Name: Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Leer CARS-microscopie implementeren op een standaard multiphoton laser scanning microscoop met Ti:sapphire en OPO lasers. Deze labelvrije methode maakt chemisch selectieve beeldvorming van levende cellen mogelijk voor biologisch en neuro-wetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, Frankrijk) bedanken voor de lening van de snelle oscilloscoop en erkennen de financiële steun van Montpellier RIO Imaging (MRI). HR erkent ANR-subsidies France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) en France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructuurnetwerken voor coherente Raman-beeldvormingsontwikkelingen. Dit werk werd hoofdzakelijk ondersteund door een European Research Council-subsidie (FP7-IDEAS-ERC 311610) en een INSERM - AVENIR-subsidie aan NT.

<ol><li>Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValeur%2C+B+%22Molecular+Fluorescence%3A+Principles+and+Applications%22">Molecular Fluorescence: Principles and Applications</a>. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+imaging+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JOSA+B%22%5BJournal%5D)">Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy.</a> JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).</li>
<li>Yelin, D., Silberberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+scanning+third-harmonic-generation+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology.</a> Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+Second-Harmonic+Generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li>
<li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).</li>
<li>Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).</li>
<li>Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+imaging+and+scoring+of+collagen+in+fibrotic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues.</a> Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+Instrumentation%2C+theory%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications.</a> J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).</li>
<li>Volkmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+and+microspectroscopies+based+on+coherent+anti-Stokes+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+D%3A+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy.</a> J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).</li>
<li>Evans, C. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+chemical+imaging+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).</li>
<li>Mukamel, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMukamel%2C+S+%22Principles+of+nonlinear+optical+spectroscopy%22">Principles of nonlinear optical spectroscopy</a>. , Oxford University Press. New York. (1995).</li>
<li>Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope.</a> Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).</li>
<li>Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vibrational+imaging+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering.</a> Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).</li>
<li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+%28CARS%29+and+Stimulated+Raman+Scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipid+metabolism+in+live+Caenorhabditis+elegans+using+fingerprint+vibrations%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+and+applications+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology.</a> Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).</li>
<li>Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diffusion+in+the+human+nail+measured+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).</li>
<li>Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+molecular+cutaneous+absorption+in+human+skin+using+label+free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy.</a> J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).</li>
<li>Kano, H., Hamaguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-nonlinear+optical+imaging+of+a+living+cell+using+a+supercontinuum+light+source+generated+from+a+photonic+crystal+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber.</a> Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).</li>
<li>Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+parametric+oscillator-based+light+source+for+coherent+Raman+scattering+microscopy%3A+practical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview.</a> J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106(2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimodal+platform+for+nonlinear+optical+microscopy+and+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy.</a> Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).</li>
<li>Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Photonics+Rev%22%5BJournal%5D)">Multimodal nonlinear optical microscopy.</a> Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).</li>
<li>Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multimodal+nonlinear+optical+microscopy+reveals+fundamental+insights+of+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development.</a> Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).</li>
<li>Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+imaging+of+atherosclerotic+lesions+using+multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007(2007).</li>
<li>Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+disease+and+enlightening+biomedicine%3A+Raman+spectroscopy+as+a+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool.</a> Analyst. 138, 3871-3884 (2013).</li>
<li>A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator">http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator</a> (2015).</li>
<li>Ozçelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pals1+is+a+major+regulator+of+the+epithelial-like+polarization+and+the+extension+of+the+myelin+sheath+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves.</a> J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).</li>
<li>Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+saturated+and+unsaturated+lipids+by+wide-field+CARS-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy.</a> Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).</li>
<li>Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+spectra+measurement+of+olive+oil+and+other+vegetable+oils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils.</a> J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).</li>
<li>King, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy%3A+normal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Handb.+Clin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy: normal structure.</a> Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).</li>
<li>Monsma, P. C., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoroMyelin+Red+is+a+bright%2C+photostable+and+non-toxic+fluorescent+stain+for+live+imaging+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin.</a> J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).</li>
<li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).</li>
<li>Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chasing+lipids+in+health+and+diseases+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vib.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).</li>
<li>Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal%2C+3D+in+vivo+imaging+of+sebaceous+glands+by+coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+normal+function+and+response+to+cryotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy.</a> J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De meest uitdagende gedeelte van het werk is de tijd synchroniseren van de laserstralen. Het vereist een snelle fotodiode gecombineerd met een snelle oscilloscoop, maar slechts een ruwe overlapping in de tijd kan worden uitgevoerd op het eerste. Dan is een verdere aanpassing van enkele cm is vereist. Tenslotte micrometer beweegt met een lineaire translatietafel maakt het uitvoeren van de uiteindelijke fijnafstelling van de vertragingslijn lengte teneinde het CARS kan activeren. Dit signaal wordt in een smal traject van ...

