts een laserstraal. Maar ze vereisen een hoog vermogen laser-intensiteit (doorgaans 50mW bij 860 nm voor SHG 10, 25 - 50 mW bij 1180 nm voor THG 9), die schadelijk is in levende monsters, en voorzien niet in de chemische specificiteit die nodig is om op ondubbelzinnige wijze het specifieke biologische structuren. Chemisch selectieve beeldvorming kan worden verkregen uit inherent vibratiespectroscopie signalen op basis van Raman scattering. Wanneer een lichtstraal raakt Overigens kan fotonen worden geabsorbeerd en verstrooid door atomen of moleculen. De meeste van de verstrooide fotonen wordt dezelfde energie, dat wil zeggen, frequentie als de invallende fotonen. Dit proces heet Rayleigh verstrooiing. Echter een klein aantal fotonen verstrooid op een optische frequentie verschillend van de frequentie van de invallende fotonen, dwz een inelastische verstrooiing genoemd Raman verstrooiing. Het verschil in energie is afkomstig van excitatie van vibrationele modes afhankelijk van de moleculaire structuur en milieu. Daarom spontane Raman scattering provides chemisch selectieve beeldvorming als verschillende moleculen hebben specifieke trillingsfrequenties. Het is echter beperkt vanwege de extreem zwak signaal. Confocale Raman microscopie ontwikkeld en biedt 3D ruimtelijke resolutie, maar vereist hoog gemiddeld vermogen en lange acquisitietijd 11. Om deze moeilijkheden te overwinnen, recente ontwikkelingen in de lasertechnologie hebben toegelaten dat de opkomst van niet-lineaire optische vibratie microscopie, in het bijzonder coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) 11,12,13. CARS is een derde-orde niet-lineaire optische proces. Drie laserstralen, bestaande uit een pompbundel bij frequentie ω P, een Stokes straal bij frequentie ω S en een testbundel (meestal zijn de pomp) gericht in een monster en het genereren van een anti-Stokes straal bij frequentie ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. De anti-Stokes signaal kan aanzienlijk worden versterkt wanneer het frequentieverschiltussen de pomp en de Stokes balken is afgestemd op een Raman vibratiespectroscopie Ω = R (ω P - ω S). CARS signaal op basis van meerdere fotonen interactie. Het genereert dan ook een coherent signaal ordes van grootte sterker dan spontane Raman scattering. CARS microscopie werd eerst experimenteel aangetoond door Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Verbeterde vervolgens de techniek door twee gerichte nabij-infrarood femtoseconde laserbundels met een objectieflens van een hoge numerieke apertuur, waardoor de phase matching voorwaarde CARS en worden de twee-foton niet-resonante 16 achtergrond. CARS microscopy heeft daarom ontwikkeld tot een krachtig hulpmiddel voor in levende cellen en weefsels imaging, door chemische detecteren moleculen zoals lipiden (via CH strekvibratie) 17,18, water (via OH rek trillingen), eiwitten, DNA in levende cellen 19,20 maar ook gedeutereerde chemische verbindings voor de farmaceutische en cosmetische toepassingen 21 22. De belangrijkste beperking van lineaire microscopie afkomstig van de complexiteit en de kosten van de optische bronnen. Een CARS systeem vereist twee golflengte afstembare lasers met korte puls duur en met tijd en ruimte gesynchroniseerde puls treinen. Vroege CARS microscopen waren gebaseerd op twee gesynchroniseerde picoseconde Ti: saffier lasers 20. CARS imaging werd ook verkregen uit één femtoseconde Ti: saffier laser genereren van een supercontinuum lichtbron 23. Onlangs laserbronnen uit één enkel femtoseconde Ti: saffier laser is het pompen van een afstembare optische parametrische oscillatoren (OPO) gebruikt voor CARS microscopie. Deze set-up maakt intrinsiek tijdelijk gesynchroniseerd balken met een verschil van frequentie tussen de pomp en de Stokes bundel die het volledige moleculaire vibratiespectrum 24. Bovendien laser scanning microscoop gebaseerd op omzetkey fs laser en een OPO, in de eerste plaats gebruikt voor twee-foton fluorescentie (TPF) zijn nu beschikbaar voor niet-fysici. Het potentieel van een dergelijke set-ups kan sterk worden verbeterd, zonder dat aanvullende investeringen door de incorporatie van andere niet-lineaire optische beeldvorming, aangezien elke niet-lineaire (NLO) beeldvormingmodaliteit gevoelig is voor specifieke structuren of moleculen. Multimodale beeldvorming NLO kapitaliseert dus het potentieel van NLO microscopie voor complexe biologische monsters 25. De koppeling van deze technieken is het onderzoeken van vele biologische vragen toegestaan, met name op de vetstofwisseling, huid of kanker ontwikkelen 26, skeletspier ontwikkeling 27, atherosclerotische lesies 28. Bovendien is de toepassing van laserstralen met CARS geeft het vermogen van hoge frequentie imaging, dwz een aantrekkelijk middel om dynamische processen in vivo. Het doel van dit werk is om elke stap uit te voeren t tonenhij CARS-techniek op een standaard multiphoton laser scanning microscoop. De microscoop is gebaseerd op een FSEC Ti: saffier laser en een OPO (door de gepompte Ti: saffier laser) bediend door een software voor biologen. De integratie werd uitgevoerd door de lengte van een van de laserstraal pad om te synchroniseren tijdig de twee bundels. We beschrijven de stap-voor-stap uitvoering van deze techniek die op basisachtergrond experimentele optica nodig. We illustreren ook CARS beeldvorming verkregen op myelineschede van heupzenuw van knaagdieren, en laten we deze beeldvorming kan gelijktijdig worden uitgevoerd met andere niet-lineaire optische beeldvorming, zoals standaard twee-foton fluorescentie-techniek en de tweede-harmonische generatie.

