Name: Het meten van granulocyten en monocyten fagocytose en oxidatieve Burst activiteit in menselijk bloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Leer fagocytose en oxidatieve burst activiteit meten bij granulocyten en monocyten in menselijk bloed. Deze eenvoudige methode onderzoekt aangeboren immuniteit en kan worden aangepast aan verschillende laboratoriumbronnen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Zack Shue, Casey John en Lynn Cialdella-Kam erkennen voor hun hulp bij het optimaliseren van deze procedure.

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit manuscript wordt stap voor stap protocol voor de bepaling van twee indicatoren van granulocyt monocyt en functie. We hebben een aantal stappen die cruciaal zijn voor het succes van deze assay worden geïdentificeerd. Een dergelijke stap is het ijsbad incubatie die onmiddellijk voorafgaand aan de toevoeging van bacteriën plaatsvindt. Grondige koeling van alle monsters zal het effect van de temperatuur op fagocytose en OB-activiteit te minimaliseren. Een andere belangrijke stap is de toevoeging van bacteriën aan elk mo...

De granulocyten en monocyten fagocytose / oxidatieve burst (OB) activiteitstest is een eenvoudige, ongecompliceerde techniek die vaak wordt gebruikt om informatie over aangeboren immuunsysteem langdurige en intensieve inspanning verzamelen. 1-4 Bij de studie van de reactie van het immuunsysteem op een stimulus, granulocyten en monocyten zijn van bijzonder belang omdat ze een centrale rol in de afweer spelen en zijn de eerste immuuncellen te accumuleren op de plaats van infectie. 5 neutrofielen, een type granulocyt, zijn de eerste cellen te transloceren in beschadigde spieren weefsel na intensieve inspanning. 6 fagocytose en OB activiteit zijn de meest voorkomende maatregelen en granulocyt monocyt functie 7 en de voorkeur als indicatoren van innate immune celfunctie vanwege hun centrale rol in zowel het infectieproces en het herstelproces. De test in dit manuscript utili beschrevenZes een basis flowcytometer om een ​​kwantitatieve bepaling van granulocyten en monocyten fagocytose en OB activiteit in volbloed te bieden. Het gebruik van volbloed, deze techniek is voordelig omdat het de bepaling worden uitgevoerd zonder tijdrovende zuiveringsprocedure. Deze test kan eenvoudig worden aangepast om verschillende onderzoeksopzet en lab oplossingen geschikt. Bijvoorbeeld, Liao et al. Gebruik gemaakt van een soortgelijke techniek die neutrofielen OB activiteit vertonen toeneemt en neutrofielen fagocytose verminderd na traumatisch hersenletsel. 8 In een ander voorbeeld, McFarlin et al. Beschreef een elegante modificatie van deze techniek die gebruikt allofycocyanine (APC ) geconjugeerd CD66b en high-performance tandem APC-geconjugeerde CD45 labeling met image-based flowcytometrie naar granulocyten te classificeren in termen van hun fagocytose en OB activiteiten. 7,9 Onze onderzoeksgroep heeft diverse aanpassingen van deze te gebruikenchnique als indicator van het aangeboren immuunsysteem van overgewicht, obesitas en atletische populaties bijna 20 jaar. 10,11 De onderstaande tekst zal de lezer stap-voor-stap instructies voor het uitvoeren van deze test en lichte delen die de lezer aanpassen aan de behoeften van hun onderzoek voldoen.