Optische microscopie is een belangrijke techniek voor destructieve visualisatie van dynamische processen in levende biologische systemen met een subcellulaire resolutie. Fluorescentiemicroscopie is momenteel de meest populaire imaging contrast gebruikt in levende cellen door zijn hoge specificiteit en gevoeligheid 1. Een groot palet van fluorescerende probes is ontstaan ​​(exogene kleurstoffen, genetisch gecodeerde eiwitten, halfgeleider nanodeeltjes). Verschillende sample belichting fluorescerende gebaseerde technieken bloeide (zoals confocale of twee-foton microscopie) voor 3D beeldvorming uit te voeren en een grootste nadeel van deze techniek is fotobleken 2 verminderen. Andere beperkingen zijn de verplichting fluorofoor labeling aangezien de meeste moleculaire soorten niet intrinsiek fluorescerend en bijgevolg worden fluoroforen moeten kunstmatig worden geïntroduceerd in de afgebeelde monster. Deze kunstmatige manipulatie kan in het bijzonder storend zijn voor kleine moleculen of induceert pottiële foto-toxiciteit. Deze redenen maken fluorescentiemicroscopie niet goed geschikt voor in-vivo observaties. Derhalve wordt de toepassing van optische beeldvorming met een hoge gevoeligheid en specifieke moleculaire contrasten zonder gebruik van fluorescerende moleculen in biomedische wetenschap zeer wenselijk. Verschillende niet-lineaire optische beeldvorming zonder etikettering of vlekken ontstaan, met inbegrip van de tweede-harmonische generatie (SHG) 3,4 en derde-harmonische generatie (THG) 5. SHG microscopie werd gebruikt om het structurele regeling op supramoleculaire niveau zoals microtubuli of collageen 6. THG wordt opgewekt uit optische heterogeniteiten als interface tussen een waterig medium en lipiden 7. THG werd ook aangetoond dat het myeline 8,9. Beide technieken kunnen worden uitgevoerd op een twee-foton fluorescentiemicroscoop en vereisen slechts een laserstraal. Maar ze vereisen een hoog vermogen laser-intensiteit (doorgaans 50mW bij 860 nm voor SHG 10, 25 - 50 mW bij 1180 nm voor THG 9), die schadelijk is in levende monsters, en voorzien niet in de chemische specificiteit die nodig is om op ondubbelzinnige wijze het specifieke biologische structuren. Chemisch selectieve beeldvorming kan worden verkregen uit inherent vibratiespectroscopie signalen op basis van Raman scattering. Wanneer een lichtstraal raakt Overigens kan fotonen worden geabsorbeerd en verstrooid door atomen of moleculen. De meeste van de verstrooide fotonen wordt dezelfde energie, dat wil zeggen, frequentie als de invallende fotonen. Dit proces heet Rayleigh verstrooiing. Echter een klein aantal fotonen verstrooid op een optische frequentie verschillend van de frequentie van de invallende fotonen, dwz een inelastische verstrooiing genoemd Raman verstrooiing. Het verschil in energie is afkomstig van excitatie van vibrationele modes afhankelijk van de moleculaire structuur en milieu. Daarom spontane Raman scattering provides chemisch selectieve beeldvorming als verschillende moleculen hebben specifieke trillingsfrequenties. Het is echter beperkt vanwege de extreem zwak signaal. Confocale Raman microscopie ontwikkeld en biedt 3D ruimtelijke resolutie, maar vereist hoog gemiddeld vermogen en lange acquisitietijd 11. Om deze moeilijkheden te overwinnen, recente ontwikkelingen in de lasertechnologie hebben toegelaten dat de opkomst van niet-lineaire optische vibratie microscopie, in het bijzonder coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) 11,12,13. CARS is een derde-orde niet-lineaire optische proces. Drie laserstralen, bestaande uit een pompbundel bij frequentie ω P, een Stokes straal bij frequentie ω S en een testbundel (meestal zijn de pomp) gericht in een monster en het genereren van een anti-Stokes straal bij frequentie ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. De anti-Stokes signaal kan aanzienlijk worden versterkt wanneer het frequentieverschiltussen de pomp en de Stokes balken is afgestemd op een Raman vibratiespectroscopie Ω = R (ω P - ω S). CARS signaal op basis van meerdere fotonen interactie. Het genereert dan ook een coherent signaal ordes van grootte sterker dan spontane Raman scattering. CARS microscopie werd eerst experimenteel aangetoond door Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Verbeterde vervolgens de techniek door twee gerichte nabij-infrarood femtoseconde laserbundels met een objectieflens van een hoge numerieke apertuur, waardoor de phase matching voorwaarde CARS en worden de twee-foton niet-resonante 16 achtergrond. CARS microscopy heeft daarom ontwikkeld tot een krachtig hulpmiddel voor in levende cellen en weefsels imaging, door chemische detecteren moleculen zoals lipiden (via CH strekvibratie) 17,18, water (via OH rek trillingen), eiwitten, DNA in levende cellen 19,20 maar ook gedeutereerde chemische verbindings voor de farmaceutische en cosmetische toepassingen 21 22. De belangrijkste beperking van lineaire microscopie afkomstig van de complexiteit en de kosten van de optische bronnen. Een CARS systeem vereist twee golflengte afstembare lasers met korte puls duur en met tijd en ruimte gesynchroniseerde puls treinen. Vroege CARS microscopen waren gebaseerd op twee gesynchroniseerde picoseconde Ti: saffier lasers 20. CARS imaging werd ook verkregen uit één femtoseconde Ti: saffier laser genereren van een supercontinuum lichtbron 23. Onlangs laserbronnen uit één enkel femtoseconde Ti: saffier laser is het pompen van een afstembare optische parametrische oscillatoren (OPO) gebruikt voor CARS microscopie. Deze set-up maakt intrinsiek tijdelijk gesynchroniseerd balken met een verschil van frequentie tussen de pomp en de Stokes bundel die het volledige moleculaire vibratiespectrum 24. Bovendien laser scanning microscoop gebaseerd op omzetkey fs laser en een OPO, in de eerste plaats gebruikt voor twee-foton fluorescentie (TPF) zijn nu beschikbaar voor niet-fysici. Het potentieel van een dergelijke set-ups kan sterk worden verbeterd, zonder dat aanvullende investeringen door de incorporatie van andere niet-lineaire optische beeldvorming, aangezien elke niet-lineaire (NLO) beeldvormingmodaliteit gevoelig is voor specifieke structuren of moleculen. Multimodale beeldvorming NLO kapitaliseert dus het potentieel van NLO microscopie voor complexe biologische monsters 25. De koppeling van deze technieken is het onderzoeken van vele biologische vragen toegestaan, met name op de vetstofwisseling, huid of kanker ontwikkelen 26, skeletspier ontwikkeling 27, atherosclerotische lesies 28. Bovendien is de toepassing van laserstralen met CARS geeft het vermogen van hoge frequentie imaging, dwz een aantrekkelijk middel om dynamische processen in vivo. Het doel van dit werk is om elke stap uit te voeren t tonenhij CARS-techniek op een standaard multiphoton laser scanning microscoop. De microscoop is gebaseerd op een FSEC Ti: saffier laser en een OPO (door de gepompte Ti: saffier laser) bediend door een software voor biologen. De integratie werd uitgevoerd door de lengte van een van de laserstraal pad om te synchroniseren tijdig de twee bundels. We beschrijven de stap-voor-stap uitvoering van deze techniek die op basisachtergrond experimentele optica nodig. We illustreren ook CARS beeldvorming verkregen op myelineschede van heupzenuw van knaagdieren, en laten we deze beeldvorming kan gelijktijdig worden uitgevoerd met andere niet-lineaire optische beeldvorming, zoals standaard twee-foton fluorescentie-techniek en de tweede-harmonische generatie.