<table><tbody><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TDS 520D</td><td>500 MHz&nbsp;</td></tr><tr><td>Photodetector</td><td>Thorlabs</td><td>DET08C/M, T4290</td><td>5 GHz InGaAs, 800 - 1.700 nm</td></tr><tr><td>Ti:Saffier laser Chameleon Ultra Family II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optische parametrische oscillator OPO Compact Family</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Examiner microscoop LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gemotoriseerde periscoop</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectief W Plan-Apochromat 20X/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straalverbinder</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acousto-optische modulator</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO vermogen demper</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotovermenigvuldigingsbuis</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filters</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM BiG 1935-176</td><td>400 - 480 nm; 500 - 550&nbsp;nm; 465 - 610&nbsp;nm</td></tr><tr><td>Dichroic spiegel</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Cutoff golflengte 760&nbsp;nm</td></tr><tr><td>Zilveren spiegels</td><td>Newport</td><td>10D20ER.2&nbsp;</td><td>&lambda;/10, 480 - 20.000&nbsp;nm, Aantal 4</td></tr><tr><td>Eén-assige translatie stage met standaard micrometer</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>Aantal 1</td></tr><tr><td>Aluminium breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>MB1015/M&nbsp;</td><td>Aantal 1</td></tr><tr><td>Spiegelmontage</td><td>Thorlabs</td><td>KMSS/M&nbsp;</td><td>Aantal 4</td></tr><tr><td>Spiegelhouder voor &Oslash;1" Optica&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>MH25</td><td>Aantal 4</td></tr><tr><td>Iris diafragma's&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>ID8/M</td><td>Aantal 3</td></tr><tr><td>Beschermende doos</td><td>Thorlabs</td><td>TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S</td><td>Aantal 1</td></tr><tr><td>Optische posts</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M</td><td>Aantal 8 (lengten afhankelijk van de set-up)</td></tr><tr><td>661 - 690 nm bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>676/29 nm BrightLine&reg; single-band bandpass filter</td><td>Aantal 1</td></tr><tr><td>Fluorescente kralen</td><td>ThermoFisher</td><td>TetraSpeck&trade; Fluorescent Microspheres Size Kit</td><td></td></tr><tr><td>Laser bekijkkaart</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>IR laser bekijkkaart</td></tr><tr><td>Laser veiligheidsglas</td><td>Newport</td><td>LV-F22.P5L07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FluoroMyelin&trade; Red Fluorescent Myelin Stain&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>F34652</td><td></td></tr></tbody></table>

implementatie van een coherent anti-stokes raman scattering (cars) system op een ti: sapphire en opo laser gebaseerde standard laser scanning microscoop

