Name: Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Leer hoe je microtubuli-dynamiek analyseert in levende humane navelstreng endotheelcellen met behulp van time-lapse beeldvorming. Deze methode onthult cytoskeletgedrag en celmigratie voor angiogenese-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Met speciale dank aan Dr. Clare M. Waterman voor mentorschap en discussies, Michelle Baird en Mike Davidson voor het verstrekken van veel van de tl-cDNA constructen gebruikt in deze studies, en Kathryn Applegate en Gaudenz Danuser voor het ontwikkelen van plusTipTracker MT analyse software. Dit werk werd ondersteund, gedeeltelijk, door een subsidie ​​aan KAM van het National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) en de National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Met behulp van HUVECs in morfologie en migratie experimenten. Levende cellen beeldvorming van EB3 gemerkte MT groeidynamiek in HUVEC vereist geschikte en reproduceerbare celkweek voorwaarden om te meten en beoordelen veranderingen in MT groei en morfologie HUVEC, zodat ze vervolgens kunnen worden toegewezen aan een ECM-signalerend cue. HUVECs vertegenwoordigen een uitstekend model voor het bestuderen van de cel vorm en beweeglijkheid. Ze zijn zeer vatbaar voor transfectie met fluorescent gelabelde cDNA, ze vertonen dramatische morfologie in reactie op zowel oplosbare en fysieke signalering signalen, en ze behouden de mogelijkheid om zich te organiseren in vasculaire tubes indien passende celkweekomstandigheden 65-70. Primaire celkweken, zoals HUVEC, zorgvuldig worden behandeld en worden bewaakt cellen passage nummer om te bereiken de cellen gezond en dat ze gewoonlijk gedragen tijdens experimenteren. Bijvoorbeeld, bij het uitvoeren van experimenten die de cytoskeleton en / of celmorfologie dient HUVEC niet worden gebruikt voor experimenten na de tiende celcultuur passage, zoals HUVEC&#39;s beginnen meestal aan niet-uniforme morfologie rond doorgang twaalf tot vijftien weergegeven. Celdichtheid is ook een kritische regulator van HUVEC gezondheid en proliferatie. HUVEC vertakking onderzoeken (zie protocol 10,1-10,4 hierboven) gebruikt relatief lage celdichtheid kweken teneinde de cellen fysieke ruimte om met ECM en vertakte uitsteeksels verlengen. In tegenstelling, in de wond-edge migratie studies (zie Protocol 10,5-10,8), HUVEC zijn cultuur in een monolaag voorafgaand aan de verwonding. Als zodanig gewikkeld rand HUVEC relatief niet-vertakte morfologie weergegeven verlengen voorrand uitsteeksels en vertonen cel-cel interacties met hun directe buren als ze migreren in de wond. Voorbehoud en voordelen van Tracking MT Dynamiek in Living HUVEC&#39;s. Draaiende schijf microscopie is een uitstekende benaderingtesten experimentele hypothesen die confocale helderheid van het beeld met een hoge tijdsresolutie vereisen. Met de juiste camera en laser module, dit microscopie benadering is gevoelig voor lage emissie fluorescentie en kan helpen bij verminderde fotobleken vergelijking met andere soorten van fluorescentie microscopie. Belangrijk is dat deze benadering ook zeer geschikt voor matige tot hoge tijdsresolutie beeldvorming zoals vereist voor het genereren van uitgebreide metingen van MT groeidynamiek met de EB3 labeling benadering in verschillende celtypen. Terwijl de EB3 methode etikettering groeiende MT plus-uiteinden heeft verschillende voordelen boven andere methoden van fluorescent labeling MTS, maar heeft ook unieke nadelen. Zo is er een deel van de MT array niet actief groeit op een bepaald moment, zowel de populatie demonteren MT en de populatie van stabiele, niet-dynamische MT 71-74. EB3 zouden deze twee populaties van MT&#39;s labelen endus de bijdrage van deze twee populaties zouden niet bij experimentele gegevensanalyse. Alternatieve methoden voor het evalueren van de gehele matrix MT gericht op expressie van fluorescent gelabeld tubuline, die wordt opgenomen in alle populaties van MT en kunnen worden vastgesteld groeien, krimpen en stabiele MT. Vanwege de relatief hoge dichtheid van de MT matrix nabij het centrum van de cel en grenzend aan het microtubule organiserende centrum (MTOC) merken van het gehele MT matrix creëert een nadeel uitvoeren beeldanalyse van MT uiteinden die niet vlak bij de cel periferie 75-77. Experimenten met twee-color co-labeling met fluorescerende MTS tubuline en fluorescerende EB3 in levende cellen is gebleken, kwalitatief, dat de overgrote meerderheid van tubuline-gelabelde MTs ook EB3-gelabelde 78. Daarnaast is er geen efficiënte methode geautomatiseerd volgen van MT gelabeld met fluorescerende tubuline geweest. Dit betekent dat de gegevens inzametie en metingen van MT dynamica in cellen die fluorescent tubuline vereisen kant volgen van individuele MTS, een proces dat foutgevoelig en vervelend. Daardoor is geautomatiseerde computeranalyse van EB3 gemerkte MT worden de geprefereerde methode voor het meten MT dynamiek kan worden toegepast op MT dynamiek experimenten in talrijke celsoorten en bij verschillende experimentele regimes 35,79. Het koppelen van MT groeidynamiek om HUVEC morfologie en migratie. Vanuit een cytoskelet onderzoeker, een