<table><tbody><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TDS 520D</td><td>500 MHz&nbsp;</td></tr><tr><td>Photodetector</td><td>Thorlabs</td><td>DET08C/M, T4290</td><td>5 GHz InGaAs, 800 - 1.700 nm</td></tr><tr><td>Ti:Saffier laser Chameleon Ultra Family II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optische parametrische oscillator OPO Compact Family</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Examiner microscoop LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gemotoriseerde periscoop</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectief W Plan-Apochromat 20X/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straalverbinder</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acousto-optische modulator</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO vermogen demper</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotovermenigvuldigingsbuis</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filters</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM BiG 1935-176</td><td>400 - 480 nm; 500 - 550&nbsp;nm; 465 - 610&nbsp;nm</td></tr><tr><td>Dichroic spiegel</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Cutoff golflengte 760&nbsp;nm</td></tr><tr><td>Zilveren spiegels</td><td>Newport</td><td>10D20ER.2&nbsp;</td><td>&lambda;/10, 480 - 20.000&nbsp;nm, Aantal 4</td></tr><tr><td>Eén-assige translatie stage met standaard micrometer</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>Aantal 1</td></tr><tr><td>Aluminium breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>MB1015/M&nbsp;</td><td>Aantal 1</td></tr><tr><td>Spiegelmontage</td><td>Thorlabs</td><td>KMSS/M&nbsp;</td><td>Aantal 4</td></tr><tr><td>Spiegelhouder voor &Oslash;1" Optica&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>MH25</td><td>Aantal 4</td></tr><tr><td>Iris diafragma's&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>ID8/M</td><td>Aantal 3</td></tr><tr><td>Beschermende doos</td><td>Thorlabs</td><td>TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S</td><td>Aantal 1</td></tr><tr><td>Optische posts</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M</td><td>Aantal 8 (lengten afhankelijk van de set-up)</td></tr><tr><td>661 - 690 nm bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>676/29 nm BrightLine&reg; single-band bandpass filter</td><td>Aantal 1</td></tr><tr><td>Fluorescente kralen</td><td>ThermoFisher</td><td>TetraSpeck&trade; Fluorescent Microspheres Size Kit</td><td></td></tr><tr><td>Laser bekijkkaart</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>IR laser bekijkkaart</td></tr><tr><td>Laser veiligheidsglas</td><td>Newport</td><td>LV-F22.P5L07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FluoroMyelin&trade; Red Fluorescent Myelin Stain&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>F34652</td><td></td></tr></tbody></table>