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopen combineren van een femtoseconde Ti: saffier laser en een optische parametrische oscillator (OPO) om de laser lijn te dupliceren zijn beschikbaar voor biologen geworden. Deze systemen zijn voornamelijk ontworpen voor multi-channel twee-foton fluorescentiemicroscopie. Echter, zonder enige wijziging, aanvullende non-lineaire optische microscopie, zoals de tweede-harmonische generatie (SHG) of derde harmonische generatie (THG) kan ook worden uitgevoerd met deze set-up, waardoor label-free imaging van gestructureerde moleculen of waterige middellange lipide interfaces. Deze technieken zijn zeer geschikt voor in-vivo observatie, maar zijn beperkt chemische specificiteit. Chemisch selectieve beeldvorming kan worden verkregen uit inherent trillingen signalen op basis van Raman scattering. Confocale Raman microscopie biedt 3D-ruimtelijke resolutie, maar het vereist een hoge gemiddelde vermogen en lange acquisitie tijd. Om deze problemen op te lossen, hebben recente ontwikkelingen in lasertechnologie de ont toegestaanwikkeling van niet-lineaire optische vibratie microscopie, in het bijzonder coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopie Daarom heeft ontpopt als een krachtig instrument voor biologische en live cell imaging, door het chemisch mapping lipiden (via CH stretch trillingen), water (via OH stretch trillingen), eiwitten of DNA. In dit werk beschrijven we de uitvoering van de CARS-techniek op een standaard-OPO gekoppeld multiphoton laser scanning microscoop. Het is gebaseerd op de in-tijdsynchronisatie van de twee laserlijnen door de lengte van een van de laserstraal pad. Wij presenteren een stap-voor-stap uitvoering van deze techniek op een bestaande multiphoton systeem. Een eenvoudige achtergrond in experimentele optiek is behulpzaam en de gepresenteerde systeem vereist geen dure aanvullende apparatuur. We tonen ook CARS afbeelden opgehaald op myelineschede van heupzenuw van knaagdieren, en laten we zien dat deze beeldvorming gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd met andere niet-lineaire optische beeldvorming, zoals standaardtwo-foton fluorescentie-techniek en de tweede-harmonische generatie.

<html> De pulstrein frequentie van de standaard Ti: saffier laser is meestal rond de 80 MHz. De OPO heeft dezelfde frequentie omdat deze wordt gepompt door de Ti: saffier laser. Een snelle oscilloscoop van ten minste 200 MHz is daarom noodzakelijk. Een snelle fotodiode in het bereik 600 tot 1100 nm is ook vereist. De maximale temporele verschuiving optreedt wanneer de Ti: saffier en de OPO worden verschoven van 1 / (2 x 80 x 10 6) = 6,2 nanoseconden. Het komt overeen met de ver...

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gebaseerd op inherente trilling van molecuul obligaties maakt label-free chemisch selectieve live cell imaging. Dit werk toont de uitvoering van een aanvullende microscopietechniek op een standaard multifoton laser scanning microscoop gebaseerd op een femtoseconde Ti: saffier laser en een OPO laser.

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Het algemene doel van deze procedure is het implementeren van een aanvullende microscopietechniek genaamd CARS, waarmee labelvrije, chemisch selectieve live-cell imaging mogelijk is op een standaard multi-foton laser-scanning microscoop op basis van een femtoseconde titanium-saffierlaser en een optische parametrische oscillator. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de biologie of neurowetenschappen, zoals het begrijpen van lipide-gerelateerde ziekten, penetratiemechanismen van de huid of huidaandoeningen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig te implementeren is op een standaard laser-scanning microscopie op basis van Ti:Saffier- en OPO-lasers.De procedure zal worden gedemonstreerd door Hassan Boukhaddaoui, research associate en hoofd van het imagingplatform van het laboratorium, en Vasyl Mytskaniuk. Zet de titanium-saffier- en OPO-lasers aan zoals beschreven in het tekstprotocol. Schakel de computer van de microscoop in.Zet de schakelaars van de microscoopcomponenten aan. Start de software door dubbel te klikken op het icoon op het bureaublad en stel deze in volgens het tekstprotocol. Plaats vervolgens een dichroï

