Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

Het algemene doel van deze procedure is om humane navelstrengvenendotheelcellen te kweken en cytoskeletaal dynamisch gedrag en celmigratie te analyseren met behulp van live cell time lapse imaging. De methoden die in deze video worden beschreven, kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cel-, moleculaire en mechanobiologie. Bijvoorbeeld, dit protocol kan worden gebruikt om te identificeren hoe celvorm en beweeglijkheid worden gemoduleerd door betrokkenheid van verschillende ECM's.

Visuele demonstratie is cruciaal omdat de voorbereidingsstappen moeilijk uit te voeren zijn. Ze vereisen nauwkeurige behandeling van de cellen op tijd door het hele proces. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de beweeglijkheid van endotheelcellen tijdens angiogenesis, kan deze ook worden toegepast op microscopisch onderzoek van vrijwel elk adhesief celmodelsysteem.

Gebruik pincetten om een dekglas op te pakken uit een 100% ethanol opslagpot en laat het door een Bunsen-brander vlam gaan om het te steriliseren. Plaats het dan in een 35 millimeter petrischaal. Bereid voor elk monster één dekglas voor.

Voeg aan een 1,5 milliliter microcentrifugebuis 10 microliters van een fibronectine voorraadoplossing van één milligram per milliliter en 990 microliters van PBS toe. Pipet vervolgens 250 microliters van de oplossing op elk dekglas. Verdeel de oplossing gelijkmatig om het oppervlak te bedekken.

Incubeer de dekglazen gedurende minimaal drie uur bij 37 graden Celsius. Spoel elk dekglas vóór gebruik drie keer met twee milliliter PBS. Bepaal met behulp van een hemocytometer het aantal gekweekte HUVEC's en breng een volume over dat 100.000 cellen per dekglas bevat voor niet-migratie-experimenten, of 500.000 cellen per dekglas voor migratie-experimenten naar een microcentrifugebuis.

Snel draaien de cellen bij 1.400 keer G gedurende vier minuten om ze te bezinken. Na het draaien, voor elke te testen conditie, hersuspendeer maximaal één miljoen cellen in 100 microliter elektroporatiebuffer en combineer ze met één microgram cDNA. Breng de cellen over naar een elektroporatiecuvet.

Transfecteer de cellen en DNA-mengsel met behulp van het programma dat is aangewezen voor HUVEC-elektroporatie. Red de getransfecteerde cellen vervolgens door 500 microliter compleet endoteel basaal medium toe te voegen. Plateer vervolgens het juiste celvolume op fibronectine-gecoate dekglazen.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vier uur om tijd te geven voor de expressie van de cDNA-constructen. Bereid u voor op beeldvorming door twee stroken dubbelzijdig plakband van 2,5 centimeter bij 0,65 centimeter te nemen en deze horizontaal langs de boven- en onderrand van een schone glazen plaat te bevestigen. Let op dat het belangrijk is om een kleine hoeveelheid ruimte tussen het plakband en de plaatrand te laten voor het afdichten van de kamer.

Monteer het dekglas met de celzijde naar beneden zodat de twee randen van het dekglas op het plakband rusten. Gebruik pincetten om voorzichtig naar beneden te drukken om het dekglas vast te zetten. Voeg met behulp van een micropipet 40 microliter beeldvormingsmedium toe tussen het dekglas en de plaat.

Zorg ervoor dat de ruimte tussen het dekglas en de plaat volledig gevuld is met beeldvormingsmedium. Dek eventueel eventuele overtollig medium af met een papieren doek. Dicht alle randen van de plaat af met warm VALAP.

Controleer op lekkages door zachtjes op het glazen dekglas te drukken. Plaats het gemonteerde en afgedichte dekglas op een microscooptafel die voorverwarmd is tot 37 graden Celsius. Gebruik een spinning disk confocale microscoop om time lapse beeldsequenties, blauw fluorescente eiwitbeelden en DIC-beelden vast te leggen.

Analyseer de microtubuli-dynamiek en co-lokalisatie zoals beschreven in het begeleidende document. Om een celmigratie-assay uit te voeren, red de getransfecteerde cellen na de elektroporatiestap door 80 microliter compleet endoteel basaal medium toe te voegen. Pipet vervolgens het hele 80 microliter monster als een enkele druppel op het centrum van een gedroogd fibronectine-gecoat dekglas.

Verspreid de druppel niet. Het drogen van het dekglas is noodzakelijk om te voorkomen dat de 80 microliter druppel zich scheidt bij contact met het dekglas. Deze aanpak zorgt ervoor dat HUVEC's worden geconcentreerd binnen een klein gebied van het dekglas en bevordert daarmee de snelle vorming van een confluente monolaag van cellen.

Incubeer het dekglas gedurende drie tot vier uur bij 37 graden Celsius om de cellen tijd te geven om te hechten in een confluente monolaag. Spoel vervolgens de platen twee keer in compleet endoteel basaal medium om eventuele cellen die niet hebben gehecht te verwijderen. Om een wondrand op de HUVEC-monolaag te creëren, gebruik pincetten om het dekglas voorzichtig op zijn plaats te houden en trek stevig een scheermes over het midden van de celmonolaag.

Laat de cellen drie uur herstellen in een incubator van 37 graden Celsius. Monteer vervolgens en monteer de dekglazen voor beeldvorming zoals eerder. Verzamel fasecontrastbeelden met tussenpozen van 10 minuten gedurende 12 uur met behulp van een 10X 0,45 numerieke aperture fase objectief en een 0,52 numerieke aperture lang werkafstand condensor.

Gebruik het ND Acquisition-paneel van het beeldverwervingssoftwareprogramma. Ten slotte kwantificeer HUVEC-vertakking en migratie zoals beschreven in het begeleidende document. HUVEC's werden getransfecteerd om mApple-gelabeld-EB3 te exprimeren, een microtubuli-einde-bindend eiwit en time lapse-beelden werden vastgelegd.

Ruwe afbeeldingen van EB3 worden aan de linkerkant getoond. Blauwe EB3-kometen gevolgd door plusTipTracker-software worden aan de rechterkant getoond. Kometen die binnen elk frame werden gedetecteerd, werden gekoppeld op basis van hun verandering in positie van frame tot frame om EB3-tracks en een visuele EB3-track-overlay te genereren, zoals hier getoond.

Langzame, kortstondige microtubuli-groei wordt weergegeven in rood, langzame, langdurige