implementatie van een coherent anti-stokes raman scattering (cars) system op een ti: sapphire en opo laser gebaseerde standard laser scanning microscoop

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopen combineren van een femtoseconde Ti: saffier laser en een optische parametrische oscillator (OPO) om de laser lijn te dupliceren zijn beschikbaar voor biologen geworden. Deze systemen zijn voornamelijk ontworpen voor multi-channel twee-foton fluorescentiemicroscopie. Echter, zonder enige wijziging, aanvullende non-lineaire optische microscopie, zoals de tweede-harmonische generatie (SHG) of derde harmonische generatie (THG) kan ook worden uitgevoerd met deze set-up, waardoor label-free imaging van gestructureerde moleculen of waterige middellange lipide interfaces. Deze technieken zijn zeer geschikt voor in-vivo observatie, maar zijn beperkt chemische specificiteit. Chemisch selectieve beeldvorming kan worden verkregen uit inherent trillingen signalen op basis van Raman scattering. Confocale Raman microscopie biedt 3D-ruimtelijke resolutie, maar het vereist een hoge gemiddelde vermogen en lange acquisitie tijd. Om deze problemen op te lossen, hebben recente ontwikkelingen in lasertechnologie de ont toegestaanwikkeling van niet-lineaire optische vibratie microscopie, in het bijzonder coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopie Daarom heeft ontpopt als een krachtig instrument voor biologische en live cell imaging, door het chemisch mapping lipiden (via CH stretch trillingen), water (via OH stretch trillingen), eiwitten of DNA. In dit werk beschrijven we de uitvoering van de CARS-techniek op een standaard-OPO gekoppeld multiphoton laser scanning microscoop. Het is gebaseerd op de in-tijdsynchronisatie van de twee laserlijnen door de lengte van een van de laserstraal pad. Wij presenteren een stap-voor-stap uitvoering van deze techniek op een bestaande multiphoton systeem. Een eenvoudige achtergrond in experimentele optiek is behulpzaam en de gepresenteerde systeem vereist geen dure aanvullende apparatuur. We tonen ook CARS afbeelden opgehaald op myelineschede van heupzenuw van knaagdieren, en laten we zien dat deze beeldvorming gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd met andere niet-lineaire optische beeldvorming, zoals standaardtwo-foton fluorescentie-techniek en de tweede-harmonische generatie.