uiterst nuttig aanpassing van de plusTipTracker geautomatiseerde analyse volgen is het vermogen te meten en zowel volledige cellen en regionale veranderingen in MT groeidynamiek evalueren. De eis voor een cel om gepolariseerd is een essentiële voorwaarde voor directionele cel migratie. Als zodanig gepolariseerd signalering signalen zijn al lange tijd bekend als de belangrijkste drijvende factoren voor gerichte celmigratie 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. Oplosbare signaalmoleculen zoals VEGF induceren actine polymerisatie en MT groei naar de cue VEGF in endotheliale celsoorten 2,82-87. Bovendien, als reactie op fysieke interactie met de ECM (bijvoorbeeld compliance en dimensionaliteit mechanosensing), HUVEC moduleren hun MT dynamiek van lokaal regelen MAPs MT groei te bevorderen binnen verlengen vertakte uitsteeksels en dit dient om HUVEC migratie begeleiden in de richting van de cue 5,31,88. Aldus polarisatie in respons op extracellulaire signalen signalen benadrukt de noodzaak experimentele evaluatie van gelokaliseerde veranderingen in cytoskelet dynamiek. Tegelijkertijd live-cell imaging van MT groeidynamiek (de EB3 benadering) en HUVEC celmigratie is uiterst moeilijk zijn omdat MT groeien op een tijdschaal van seconden, terwijl veranderingen in celmorfologie en gerichte migratie plaatsvinden op een tijdschaal van uren. Maar beide processen zijn nauw linked. Bovendien, continue, snelle beeldvorming van fluorescent gelabelde EB3 op de tweede tijdschaal leidt tot fotobleken van de EB3 signaal. Pogingen om dit probleem op te lossen door het uitvoeren van beeldvorming korte reeks EB3 (1-2 min acquisitie serie) elke 30 minuten waren succesvol, maar kon slechts worden bereikt in een klein aantal EC dat optimale expressie van EB3 hadden en die niet weergegeven nadelige effecten herhaalde laserbelichting 5. Een alternatieve benadering die het mogelijk maakt voor interpretaties van hoe MT groeidynamiek bijdragen aan veranderingen in de cel morfologie en migratie is de plusTipTracker Region of Interest (ROI) gereedschap 35 (zie Protocol 6.6). Deze methodologie maakt volledige cellen MT groei circuits onderverdeeld in door de gebruiker gedefinieerde gebieden waaruit MT groei titels dan kunnen worden geëxtraheerd en geanalyseerd worden. Zo zijn vergelijkingen van &quot;vertakte&quot; versus &quot;niet-vertakte&quot; gebieden van de cel bleek dat MT groeien sbescheiden en aanhoudend binnen vertakte gebieden vergeleken met de niet-vertakte celperiferie 5. In gepolariseerde wond-edge HUVEC&#39;s, een vergelijking van de voorrand en achterrand groeidynamiek edge MT bleek dat-MCAK geïnduceerde MT demontage specifiek wordt geremd binnen de leading edge, maar niet de achterrand. Regionale evaluatie van de leidende en achterrand MT groeidynamiek in HUVEC uitdrukken Rac1 en / of fosforylering mutanten van MCAK verder bleek dat Rac1-geïnduceerde activering van Aurora-A kinase specifiek en lokaal MCAK activiteit remt binnen de leading edge om HUVEC polarisatie en directionele migratie rijden 31. Zo is de combinatie van geautomatiseerde volgen van MT groeidynamiek en regionale evaluatie van MT groei dynamiek binnen de vertakte uitsteeksels en / of de voorste rand van de wond-edge HUVEC heeft ons toegelaten om MT groeidynamiek koppelen aan HUVEC morfologie en migratie. De beschreven protocollen zijn designed om een ​​over het algemeen eenvoudig en zeer herhaalbare methodologie voor HUVEC cultuur en experimenteel onderzoek te bieden. Desalniettemin zijn veel van de protocol details zijn ingewikkeld en tijdrovend, hetgeen op zijn beurt biedt de kans op fouten of moeilijkheden bij het uitvoeren van de experimentele methode. Hoewel het werd geprobeerd om potentiële problemen aan te pakken in het hele protocol, hier is aanvullende, gedetailleerde oplossen van mogelijke problemen die minder vaak of anderszins afgekort als noten binnen de methodologie protocollen. Gerelateerd aan coating dekglaasjes met polyacrylamide substraten (2,2 Protocol), een gemeenschappelijk probleem dat zich voordoet is de complexiteit activeren dekglaasjes, polyacrylamide koppelen aan het glas, activerende polyacrylamide en vervolgens koppelen ECM het polyacrylamide. Een bijzonder moeilijk en potentieel problematische stap kweken van HUVEC op de fibronectine / polyacrylamidegel na blootstelling van de polyA-Crylamide beklede dekglaasjes tot 2 mM sulfo-SANPAH (stap 2.2.2.6 hierboven). Het is cruciaal voor het succes van het kweken van HUVEC volgende substraten die sulfo-SANPAH volledig verwijderd uit het volgende experimentele systeem ECM conjugatie. Dit kan het best worden bereikt door wassen met DDH 2 O en incuberen van de dekglaasjes in DDH 2 O op een schudder overnacht. Als cellen gekweekt op de polyacrylamide ECM niet overleven, of als levensvatbaarheid lager dan verwacht, vergroot en herhaald wassen van sulfo-SANPAH na conjugatie fibronectine (stap 2.2.2.9) wordt aanbevolen om mogelijk dit probleem te verlichten. Protocol 3 (cDNA transfectie en HUVEC cultuur op een dekglaasje) gerelateerd, een grote invloed op het succes van de elektroporatie werkwijze is de behandeling van de HUVEC zowel tijdens