<table><tbody><tr><td>12 x 75 mm tubes, with cap</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>Je hebt 2 buisjes nodig per monster ("H" en "F") plus 3 buisjes per batch (voor assay controles; "F", "H", en "Alleen bloed").</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top 0.2 &micro;m cellulose acetate filter (500 ml capacity)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-741-07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, powder</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE)</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;(Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC)</td><td>Life Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;(Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled</td><td>Life Technologies</td><td>S-2859</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried</td><td>VWR</td><td>BD367861</td><td>Je hebt 1 K2EDTA bloedopvangbuisje nodig per monster.</td></tr><tr><td>4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated</td><td>VWR</td><td>BD367884</td><td>Je hebt 1 Lithium Heparin bloedopvangbuisje nodig per monster.</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff CP</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605705</td><td>d.w.z., hematologie analyzer</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff Rinse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff Fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff Cal Calibrator</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff Control Plus</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff Diluent</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;l extended-length pipette tips</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>Insulated ice pan</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>Voor ijswaterbad.</td></tr><tr><td>Open metal tube rack</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>TQ-Prep Workstation</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605429</td><td>d.w.z., geautomatiseerde cel lyse voorbereidingswerkstation</td></tr><tr><td>ImmunoPrep Reagent System</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>d.w.z., RBC lyse/WBC fix reagens systeem</td></tr><tr><td>Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlow Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>COULTER CLENZ</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check Fluorospheres&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td>d.w.z., uitlijning en fluidica verificatie fluorosferen</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>d.w.z., flowcytometrie analyse software</td></tr><tr><td>Excel Software</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel</td><td>d.w.z., elektronisch spreadsheet programma</td></tr></tbody></table>

het meten van granulocyten en monocyten fagocytose en oxidatieve burst activiteit in menselijk bloed

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

De granulocyt- en monocytenfagocytose en oxidatieve burst (OB) activiteitstest kan worden gebruikt om het aangeboren immuunsysteem te bestuderen. Dit manuscript geeft de nodige methodologie om deze test toe te voegen aan een oefenimmunologiearsenaal. De eerste stap in deze test is het bereiden van twee aliquoten ("H" en "F") van vol bloed (heparine). Vervolgens wordt dihydroethidium toegevoegd aan het H-aliquot, en beide aliquoten worden geïncubeerd in een warm waterbad gevolgd door een koud waterbad. Daarna wordt Staphylococcus aureus (S. aureus) toegevoegd aan het H-aliquot en fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabelde S. aureus wordt toegevoegd aan het F-aliquot (bacteriën:fagocyt = 8:1), en beide aliquoten worden geïncubeerd in een warm waterbad gevolgd door een koud waterbad. Vervolgens wordt trypanblauw toegevoegd aan elk aliquot om extracellulaire fluorescentie te blussen, en de cellen worden gewassen met fosfaatgebufferd zoutoplossing. Daarna worden de rode bloedcellen gelyseerd en worden de witte bloedcellen gefixeerd. Ten slotte worden een flowcytometer en geschikte analysesoftware gebruikt om granulocyt- en monocytenfagocytose en OB-activiteit te meten. Deze test wordt al meer dan 20 jaar gebruikt. Na zware en langdurige inspanning ervaren atleten een significante maar voorbijgaande toename van fagocytose en een langdurige afname van OB-activiteit. De toename van fagocytose na inspanning is gecorreleerd met ontsteking. In tegenstelling tot personen met een normaal gewicht is granulocyt- en monocytenfagocytose chronisch verhoogd bij overgewicht en obese deelnemers, en is matig gecorreleerd met C-reactief proteïne. Samenvattend, meet deze op flowcytometrie gebaseerde test de fagocytose en OB-activiteit van fagocyten en kan worden gebruikt als een aanvullende maatstaf voor door oefening en obesitas geïnduceerde ontsteking.

Langdurige en intensieve lichaamsbeweging heeft ingrijpende gevolgen voor aangeboren immuunsysteem, met inbegrip van natuurlijke killer celfunctie, macrofaag-cytokine-gemedieerde reactie op virale infectie, en granulocyten en monocyten fagocytose en OB activiteit. Meerdere studies tonen aan dat granulocyten en monocyten fagocytose aanzienlijk toeneemt na het sporten, als gevolg van de ontsteking veroorzaakt door spierbeschadiging en metabole eisen. In contrast, granulocyten en monocyten ...

Het doel van dit manuscript is om een methode te presenteren voor het meten van fagocytose van monocyten en granulocyten en oxidatieve burstactiviteit in menselijke bloedmonsters.