<html> De pulstrein frequentie van de standaard Ti: saffier laser is meestal rond de 80 MHz. De OPO heeft dezelfde frequentie omdat deze wordt gepompt door de Ti: saffier laser. Een snelle oscilloscoop van ten minste 200 MHz is daarom noodzakelijk. Een snelle fotodiode in het bereik 600 tot 1100 nm is ook vereist. De maximale temporele verschuiving optreedt wanneer de Ti: saffier en de OPO worden verschoven van 1 / (2 x 80 x 10 6) = 6,2 nanoseconden. Het komt overeen met de ver...

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gebaseerd op inherente trilling van molecuul obligaties maakt label-free chemisch selectieve live cell imaging. Dit werk toont de uitvoering van een aanvullende microscopietechniek op een standaard multifoton laser scanning microscoop gebaseerd op een femtoseconde Ti: saffier laser en een OPO laser.

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Het algemene doel van deze procedure is het implementeren van een aanvullende microscopietechniek genaamd CARS, waarmee labelvrije, chemisch selectieve live-cell imaging mogelijk is op een standaard multi-foton laser-scanning microscoop op basis van een femtoseconde titanium-saffierlaser en een optische parametrische oscillator. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de biologie of neurowetenschappen, zoals het begrijpen van lipide-gerelateerde ziekten, penetratiemechanismen van de huid of huidaandoeningen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig te implementeren is op een standaard laser-scanning microscopie op basis van Ti:Saffier- en OPO-lasers.De procedure zal worden gedemonstreerd door Hassan Boukhaddaoui, research associate en hoofd van het imagingplatform van het laboratorium, en Vasyl Mytskaniuk. Zet de titanium-saffier- en OPO-lasers aan zoals beschreven in het tekstprotocol. Schakel de computer van de microscoop in.Zet de schakelaars van de microscoopcomponenten aan. Start de software door dubbel te klikken op het icoon op het bureaublad en stel deze in volgens het tekstprotocol. Plaats vervolgens een dichroïsche spiegel met een cutoff-golflengte van 760 nanometers in de schuif van de zijpoort.Bevind dit in de oneindigheidsruimte boven het objectiefrevolver. Stel het smalbandige passfilter en de reflectorkubus voor PMT1 in om uitsluitend het CARS-signaal bij 670 nanometer te registreren om de gepresenteerde resultaten te reproduceren. Plaats vervolgens specifieke smalbandfilters voor PMT3 voor fluorescentie-observatie van het myeline, en voor PMT4 voor SHG-observatie.Stel in de software het signaal op de detector in met een ad hoc banddoorlaatfilter. Open de tool voor het lichtpad in het menu van de setupmanager in het tabblad acquisitie, activeer vervolgens de gewenste PMT en selecteer een kleur voor het kanaal. Gebruik bijvoorbeeld groen voor CARS en magenta voor SHG.De twee stralen die afkomstig zijn van dezelfde titanium-saffierlaser zijn niet gesynchroniseerd wanneer ze de microscoop bereiken, omdat de OPO-straal vertraging oploopt tijdens de generatie. Volg deze procedure om ze opnieuw te synchroniseren door de lengte van één van de laserstraalpaden aan te passen via de integratie van een vertragingslijn. Hiervoor is het gebruik van een snelle fotodiode en een snelle oscilloscoop vereist.Sluit eerst met BNC-kabels het ingangskanaal CH1 van de oscilloscoop aan op de elektrische BNC laser output sync out. Sluit vervolgens het ingangskanaal CH2 aan op de fotodiode. Selecteer daarna kanaal CH1 als trigger door op het trigger-menu te drukken, vervolgens op de knop source in het hoofdmenu en tot slot op de knop in het zijmenu die correspondeert met het als CH1 geselecteerde kanaal.Positioneer het nu en fixeer het met optische montagesteunen aan de fotodiode in het brandvlak van een 10x luchtmicroscoopobjectief. Definieer in de tool Kanalen de golflengte van de titanium-saffierlaser op 830 nanometers bij laag vermogen, wat minder is dan 1% van het volledige vermogen. Verklein in de tool Acquisitiemodus het scangebied tot één punt om de fotodiode met de kleinst mogelijke straal te