trypsine van de cellen om ze uit de kunststoffles verwijderen en na het sluiten van de elektroporatie (stappen 3,3-3,4, hierboven). Het is cruciaal om zorgde HUVECs volledig controleren terwijl in trypsine, en niet de tijd die nodig is voor de cellen &quot;round-up&quot; op het oppervlak van de kolf (typisch 1-2 min) overschrijden. Veel tijd in trypsine is een belangrijke oorzaak van dood HUVEC, die doorgaans niet gerealiseerd totdat de cellen op met fibronectine gecoate dekglaasjes (stap 3,4) uitgeplaat en vervolgens niet hechten aan het substraat. Even belangrijk, niet HUVEC&#39;s (en de meeste primaire celtypes) niet goed doen als geschorst voor lange tijd in de elektroporatie buffer. Tijdens grootschalige experimenten, bijvoorbeeld wanneer de gebruiker vijf of meer aandoeningen die elektroporatie vereist, is het beter om de cellen gepelleteerd in afzonderlijke buizen (1 tube per transfectie) één-per-tijd houden en te mengen, in de elektroporatie buffer onmiddellijk vóór elektroporatie. Deze aanpak minimaliseert de incubatietijd in elektroporatie buffer en maximale HUVEC overleven. Daarnaast onmiddellijke redding in volledige cultuur media is ook critical na elektroporatie. Redding vertraging van één minuut of meer elektroporatie kan tot vrijwel volledige HUVEC dood en derhalve moeten worden vermeden. Verwante celmigratie assay (Protocol 9), de techniek van het kweken van HUVEC&#39;s bij extreem hoge dichtheid hangt kritisch modificatie van de traditionele HUVEC celkweek methode (in Protocol 3 beschreven) (in stap 9.2 beschreven) dat drogen van de fibronectine gecoate dekglaasje vereist om HUVEC cultuur staat in een zeer klein gebied van het dekglaasje. Vaak wanneer het dekglaasje niet volledig gedroogd of vooraf bekleden van het dekglaasje met fibronectine (stappen 2,1 en 2,2) was niet efficiënt, het medium dat cellen bevat die is geplaatst op het dekglaasje zal de oppervlaktespanning verliezen en uit te breiden naar de randen van het dekglaasje, waardoor de dichtheid van cellen op het dekglaasje verminderen. Eén methode om dit potentiële probleem op te lossen is om de media te zuigen uit het dekglaasje enPlaats het dekglaasje (nog in de 35 mm gerecht) in de achterkant van de bioveiligheid kast voor 5-10 min. Deze aanpassing kan helpen om de luchtstroom binnen de kast mogelijk te helpen bij het drogen van de schotel. Als zichtbare vloeistof op het dekglaasje na drogen aan de lucht blijft, zuig het vloeibare vlekken en weer laat aan de lucht drogen voor 5-10 extra min in de bioveiligheid kast. Het is belangrijk op te merken dat er geen manier om dit potentiële probleem volledig te vermijden, maar wel minder een probleem met herhaalde oefening van het protocol worden. Het is ook een aanbeveling van het oplossen van problemen die bij de voorbereiding dekglaasjes voor de celmigratie assay (of een test, in het algemeen), om extra dekglaasjes bereiden en extra HUVEC&#39;s ready-to-go in geval van problemen langs de weg. Met deze problemen overwegingen in gedachten, is het ook belangrijk om de bruikbaarheid van de beschreven protocollen en hun gevolgen voortaan celbiologie onderzoek benadrukken. De toepasselijkheid van het polyacrylamide benadering is breed en omvat niet alleen tweedimensionale studies van cel-ECM engagement (hierboven beschreven), maar ook driedimensionale 5 onderzoeken. Deze toepassing is van cruciaal belang voor het vergroten van ons begrip van hoe HUVECs reguleren cel vorm en migratie in fysiologische omgevingen en moeten onderzoekers geven een fundamenteel begrip van hoe morfologische veranderingen worden gecoördineerd met het cytoskelet veranderingen. Hoewel de hier beschreven protocollen zijn gericht op metingen van MT groeidynamiek, de meeste protocollen kunnen en moeten worden aangepast om een ​​aantal andere microscopisch meetbare aspecten van cel-ECM interacties te meten. Wat MT dynamiek er tal MAPs, waarvan ten minste 14 families van kinesins 89, elk met een mogelijke rol bij HUVEC polariteit en gerichte migratie en die allemaal kunnen worden onderzocht met behulp van protocollen gepresenteerd. Toekomstig onderzoek moet eenLSO worden gericht op de cel-ECM engagement in normale versus zieke staten. HUVEC protocollen die hier van toepassing zijn op onderzoeken van normale vasculaire homeostatische processen, alsmede ziektetoestanden waaronder hartaandoeningen, retinopathie, tumorgroei en metastase, een paar te noemen. Vervoegen van zichtbaar transparante ECM&#39;s en polyacrylamide substraten van vatbaar naleving van microscopische studies zal zorgen voor cel-ECM betrokkenheid studies zodanig dat endotheelcellen vasculaire angiogenese kan worden gecontroleerd met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Deze soorten experimentele benaderingen zijn al begonnen met belangrijke verschillen in endotheliale cellen vorm, polariteit, migratie, en de effecten van eiwitten die deze processen reguleren 5,31,90 onthullen. Toekomstige inspanningen moeten gericht zijn om te bepalen hoe de combinatie van ECM compliance en dimensionaliteit mechanosensing kan dienen om lokaal de controle eiwitten die zich richten en reguleren cytoskelet dynamiek.