Het meten van granulocyten en monocyten fagocytose en oxidatieve Burst activiteit in menselijk bloed

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Het algemene doel van deze assay is het meten van de fagocytose en de oxidatieve burst-activiteit van granulocyten en monocyten in volbloed. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de immunologie, zoals de vraag hoe een specifieke dieetinterventie de immuunrespons op lichaamsbeweging beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige, directe assay is die gemakkelijk kan worden aangepast aan de beschikbare laboratoriumbronnen en onderzoeksbelangen.We gebruiken deze maat voor de aangeboren immuunfunctie al twintig jaar in veel van onze bewegingsonderzoeken, en we zullen later in de video enkele van deze gegevens delen. Voordat u met de procedure begint, gebruikt u een hematologie-analyzer om een volledig bloedbeeld met differentiatie van de witte bloedcellen uit te voeren op de bloedmonsters, volgens de instructies van de fabrikant. Noteer het aantal witte bloedcellen in cellen per milliliter en de percentages neutrofielen en monocyten voor de monsters.Gebruik vervolgens voor elke experimentele en controlebuis een verlengde pipetpunt om 100 µL van elk volbloedmonster over te brengen van de lithiumheparine-bloedafnamebuis naar de bodem van een适当 gelabelde buis van 12 bij 75 mm. Wanneer al het bloed is overgebracht, voegt u 10 µL van de HE-werkoplossing toe aan de buizen die met rode inkt en een H zijn gelabeld, inclusief de HE-controlebuis. Verwijder de dopjes van de buizen.Vortex de monsters kort en breng de buisjes over naar een waterbad van 37 °C in een open metalen rek, waarbij elke vijf minuten voorzichtig wordt geschud. Na 15 minuten worden het rek en de buisjes snel overgebracht naar een ijswaterbad voor 12 minuten, met voorzichtig schudden elke vijf minuten. Voeg aan het einde van de incubatie het juiste volume niet-gelabelde S.aureus-werkoplossing toe aan de buisjes die zijn gelabeld met rode inkt en een H, inclusief de HE-controlebuis.Vortex de buisjes kortstondig met de doppen erop. Voeg vervolgens het juiste volume FITC-gelabelde S.aureus-werkoplossing toe aan de buisjes die met zwarte inkt en een F zijn gemarkeerd, inclusief de FITC-controlebuis, en vortex de monsters kortstondig. Incubeer daarna alle buisjes gedurende 20 minuten in het waterbad van 37 °C, waarbij elke vijf minuten wordt geschud, gevolgd door een afkoelperiode van één minuut in het ijswater.Nadat de monsters op kamertemperatuur zijn geplaatst, gebruikt u een repeaterpipet om 100 µL ijskoude quench-oplossing aan alle buisjes toe te voegen en vortexeert u de monsters. Plaats de monsters terug in het ijsbad. Voeg na één minuut met de repeaterpipet 1 mm ijskoud PBS toe aan elk van de buisjes.Vortex vervolgens de buisjes en voeg nog twee milliliter PBS toe aan de monsters. Centrifugeer nu de cellen en aspireer het supernatant. Voeg met de repeaterpipet 50 microliter ijskoude FBS toe aan de buisjes.Breng na het vortexen alle buisjes over naar een carrousel. Gebruik een geautomatiseerd werkstation voor cellysis-preparatie om de rode bloedcellen te lyseren en de witte bloedcellen te fixeren volgens de instructies van de fabrikant. Open, om de assay-resultaten via flowcytometrie te analyseren, de acquisitiesoftware van het flowcytometriesysteem en maak een nieuw protocol aan.Kies FITC voor de FL1-parameter voor de fagocytose-assay en HE voor de FL2-parameter voor de oxidatieve burst-activiteitsassay. Maak een dotplot van forward scatter tegenover side scatter, een FL1-histogram en een FL2-histogram. Creëer vervolgens polygonale regio's voor de populaties witte bloedcellen, granulocyten en monocyten op de dotplot van forward scatter tegenover side scatter en creëer lineaire regio's op de histogrammen.Voer nu de negatieve controlemonsters met alleen bloed uit, gevolgd door de positieve controlemonsters voor HE en FITC. Beoordeel de histogrammen en pas indien nodig de voltages van de fotomultiplicatorbuis van de FITC- en PE-kanalen aan. Start vervolgens de data-acquisitie voor de controlemonsters. Na een equilibratieperiode van 15 minuten worden de experimentele monsters volgens de volgorde op de werklijst in het carrousel geladen en wordt de analyse van de studiemonsters gestart.Om de fagocytische activiteit van de monsters te beoordelen, worden