belichten.Zet vervolgens de laserscan aan door op de continue-knop te klikken. Druk op Autoset op de oscilloscoop en verplaats de fotodiode handmatig om een pulstrein op het scherm van de oscilloscoop te krijgen. Druk op de run/stop-knop om het beeld te bevriezen.Schakel vervolgens de titanium-saffier laser-scan uit. Klik in de software op de tool Kanalen, deselecteer de 830 nanometer laser en stel het OPO-signaal in op 1107 nanometer en laag vermogen. Schakel daarna de OPO laser-scan in, registreer de pulstreinen van de OPO-laser op de oscilloscoop en schakel de OPO laser-scan uit.Vergelijk nu de temporele verschuiving tussen de titanium-saffier- en de OPO-signalen. Bereken de lengte van de vertragingslijn, die zal worden gebruikt om de spiegels te positioneren. Zet voordat u verdergaat een veiligheidsbril op en verwijder eventuele kettingarmbanden of horloges van de polsen.Open nu de laser titanium-saffierlijn waar de vertragingslijn zal worden geïmplementeerd door de beschermbuizen te verwijderen. Selecteer vervolgens een golflengte in het zichtbare bereik om de laserstraal gemakkelijk te kunnen waarnemen, bijvoorbeeld 700 nanometers bij een laag vermogen, en schakel de laserscan in. Plaats nu twee irisdiafragma's in de open laserlijn met behulp van de optische montagestaven.Positioneer één iris bij de uitgang van de vertragingslijn en plaats de andere iris bij de ingang van de periscoop. Verklein vervolgens de opening van het irisdiafragma en pas de posities van de diafragma's aan om deze af te stemmen op het pad van de laserstraal, waarna ze op de optische tafel worden vastgezet. Pas tot slot de verticale positie van een derde mobiel irisdiafragma aan.De diafragma's dienen als controle voor de uitlijnprocedure om de positie van de laserstraal te controleren terwijl de vier spiegels van de vertragingslijn opeenvolgend worden geplaatst. Plaats nu spiegel M1 op een compacte kinematische spiegelhouder bij de ingang van de vertragingslijn en stel de positie en oriëntatie ervan in om de straalhoogte te handhaven met behulp van het mobiele irisdiafragma. Plaats vervolgens spiegels M2 en M3 in een hoek van 90 graden op de translatietafel volgens de berekende lengte van de vertragingslijn en stel hun oriëntatie in met behulp van het mobiele irisdiafragma.Plaats M4 bij de uitgang van de vertragingslijn vlak voor de iris en pas de positie en hoek zorgvuldig aan zodat deze aansluit op het pad van de laserstraal door de twee vaste irisdiafragma's. Plaats nu de laser-viewingkaart bij de uitgang van het microscoopobjectief en controleer het laserstraalprofiel. Pas indien nodig de oriëntatie van M4 licht aan om een uniforme heldere schijf waar te nemen.Positioneer tot slot de snelle fotodiode onder de laserstraal in het focusvlak van het monster. Observeer vervolgens de temporele verschuiving tussen de titanium-saffier laserstraal en de OPO-straal op de oscilloscoop. Indien nodig kan de lengte van de vertragingslijn worden gewijzigd door de gehele translatiepodia te verplaatsen om de pulsen te synchroniseren.De ruimtelijke overlap van de twee bundels die nodig is voor een CARS-signaal wordt verkregen door fluorescentie-polystyreenkraaltjes te visualiseren die op een microscoopglas zijn gefixeerd. Focus op de kraaltjes met een 20x waterobjectief. Voeg nu in de tool Kanalen van het acquisitietabblad spoor één toe, of gebruik het bestaande spoor.Selecteer de golflengte van 830 nanometer en een laag vermogen voor de titanium-saffier laserstraal. Wijzig de kleur naar groen in het vak van spoor één in het venster Kanalen, en in het vak PMT3 of PMT4 in het venster lichtpad. Voeg vervolgens spoor twee toe voor de OPO-laserstraal en stel de golflengte in op 1107 nanometer en een laag vermogen.Wijzig de kleur naar rood in het vak van spoor twee in het venster Kanalen en in het vak PMT3 of PMT4 in het venster lichtpad. Selecteer nu het maximale scangebied en stel de gain van beide sporen in op 600. Pas vervolgens opeenvolgend de scan van de twee bundels op het monster toe door op continu te klikken.Observeer het beeld