Angiogenese wordt geactiveerd door extracellulaire signalering signalen die endotheelcellen (EC) te bevorderen polariseren, migreren met directionele specificiteit en vormen nieuwe bloedvaten in weefsels die bloedtoevoer nodig. Bijdragende factoren gedacht om angiogenese rijden zijn signalen van de extracellulaire matrix (ECM). In reactie op fysieke signalen, EC uit te breiden nieuwe vestigingen met directionele specificiteit voor gerichte beweging te begeleiden bij de vorming van het vasculaire netwerk 1,2. De architectuur van EC morfologie en vertakking gedefinieerd gelokaliseerd regulering van de microtubuli (MT) cytoskelet op een manier die is afgestemd op de regulering van acto-myosine contractiliteit 3. Om EC takken te vormen, moet myosine-II lokaal worden neerwaarts gereguleerd, wat resulteert in gelokaliseerde membraan uitsteeksels 4. Op hetzelfde moment en op dezelfde locatie in de cel, raken MT groeidynamiek gewijzigd resulteert in trage en aanhoudende MT groei tak Elon bevorderenking en stabiliteit 5. Deze gecoördineerde cytoskelet verordening staat EC om hun morfologie polariseren om directionele migratie te vergemakkelijken. De ontwikkeling van een gepolariseerde celmorfologie vereist gepolariseerd MT monteren 6. In migrerende epitheelcellen, MT groeien langzaam en aanhoudend specifiek naar de voorrand van de cel 7-9; terwijl neuronen in de inleiding en verlenging van axonen en dendrieten vereist dat MT niet alleen aanwezig, maar dat ze dynamisch het proces van montage en demontage 10-15 ondergaan. Op deze wijze gelokaliseerde controle MT groeidynamiek bepaalt de architectuur van de cel en zorgt voor een snelle herinrichting van celmorfologie ECS navigeren door de ECM. MT groeidynamiek worden gereguleerd door families van moleculaire motor eiwitten en niet-motorische eiwitten, de zogenaamde microtubuli geassocieerde eiwitten of microtubuli interagerende eiwitten (voortaan afbeeldRred als Maps). Kaarten kunnen lokaal worden geactiveerd of geïnactiveerd, meestal door middel van signalering cascades gestart met de cel-ECM-interface 16,17. Eenmaal actief, MAP-functie door te binden aan het MT en de wijziging van de kinetiek van MT montage en demontage; daardoor functioneren om lokaal te regelen MT dynamiek om de cel vorm en polariteit 18-20 promoten. Mitotische Centromere Associated Kinesin (MCAK) is een Kinesin-13 familie MAP dat zich bindt aan MT uiteinden en koppels ATP hydrolyse tot MT demontage 21-23. Deze functionele rol van MCAK bekend kritiek in de mitotische spoel 24-28, alsook tijdens interfase 29,30 te zijn. Binnen tussenfase EC, wordt-MCAK bemiddeld MT demontage gereguleerd door gelokaliseerde Aurora-A-geïnduceerde fosforylering van MCAK in reactie op de wond-edge-geïnduceerde activering van de Rac1 kleine GTPase. Het resultaat van deze signaalcascade is de remming van MCAK aan de voorrand van EC, resulterend in gepolariseerd groei MT richting de leAding edge and-MCAK geïnduceerde MT demontage aan de achterrand van het migreren van EC 31. Traditionele methoden voor het bepalen MT groei dynamiek doorgaans gebruikt kant volgen van ofwel fluorescent gelabelde tubuline of, meer recent, fluorescent-gelabelde MT End Bindingseiwit 1 of 3 (EB1 of EB3 respectievelijk). De fluorescerende tubuline benadering het voordeel etikettering van MT gehele array. Omdat de meeste celtypen mitotische een radiale reeks MT houden tijdens interfase 8,32,33, MT vlakbij het ​​centrosoom zeer dicht en daardoor volgen groei MT en demontage fluorescerende tubuline is meestal beperkt tot de perifere gebieden van de cel. Vanwege deze beperkingen, is het gebruik van fluorescent gelabelde eiwitten EB (EB1 of EB3) de meest voorkomende aanpak voor het meten MT dynamiek geweest. Omdat EBS alleen de groeiende plus-uiteinden van MTs label, verschijnen ze als kleine (1-3 pm), fel tl koments, waardoor een gemakkelijk waarneembare marker MT polymerisatie met zeer beperkte achtergrondfluorescentie 34-37. Terwijl dat EBS label slechts een subset van de MT matrix is ​​een grote kracht van de EB benadering ook wijst op een belangrijke beperking zijn die niet groeiende MT niet gelabeld door het EB3 benadering. Desondanks moet het vermogen te meten en volgen EB3 kometen tijd en MT groei binnen subcellulaire&#39;s zichtbaar maakt deze aanpak geschikt voor toepassingen die regionale evaluatie van MT organisatie vereist. Een andere kritieke beperking van traditionele methoden voor het bepalen MT groeidynamiek is zeer grote gegevenssets en de tijd die nodig is voor gegevensanalyse. Deze beperking komt voort uit de noodzaak van de hand volgen van honderden EB kometen met een hoge tijdsresolutie. Bovendien moeten deze metingen uit te voeren in een statistisch significant aantal cellen en ook uitgevoerd onder verschillende controle- en experimental omstandigheden. Onlangs zijn deze beperkingen overwonnen door middel van geautomatiseerde analyse technieken die specifiek gericht zijn op het bijhouden van EB3 kometen met behulp van time-lapse microscopie in levende cellen 35. Bij juist onderhoud deze computationele benadering dient om zowel de kans op menselijke fouten in verband met de hand tracking naast voorzien in een high-throughput werkwijze voor het meten MT polymerisatie beperken. Computationele analyse van MT dynamiek met behulp van de MatLab-gebaseerde software