eerst alle F-gelabelde monsters en de databestanden in lijstmodus van de controles in één map verzameld, waarna de bestanden naar de monsterruimte in de software voor flowcytometrie-analyse worden gesleept. Dubbelklik op een controlemonster en gebruik de polygoon-gate-selector om een gate voor de totale populatie witte bloedcellen in te stellen, waarbij erop wordt gelet dat alle cellen aan de randen van het diagram worden meegenomen. Label deze gate als WBC.Dubbelklik op de WBC-gate en gebruik de elliptische gate-selector om de lymfocyten-gate in te stellen. Label de gate dienovereenkomstig en sleep het percentage gate-data naar de zijkant, zodat de cellen goed zichtbaar zijn. Gebruik vervolgens de polygoon-gate-selector om de granulocyten-gate en de monocyten-gate in te stellen.Label elke gate dienovereenkomstig en sleep het percentage gate-data naar de zijkant. Dubbelklik op het FITC-controlemonster en vervolgens op de granulocyt-gate en gebruik de vervolgkeuzemenu's om de X-as op FL1 en de Y-as op side scatter, of SS, in te stellen. Gebruik de vierkante gate-selector om een negatieve fagocytose-gate en een positieve fagocytose-gate in te stellen. Markeer de positieve fagocytose-gate van de granulocytenpopulatie.Klik vervolgens op Workspace en Add Statistic. Selecteer Geometric Mean en FL1 om de fluorescentie-intensiteit van de fagocytose-positieve granulocyten te genereren en klik op Add. Kies daarna de frequency of parent statistic en klik op Add om het percentage granulocyten te genereren dat fagocytose-positief is.Om deze instellingen op alle onderzoekssamples toe te passen, selecteert u alle gates en statistieken die in het FITC-controlesample zijn gemaakt, en sleept u deze naar het gebied All Samples in het groepspaneel. Sla het werk op als een WSP-bestand in dezelfde map waarin de map met list mode-gegevens zich bevindt. Klik nu op het eerste experimentele sample in de dataset en bevestig dat de white blood cell gate passend aansluit op de celdistributie van elk van de samples, waarbij u de randen van de gate indien nodig aanpast.Klik nu op de gate voor witte bloedcellen in het eerste experimentele monster en controleer of de gates voor granulocyten, monocyten en lymfocyten passen bij de celdistributie van elk van de monsters, waarbij u de gates indien nodig aanpast. Klik na het opslaan van het bestand op het icoon van de tabelbewerker en sleep elke relevante statistiek naar de tabel. Klik op 'Tabel maken' om de gegevens in een spreadsheetformaat weer te geven en sla het werk op als een XLSX-bestand.Herhaal vervolgens de analyse voor de H-gelabelde monsters van de oxidatieve burst-activiteit en de databestanden in de controlelijstmodus zoals zojuist gedemonstreerd. Zoals blijkt uit dit representatieve experiment, neemt de door granulocyten gemedieerde fagocytose van S.aureus direct na en 1,5 uur na een fietstocht van 75 kilometer toe, om de volgende ochtend weer terug te keren naar normaal. De oxidatieve burst-activiteit van granulocyten is gedurende ten minste 21 uur na dit niveau van activiteit verlaagd.Verder is er een bescheiden correlatie tussen granulocytfagocytose en serumwaarden van C-reactief proteïne, zoals waargenomen in deze analyse van 106 overgewichtige of obese vrouwen, wat erop wijst dat een hoge fagocytose van granulocyten en monocyten bij rustende proefpersonen indicatief kan zijn voor systemische ontsteking. Zodra de techniek onder knie is, kan deze voor ongeveer 30 monsters in zeven uur worden voltooid, mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de monsters volledig moeten afkoelen voordat de bacteriën worden toegevoegd, om elke onverklaarbare variabiliteit tussen de monsters te minimaliseren.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals cytokinekwantificering, worden uitgevoerd om het effect van uw interventie op de ontstekingsreactie te bepalen. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de immunologie om de effecten van diverse veranderingen in levensstijl en de aangeboren immuunfunctie bij mensen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u granulocyten- en monocytenfagocytose en de oxidatieve burst-activiteit kunt meten met een flowcytometer.Vergeet niet dat het werken met menselijk bloed uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van de juiste PBM, bij het uitvoeren van deze procedure.