in het schermgedeelte in de 2D-weergave. Verhoog het vermogen van beide lasers. Verplaats indien nodig de focusknop iets om het focusvlak van de beads te vinden.Pas tenslotte de uitsnede aan en zoom in op een enkele kraal of op een groep aangrenzende kralen. Gebruik vervolgens de periscoopcontroller om de stralen in het XY-vlak te laten overlappen. Open in de software het tabblad Maintain.Klik op de systeemopties en open het venster voor het gemotoriseerde periscoopinstrument. Verdere details worden besproken in het tekstprotocol. Nadat de beelden van beide laserstralen over elkaar zijn gelegd, is de synchronisatie voltooid.Om de nauwkeurige temporele afstelling te bereiken om CARS te activeren, bereidt u een glazen objectglas voor met een druppel olijfolie en een dekglas. Focus vervolgens met een 20x waterimmersie-objectief op de rand van het dekglas. Stel nu, op kanaal één, de golflengte in op 830 nanometers voor de titanium-saffier laserstraal en op 1107 nanometers voor de OPO.Schakel beide lasers in spoor één in voor een simultane scan. Begin met beide lasers op een laag vermogen. Vink vervolgens in het venster van het lichtpad PMT4 uit en selecteer PMT1.Kies vervolgens het maximale scangebied en schakel de laserscans in door op de continue-knop te klikken. Stel de gain in op 600 en verhoog, indien nodig, het vermogen van beide lasers. Pas daarna de weergave-intensiteit aan in het bedieningsblok voor de weergave-opties.Beweeg vervolgens langzaam de translatiepodium van de vertragingslijn totdat het signaal aanzienlijk wordt versterkt. Verlaag daarna het vermogen van beide lasers. Controleer nu of het een CARS-signaal is door om en om een van de twee lasers uit te schakelen.Als de signaalintensiteit afneemt of verdwijnt, is er een CARS-signaal verkregen. Aangezien het uiteindelijke systeem bestemd is voor niet-natuurkundigen, dient de lichtweg van de vertragingslijn te worden omsloten met een behuizingskast en buizen om directe toegang tot een schadelijke, onzichtbare laserstraal met een hoog piekvermogen te voorkomen. Zorg er echter voor dat de knop van de translatietafel toegankelijk blijft.Een fluor-myeline rode kleurstof, die selectief is voor myeline, werd gebruikt om de myelineschede waar te nemen. Gelijktijdige belichting bij 830 en 1095 nanometer levert een CARS-signaal op. De cirkels komen overeen met de myelineschede rondom axonen in een transversale doorsnede.Dezelfde structuur is zichtbaar bij het overlappen van CARS- en fluorescentiebeelden. Het detailniveau van CARS en fluorescentielabeling is zeer vergelijkbaar. Dit zou het gebruik van kleurstoffen potentieel overbodig maken.Het systeem kan tegelijkertijd ook een tweede harmonische signaal genereren van de collageenvezels aan het buitenste oppervlak van de nervus ischiadicus. Er wordt een andere detector gebruikt om een signaal bij 550 nanometer vast te leggen, aangezien een smalbandig filter bij 670 nanometer wordt gebruikt voor de registratie van het CARS-signaal. De vezels zijn weergegeven in een valse magenta kleur.Het CARS-signaal alleen toont duidelijk de myelinescheden. Door beide signalen gelijktijdig te visualiseren, zijn de myelinescheden in het groen te zien, omringd door collageenvezels in magenta. Een CARS-signaal vereist minder energie dan SHG- of THG-signalen.CARS-signalen werden bereikt met 4 mW bij 830 nm en 13 mW bij 1095 nm, terwijl 50 mW bij 1095 nm nodig was om een SHG-signaal te verkrijgen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u stap voor stap een van de laserstraalpaden kunt aanpassen om beide laserstralen temporeel te synchroniseren. De implementatie van de vertragingslijn kan in enkele weken worden gerealiseerd door biologen met een basiskennis van experimentele optica of in samenwerking met natuurkundigen.Vergeet niet dat het werken met onzichtbare laserstralen met een hoog vermogen extreem gevaarlijk kan zijn. Er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van een veiligheidsbril tijdens het uitvoeren van de procedure en het definitief inkapselen van het pad van de laserstraal.