pakket, plusTipTracker, zorgt voor metingen van MT groei door het bijhouden van fluorescent-gelabelde EB3 kometen 5,31,35,38. Daarnaast plusTipTracker software maakt het mogelijk voor berekeningen van MT catastrofe gebeurtenissen (aka demontage) op basis van de verdwijning van EB3 kometen binnen een groeiende MT spoor, en zorgt voor een sub-cellulaire (aka regionaal) analyse van MT groeidynamiek binnen de door de gebruiker gedefinieerde regio&#39;s van belang . Voor onze studies, werden MT groeidynamiek in vergelijking binnenvertakte gebieden versus niet-vertakte gebieden of binnen leidende versus trailing celranden. Gegevensuitvoer plusTipTracker software kan ook worden gebruikt om kleur gecodeerde overlays voor individuele cellen en subcellulaire&#39;s genereren. Hier beschrijven we de methode die werd gebruikt om de rol van MCAK bij het moduleren van MT groeidynamiek en de bijdrage van deze MT depolymerase om de regulering van de EC vertakking morfologie en directionele migratie te onderzoeken. Onze aanpak een primaire humane cellijn, humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC), die gemakkelijk gekweekt en zeer vatbaar voor elektroporatie-geïnduceerde, transiënte transfectie van plasmide cDNA zijn. We vervolgens gebruikt high-resolution, time-lapse fluorescentie microscopie van HUVECs getransfecteerd met MT Einde Binding eiwit 3 (EB3) en Mitotische Centromere Associated Kinesin (MCAK) -specifieke cDNA constructen te evalueren effecten op MT dynamiek getransfecteerde HUVEC&#39;s. PlusTipTracker-gebaseerde, computer beeldanalyse van EB3gemerkte MT plus uiteinden was om MT groei snelheden en MT groei levens te meten in time-lapse beelden, te meten en te vergelijken effecten van experimentele manipulaties op MT groeidynamiek. Deze methode maakt het mogelijk voor de studie van MT dynamiek en de identificatie van de manier waarop gelokaliseerde regulatie van MT dynamiek binnen sub-cellulaire regio&#39;s draagt ​​bij aan de angiogene processen van de EG-vertakking en migratie. Deze technieken zijn van toepassing op onderzoeken van elke MAP die fluorescent kunnen worden gelabeld en uitgedrukt in levende cellen.

<table><tbody><tr><td>Aurora A Inhibitor I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis solution</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash;mouse IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td><td>RPI Products</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Clara cooled charge-coupled device camera</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 donkey anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 goat anti-rat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Supply &amp; Growth Factors (contents shown below)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine brain extract 2.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulfate 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &#181;g Strep/ml)&nbsp; 10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Electronic shutter</td><td>Sutter instrument</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Protease inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-mouse</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Bevat de elektroporatiebuffer</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &#181;g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Pipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti&ndash;pT288&ndash;Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti&ndash;&alpha;-tubulin</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk&nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in living humane navelstreng endotheelcellen

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Het fysiologische proces waarbij nieuwe vaatwanden worden gevormd uit bestaande vaatwanden vereist specifieke signaalgebeurtenissen die morfologische veranderingen in afzonderlijke endotheelcellen (EC's) veroorzaken. Deze processen zijn cruciaal voor homeostatische onderhoud zoals wondgenezing en zijn ook belangrijk voor het bevorderen van tumorgroei en metastase. EC-morfologie wordt gedefinieerd door de organisatie van het cytoskelet, een strak gereguleerd systeem van actine- en microtubuli- (MT) dynamica dat bekend staat om het regelen van EC-vertakking, polariteit en directionele migratie, essentiële componenten van angiogenese. Om MT-dynamica te bestuderen, gebruikten we hoog-resolutie fluorescentiemicroscopie gekoppeld met computationele beeldanalyse van fluorescentie-gelabelde MT plus-einden om MT-groeidynamica en de regulatie van EC-vertakkingsmorfologie en directionele migratie te onderzoeken. Time-lapse beeldvorming van levende Humane Umbilicale Veneuze Endotheelcellen (HUVEC's) werd uitgevoerd na transfectie met fluorescentie-gelabelde MT End Binding proteïne 3 (EB3) en Mitotische Centromeer Geassocieerde Kinesine (MCAK)-specifieke cDNA-constructen om effecten op MT-dynamica te evalueren. PlusTipTracker software werd gebruikt om EB3-gelabelde MT-plus einden te volgen om MT-groeisnelheden en MT-groeitijdsduur in time-lapse beelden te meten. Deze methodologie maakt de studie van MT-dynamica mogelijk en de identificatie van hoe gelokaliseerde regulatie van MT-dynamica binnen subcellulaire gebieden bijdraagt aan de angiogenetische processen van EC-vertakking en migratie.