measuring-granulocyte-monocyte-phagocytosis-oxidative-burst-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a method for quantifying the phagocytosis of FITC-labeled pathogenic fungal spores by human leukocytes. Phagocytosed spores are discerned from cell-adherent spores through counterstaining, followed by flow cytometric analysis.

Quantitative Flow Cytometric Measurement of Fungal Spore Phagocytosis by Human Phagocytes

This video demonstrates the assay to confirm phagocytic activity by cells in human blood via flow cytometry. The granulocytes and monocytes confirm their phagocytic activity by showing green and red fluorescence confirming the presence of engulfed bacteria and oxidative burst activity respectively.

An Assay to Assess Phagocytosis and Oxidative Burst Activity In Granulocytes and Monocytes

This video showcases a monocyte monolayer assay utilizing primary monocytes from peripheral blood to assess Fcγ receptor-mediated phagocytosis with poly D antibody-opsonized R2R2 red blood cells.

An Assay for Studying Fc&#947; Receptor-Driven Phagocytosis in Monocyte Monolayers

Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te...

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Bloed leukocyten en bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een marker van algemene bio-energetische gezondheid van een individu en dus de potentie om pathologische processen en het effect van behandeling te controleren. Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en meten mitochondriale functie en de oxidatieve uitbarsting in deze cellen.

Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes

Deze methode toont een techniek voor het beoordelen van de functie van granulocyten door gelijktijdig de fagocytose van bacteriën en oxidatieve burst te meten. Beeldgebaseerde flowcytometrie maakte het mogelijk om drie verschillende subsets van geactiveerde granulocyten te identificeren die allemaal verschilden in hun relatieve functionele capaciteit.

Image-based flowcytometrie Techniek om Veranderingen in Granulocyt Functie Evalueer In Vitro

De monocyt monolaag assay (MMA) is een in vitro assay dat geïsoleerde primaire monocyten gebruikt, verkregen uit perifeer vol bloed van zoogdieren, om Fcγ receptor (FcγR)-gemedieerde fagocytose te evalueren.

Toepassing van een monocyt monolaag Gehalte aan Fcy receptor-gemedieerde fagocytose evalueren

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Haemophilus influenzae induceert ontsteking in de luchtwegen. Dit artikel zal zich richten op het gebruik van flowcytometrie en confocale microscopie om immuunresponsen door fagocyten en lymfocyten als reactie op deze bacterie te definiëren.

Beoordeling van respiratoire immuunresponsen op Haemophilus Influenzae

We hebben verbeteringen en bijgewerkte methoden ontwikkeld voor de bestaande monocyt-monolaagtest (MMA), waarin macrofagen worden gebruikt om de klinische relevantie van allo-antilichamen van rode bloedcellen in transfusiegeneeskunde en immunologie beter te voorspellen. Deze test wordt de monocyt-macrofaagtest (M-MA) genoemd.

Voorspelling van de significantie van antilichamen tegen rode bloedcellen met behulp van de monocyt-macrofaagtest

Dit werk beschrijft een gestandaardiseerd in vitro protocol om de fagocytosepercentages van xenogene (humane) en allogene (ratten) rode bloedcellen te kwantificeren en te vergelijken door geïsoleerde macrofagen van ratten.

Een kwantitatieve beoordeling van de fagocytose van allogene en xenogene erytrocyten door macrofagen van ratten in vitro

Leer fagocytose en oxidatieve burst activiteit meten bij granulocyten en monocyten in menselijk bloed. Deze eenvoudige methode onderzoekt aangeboren immuniteit en kan worden aangepast aan verschillende laboratoriumbronnen.

Het meten van granulocyten en monocyten fagocytose en oxidatieve Burst activiteit in menselijk bloed

Meer video's verkennen