implementation-coherent-anti-stokes-raman-scattering-cars-system-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een combinatie van drie enkele golflengte korte gepulste lasers wordt gebruikt om coherent anti-Stokes Raman scattering (auto's) en dubbel-resonante CARS (DR-CARS) te genereren. Het verschil tussen deze signalen zorgt voor een verbeterde gevoeligheid voor anders moeilijk te coherent Raman signalen te detecteren, waardoor beeldvorming van zwakke Raman scatterers.

Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Source: Espinoza, R., et al. Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis. J. Vis. Exp. (2022). The video demonstrates two-color stimulated Raman scattering (SRS) imaging of mouse brain tissue sections. Two synchronized laser beams are directed onto the tissue section to excite molecular vibrations, resulting in a relative intensity change in the beams. Lipids and proteins in the tissue are detected using distinct frequency pairs of the laser...

Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain Tissue

In dit manuscript wordt de implementatie beschreven van een gestimuleerde Raman verstrooiing (SRS) Microscoop, verkregen door de integratie van een SRS experimentele opstelling met een laser scanning microscoop. De SRS-Microscoop is gebaseerd op twee femtosecondelaser (FS) laserbronnen, een TI-Sapphire (TI: SA) en gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (OPO).

Implementatie van een niet-lineaire Microscoop op basis van gestimuleerde Raman verstrooiing

Een coherente Raman scattering imaging methodologie om farmaceutische verbindingen in de huid te visualiseren en te kwantificeren wordt beschreven. Dit artikel beschrijft huidweefselpreparaat (mens en muis) en topische formuleringstoepassing, beeldacquisitie om spatiotemporale concentratieprofielen te kwantificeren en voorlopige farmacokinetische analyse om de toediening van topische geneesmiddelen te beoordelen.

Visualiseren en kwantificeren van farmaceutische verbindingen in de huid met behulp van Coherent Raman Scattering Imaging

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.

Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose

Elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) beeldvorming van regenboogachtige Raman-kleurstoffen is een nieuw platform voor sterk gemultiplexte epitoop-gebaseerde eiwitbeeldvorming. Hier presenteren we een praktische gids met antilichaamvoorbereiding, weefselmonsterkleuring, SRS-microscoopassemblage en epr-SRS-weefselbeeldvorming.

Hoog-gemultiplexte weefselbeeldvorming met Raman-kleurstoffen

Dit artikel presenteert de integratie van een spectrale focusmodule en een dual-output pulslaser, waardoor snelle hyperspectrale beeldvorming van gouden nanodeeltjes en kankercellen mogelijk wordt. Dit werk is bedoeld om de details van multimodale niet-lineaire optische technieken te demonstreren op een standaard laserscanmicroscoop.

Biomoleculaire beeldvorming van cellulaire opname van nanodeeltjes met behulp van multimodale niet-lineaire optische microscopie

Dit artikel vergelijkt direct de resolutie, gevoeligheid en beeldcontrasten van gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) geïntegreerd in hetzelfde microscoopplatform. De resultaten laten zien dat CARS een betere ruimtelijke resolutie heeft, SRS betere contrasten en spectrale resolutie geeft, en beide methoden hebben een vergelijkbare gevoeligheid.

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

Het visualiseren van myelinisatie is een belangrijk doel voor veel onderzoekers die het zenuwstelsel bestuderen. CARS is een techniek die compatibel is met immunofluorescentie die lipiden in weefsel zoals de hersenen die gespecialiseerde structuren zoals myeline verlichten, native in beeld kan brengen.

Coherente Anti-Stokes Raman Spectroscopie (CARS) Toepassing voor Imaging Myelinisatie in Brain Slices

Leer CARS-microscopie implementeren op een standaard multiphoton laser scanning microscoop met Ti:sapphire en OPO lasers. Deze labelvrije methode maakt chemisch selectieve beeldvorming van levende cellen mogelijk voor biologisch en neuro-wetenschappelijk onderzoek.

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop (Video) | JoVE Journal

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop

Meer video's verkennen