HUVEC cultuur live-cell microscopie Levende cellen beeldvorming van HUVECs expressie fluorescerende eiwitten vereist dat HUVEC&#39;s in een omgeving die geschikt is voor normale groei en onderhoudscel, evenals normale eiwit expressie en functie gehandhaafd. Figuur 1 toont een schematische weergave van het protocol gebruikt voor het bereiden van een gebufferde en gesloten systeem dat handhaaft geoptimaliseerd optische kenmerken voor het verzamelen van time-lapse beelden van levende cellen. Dunne stroken dubbelzijdig tape geplaatst op een glasplaatje (figuur 1A) en het dekglaasje met de gekweekte HUVEC omgekeerd boven de band zodanig dat de cellen worden geconfronteerd met de schuif (figuur 1B). Zo levert de band een kleine opening tussen de beide oppervlakken en creëert een ruimte waarin de cellen worden gebaad in geschikte celkweekmedium (figuur 1C, zie Protocol 4, hierboven). ikna laatste stap wordt de glazen dekglaasje gelast aan het glaasje met een vaseline: lanoline: paraffinewas (1: 1: 1 mengsel, valap Figuur 1D) een gesloten systeem. Deze celkweek aanpak werd gebruikt voor zowel de kortere tijdreeks beeldvorming van EB3 kometen en voor de langere tijdreeks vertakking en migratie experimenten. Bovendien, de wasachtige consistentie van valap zorgt voor gemakkelijke verwijdering uit de glasplaatje en dekglaasje aan het einde van een imagingexperiment zodat aanvullende benaderingen zoals fixatie en immunolabeling (zie Protocol 8), kunnen worden uitgevoerd op dezelfde dekglaasje en celmonster die werd gevisualiseerd met behulp van de live-cell imaging aanpak. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Figuur 1:. Methodologie van HUVEC cultuur live-cell microscopische imaging (A) Knip 2 stukken van dubbelzijdige tape in 0,65 cm x 2.50 cm rechthoekige strips en veilig een stuk dubbelzijdige tape horizontaal langs de bovenrand van de schuif, en het andere stuk, langs de onderrand van de schuif. Het is belangrijk dat een kleine ruimte tussen de band en de schuif rand zorgen voor het afdichten van de kamer zoals beschreven in (D). (B) Met behulp van een tang verwijder het dekglaasje met HUVECs en draai de dekglaasje (cel naar beneden) bovenop de stukken tape. (C) Een micropipet, voeg 40 pl beeldmedia (complete endotheliale basaal medium aangevuld met 25 uM HEPES) tussen het dekglaasje en het glaasje. Zorg ervoor dat de ruimte tussen het dekglaasje en schuif volledig is gevuld met imaging media en vermijd bubbels. Gebruik een aspirator langs de rand van het dekglaasje om overtollige media te verwijderen, indien nodig. (D) Met warm valap (1: 1: 1 vaseline: lanoline: paraffine) voor afdichting rondom de randen van het dekglaasje. Controleer op imaging media lekkages door te drukken rond voorzichtig op het dekglaasje. Gebruik extra valap te verhelpen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Geautomatiseerde bijhouden van fluorescent-gelabelde EB3 zorgt voor een uitgebreide analyse van de gehele cel en regionale dynamiek MT groei. De verzameling duidelijk onderscheiden en zeer tijd- en ruimte opgelost microscopische beelden van de EB3 eiwit essentieel is voor de analyse van EB3 stromingen binnen de cel. HUVEC expressie van fluorescent-gelabelde EB3 varieert sterk van cel naar cel en fluorescentie-intensiteit verhoogt meestal binnen dezelfde cel gedurende hr. Aldus is het belangrijk dat de deze veranderingen in expressieprofiel volgen om mogelijke effecten van verhoogde expressie EB op MT groeidynamiek identificeren. Dit wordt het beste bereikt door het evalueren van grijswaarden fluorescentie intensity profielen voor elke afgebeeld cel en gegevensanalyse beperkt tot die cellen die een bepaald bereik van grijswaarden expressieprofielen geven. Eerste evaluatie van expressieprofiel datasets is kritisch en moet worden vergeleken met MT groeidynamiek gegevens die verkregen door plusTipTracker software voor elke cel. Expressieprofielen kunnen worden uitgezet tegen MT groeisnelheid en MT groei levensduur van elke cel in een experimentele groep teneinde het gewenste bereik van grijswaarden expressie te bepalen en om mogelijke uitschieters te identificeren. Figuur 2 hoogtepunten een HUVEC gekweekt op een fibronectine substraat (zie Protocol 2.1, hierboven) en tot expressie brengen in de buurt van een optimaal niveau van Mapple-gelabelde EB3. Fluorescerende EB3 kometen wordt in een time-lapse reeks beelden gedurende 12 seconden (Figuur 2A). Analyse van EB3 kometen met behulp van plusTipTracker software gaat om een ​​geautomatiseerd, beeld-voor-beeld EB3 komeet detectie (groene en gele stippen, figuur 2B). Kometen ontdekt binnen elk frame worden vervolgens gekoppeld, afhankelijk van hun verandering in de positie van het frame-to-frame, te EB3 tracks en een visuele EB3 spoor overlay (figuur 2C-F) te genereren. Track overlays zijn kleurcodering en de kleur onderscheid kan worden bepaald door parameters die door de gebruiker zijn ingevoerd. Gewoonlijk deze onderscheidingen gebruik maken van de wereldwijde gemiddelde van MT groeisnelheid en MT groei levenslange 5,31 en daarmee splitsing van de gegevens in vier groepen: traag en kortstondige (rood), traag en een lange levensduur (geel), snel en op korte gewoond (groen), en snel en langlevend MT groei (blauw; figuur 2G). PlusTipTracker-gemedieerde volgen van EB3-gelabelde MT groeidynamiek maakt het ook mogelijk de gebruiker gedefinieerde regio&#39;s van belang (ROI). PlusTipTracker haalt de MT groeispoor data vanuit de gebruiker gedefinieerde ROI (Figuur 2A, B en F), waardoor vergelijkingen van MT groei dynamics binnen verschillende gebieden van dezelfde cel. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Figuur 2: EB3 komeet detectie, tracking en plusTipTracker data-uitgang (A) time-lapse film van een HUVEC uitdrukken mapple EB3.. Linker paneel toont een heel uitzicht cel en volledige cel masker (witte lijn) markeren van de cel grenzen. Rode doos staat voor het ingezoomde gebied in de time-lapse beelden (rechts panelen). Rechts panelen tonen ruwe grijstinten time-lapse beelden van EB3 kometen in opeenvolgende frames imaging (t = 0 sec - t = 12 sec). (B) plusTipTracker detectie van EB3 kometen van de in (A) beelden. Linker paneel toont een gehele cel weergave van gedetecteerde kometen (gele stippen). Rode doos staat voor het ingezoomde gebied in de time-lapse beelden (rechts panelen). Rechter panelen benadrukken vijf gedetecteerd EB3 kometen (rode pijlen) en sporenelementen die vijf kometen over de 12 sec imaging periode. Groen<html> stippen vertegenwoordigen gedetecteerd EB3 kometen die niet bestonden (of werden niet gedetecteerd) in de voorgaande tijdsinterval. (C) Maximale intensiteitsprojectie van 61 frames (2 min film) van de EB3 kometen getoond in (A). (D) plusTipTracker MT spoor overlay van dezelfde 61 frames (2 min film) getoond in (C). (E) Zoom van maximale intensiteit projectie (rode doos in C). (F) Zoom van plusTipTracker MT spoor overlay van maximale intensiteit projectie (rode doos in D). (G) Kleur-gecodeerde legenda voor spoor overlays getoond in (D) en (F). Aanwijzing zo langzaam, snelle kortstondige of lange duur is gebaseerd op de gemiddelde waarde voor alle sporen groei gemeten in een groep van tien MAPPLE-EB3 expressie HUVEC. Voor eenvoudiger visualisatie zijn spoor overlays in (D) en (F) gegenereerd met omgekeerde pixelintensiteiten de afbeeldingscel getoond in (A). Schaalbalken = 20 urn./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. HUVEC vertakking en migratiepatronen zijn gevoelig voor mechanisch-fysieke signalen van de ECM. HUVECs zijn bekend om te reageren op verschillende soorten signalering signalen en daarmee morfologische veranderingen die een geschikte cellulaire reactie op de specifieke signalering cue (s) 36,40-42 bepalen ondergaan. HUVECs gekweekt op fibronectine beklede glassubstraten (figuur 3A), of stijve 2-dimensionale polyacrylamidegel ECM&#39;s (55 kPa) typisch een ronde of langwerpige morfologie met weinig afzonderlijke vertakte uitsteeksels (figuur 3B) weergegeven. Echter, indien gekweekt op zacht 2-dimensionale polyacrylamidegel ECM (0,7 kPa), HUVEC&#39;s vertonen een sterk vertakte morfologie die bekend is gevolg van naleving geïnduceerde benedenregulering van myosine-II contractiliteit 4,5,31 (figuur 3C). Aldus HUVEC zelfregulering van celmorfologie met ECM mechanosensing, en dit wordt bereikt door gelokaliseerde modulatie van MT dynamiek en acto-myosine contractiliteit. Omdat HUVECs diverse morfologische kenmerken weergeven, om HUVEC meten vertakking is het essentieel om eerst definiëren wat een vertakte uitsteeksel, en vervolgens te bepalen hoe een vertakte uitsteeksel objectief gemeten. Een techniek maakt gebruik van vier stappen benadering waarbij een celgrens of &quot;masker&quot; gegenereerd handmatig opsporen van de randen van de cel met een beeld van een cel die een fluorescerende volumemarkering de celranden (Figuur 3D) omschrijven. Na masker generatie zijn tak oorsprong gedefinieerd lokaliseren grootste hoek van de kromming tussen het vertakte uitsteeksel en het cellichaam. Een lijn wordt getrokken naar Demark de &quot;branch origin&quot; (paarse schuine lijnen Figuur 3E). Branch nummer is gewoon gemeten door het tellen van het aantal vestigingen met een bepaalde tak oorsprong (figuur 3F). Scheutlengtes wordt gemeten als de afstand van de tak oorsprong naar het distale uiteinde tak (Figuur 3G). Om opname van kleine lamellipodia projecties van gegevensanalyse voorkomen, aanvullend criterium dient branches langer ( &quot;branch length&quot;) moet dan breed (de &#39;branch origin &quot;), en die zich vertakt moet ten minste tien micron lengte 5 , 31. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . Figuur 3: Analyse van HUVEC vertakking morfologie (A - C) DIC image voorbeelden van HUVEC&#39;s gekweekt op fibronectine gecoate glazen ECM (A) stijve (55 kPa) polyacrylamide ECM (B) en zachte (0,7kPa) polyacrylamide ECM (C). Vertakking is sterk toegenomen in HUVEC&#39;s gekweekt op 0,7 kPa polyacrylamide ECM (C) in vergelijking met stijvere ECM&#39;s (A, B). (D). DIC microscopische afbeelding (afbeelding links) van een getransfecteerde HUVEC uitdrukken van een mapple-C1 cDNA construct (een cel volume marker; rechter afbeelding). (E) Definieer de branche oorsprong door het lokaliseren van de grootste hoek van de kromming (dat wil zeggen de positie waar het membraan wordt de grootste kromming, paars-gekleurde lijnen) aan weerszijden van de branche en sluit vervolgens de hoeken met een rechte lijn (blauwe lijnen) . (F) te identificeren en te selecteren vertakte uitsteeksels die&gt; 10 urn uit te breiden van de &quot;branch origin&quot; (zoals gedefinieerd in E). Tel het aantal vertakte uitsteeksels aan het verkrijgen van &quot;branch-nummer.