implementation-coherent-anti-stokes-raman-scattering-cars-system-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een combinatie van drie enkele golflengte korte gepulste lasers wordt gebruikt om coherent anti-Stokes Raman scattering (auto's) en dubbel-resonante CARS (DR-CARS) te genereren. Het verschil tussen deze signalen zorgt voor een verbeterde gevoeligheid voor anders moeilijk te coherent Raman signalen te detecteren, waardoor beeldvorming van zwakke Raman scatterers.

Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Source: Espinoza, R., et al. Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis. J. Vis. Exp. (2022). The video demonstrates two-color stimulated Raman scattering (SRS) imaging of mouse brain tissue sections. Two synchronized laser beams are directed onto the tissue section to excite molecular vibrations, resulting in a relative intensity change in the beams. Lipids and proteins in the tissue are detected using distinct frequency pairs of the laser...

Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain Tissue

In dit manuscript wordt de implementatie beschreven van een gestimuleerde Raman verstrooiing (SRS) Microscoop, verkregen door de integratie van een SRS experimentele opstelling met een laser scanning microscoop. De SRS-Microscoop is gebaseerd op twee femtosecondelaser (FS) laserbronnen, een TI-Sapphire (TI: SA) en gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (OPO).

Implementatie van een niet-lineaire Microscoop op basis van gestimuleerde Raman verstrooiing

Een coherente Raman scattering imaging methodologie om farmaceutische verbindingen in de huid te visualiseren en te kwantificeren wordt beschreven. Dit artikel beschrijft huidweefselpreparaat (mens en muis) en topische formuleringstoepassing, beeldacquisitie om spatiotemporale concentratieprofielen te kwantificeren en voorlopige farmacokinetische analyse om de toediening van topische geneesmiddelen te beoordelen.

Visualiseren en kwantificeren van farmaceutische verbindingen in de huid met behulp van Coherent Raman Scattering Imaging

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.

Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose

Elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) beeldvorming van regenboogachtige Raman-kleurstoffen is een nieuw platform voor sterk gemultiplexte epitoop-gebaseerde eiwitbeeldvorming. Hier presenteren we een praktische gids met antilichaamvoorbereiding, weefselmonsterkleuring, SRS-microscoopassemblage en epr-SRS-weefselbeeldvorming.

Hoog-gemultiplexte weefselbeeldvorming met Raman-kleurstoffen

Dit artikel presenteert de integratie van een spectrale focusmodule en een dual-output pulslaser, waardoor snelle hyperspectrale beeldvorming van gouden nanodeeltjes en kankercellen mogelijk wordt. Dit werk is bedoeld om de details van multimodale niet-lineaire optische technieken te demonstreren op een standaard laserscanmicroscoop.

Biomoleculaire beeldvorming van cellulaire opname van nanodeeltjes met behulp van multimodale niet-lineaire optische microscopie

Dit artikel vergelijkt direct de resolutie, gevoeligheid en beeldcontrasten van gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) geïntegreerd in hetzelfde microscoopplatform. De resultaten laten zien dat CARS een betere ruimtelijke resolutie heeft, SRS betere contrasten en spectrale resolutie geeft, en beide methoden hebben een vergelijkbare gevoeligheid.

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

Het visualiseren van myelinisatie is een belangrijk doel voor veel onderzoekers die het zenuwstelsel bestuderen. CARS is een techniek die compatibel is met immunofluorescentie die lipiden in weefsel zoals de hersenen die gespecialiseerde structuren zoals myeline verlichten, native in beeld kan brengen.

Coherente Anti-Stokes Raman Spectroscopie (CARS) Toepassing voor Imaging Myelinisatie in Brain Slices

Leer CARS-microscopie implementeren op een standaard multiphoton laser scanning microscoop met Ti:sapphire en OPO lasers. Deze labelvrije methode maakt chemisch selectieve beeldvorming van levende cellen mogelijk voor biologisch en neuro-wetenschappelijk onderzoek.

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop (Video) | JoVE Journal

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop

Meer video's verkennen