&quot; (G) Meet de afstand van het centrum van de &#39;branch oorsprong &quot;naar de most distale punt van de branche met behulp van de line tool in de annotaties en metingen toepassing van NIS Elements Software om het verkrijgen van &quot;branch lengte.&quot; Schaal bars = 20 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Naast sensing ECM compliance, HUVEC ook voelen en te reageren op de afschaffing van de aangrenzende cellulaire contacten geïnduceerd door scratch verwonden. In de migratieanalyse, HUVEC&#39;s gekweekt in een monolaag worden onderworpen aan een kras wond en migratie karakteristieken worden gemeten (zie protocol 9 hierboven). Na inductie van de wond door krabben de monolaag, wond-edge HUVEC polariseren Door een stuwende voorrand die zich uitstrekt in de wond (figuur 4A, t = 0 uur). Over een tijdsverloop van 10-12 uur, gepolariseerde wond-edge HUVEC migreren in de wond gebied en vul dewond, de oprichting van een nieuwe samenvloeiende monolaag (Figuur 4A, t = 11 uur). Net als bij HUVEC vertakking, de huidige gegevens blijkt dat polarisatie en migratie is kritisch afhankelijk van de gecoördineerde reorganisatie van het MT en actine cytoskeletons 43-49. Dit wordt bereikt, deels door gelokaliseerde remming van MCAK geïnduceerde MT demontage aan de voorrand, maar niet aan de achterrand van wond-edge HUVEC 31. De gevoeligheid van MT dynamiek-wond geïnduceerde polarisatie wordt geïnitieerd door de Rac1 GTPase, waarin tal van downstream-regulator eiwitten, waaronder Aurora-A kinase dat fosforyleert en remt MCAK aan de voorste rand, en andere kinasen die in staat zijn tot het remmen of activeren van kaarten zijn doelen lokaal moduleren MT groei en krimp 18,31,36,48,50-53. Uitgebreid experimenteel bewijs ondersteunt het idee dat de coördinatie van de leading edge uitsteeksel en achterrand krimp wordt bestuurd door cycli van Rac1 activeringMT montage op de leading edge en RhoA activering Acto-myosine contractiliteit te bevorderen op de achterrand, waardoor gericht beweeglijkheid 9,41,51,52,54-58 rijden. Tot op heden is er geen gevestigde methode voor het uitvoeren van geautomatiseerde volgen van celmigratie. Dit is een gevolg van de moeilijkheden bij het computationeel analyseren van cel-ECM grenzen die constant veranderen als wond-edge cellen polariseren en migreren. Hoewel veel software programma kan volgen fluorescent gelabelde cellen 59-64 zijn de populatie van fluorescent gelabelde HUVEC in opgewikkelde edge migratie experimenten ongeveer 30-40% van de totale bevolking HUVEC, en dus de meeste van de wond-randcellen must worden gevisualiseerd door fase-contrast beeldvorming of DIC. Daarnaast is het van belang bij het meten wond-edge migratie fluorescerende en niet-fluorescerende cellen evalueren binnen dezelfde wond om vast te stellen specifiekeeffecten van expressie constructen, zowel binnen de experimentele studiegroepen en tussen experimentele studie groepen. Momenteel is de beste aanpak om HUVEC migratie te meten is om een hand te volgen aanpak waarbij een wond-edge cel eerst wordt geïdentificeerd en vervolgens de kern en nucleolus geïdentificeerd (Figuur 4B) te gebruiken. De nucleolus wordt gebruikt als de positie bepalend voor cell tracking vanwege de hoge dichtheid en lichtverstrooiing relatief kleine omvang. Deze twee functies van de nucleolus gemakkelijker te identificeren en te verminderen meetfouten door beperking van het gebied waarin de gebruiker een afzonderlijk nummer posities plaatsen. HUVEC migratie tracks worden vervolgens gegenereerd door te klikken op de nucleolus in opeenvolgende time-lapse afbeelding frames. Tenslotte migratie snelheid en migratie afstand tot oorsprong worden gemeten en geanalyseerd voor de controle en experimentele celgroepen (figuur 4B). <img alt="figuur 4"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Figuur 4: Analyse van de wond-edge HUVECs en migratie volgen (A) 20X fase-contrast beelden van een 11 hr time-lapse imaging serie scratch wond-edge HUVEC (aka &quot;Migratie Assay&quot;).. De wond en trekrichting aangegeven in panel t = 0 uur. HUVECs worden getoond aan de wond rand en verder steken in de wond totdat een monolaag van cellen wordt gevormd (t = 3,5 uur - t = 11 uur). (B) Analyse van migratieanalyse time lapse imaging (zie A) moet eerst de identificatie van een traceerbare wond-edge HUVEC gebaseerd op cellocatie (dwz elementen fysiek aan de rand van de wond) en expressieprofiel (i .e. selecteer een groene wondrand cel als het experiment gaat om de expressie van GFP). afbeelding van de fase contrast met behulp van, identificeren van de kern en de nucleolus. Hand volgen de nucleolus in opeenvolgende time-lapse beelden met behulp van de eennotaties en metingen toepassing in NIS Elements software om migratie snelheid en de afstand tot de oorsprong te bepalen. Schaal bars = 100 micrometer (A), 20 pm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Protocollen voor de kweek van humane navelstrengveneuze endotheelcellen (HUVEC), tijdelijke transfectie van fluorescerend gelabelde markers van microtubulusgroei, beeldvorming van levende cellen en geautomatiseerde analyse van interfase-microtubulusgroeidynamiek worden gedetailleerd beschreven.

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van menselijke endotheliale cellen uit de navelstrengader en het analyseren van cytoskeletdynamiek en celmigratie met behulp van time-lapse imaging van levende cellen. De in deze video beschreven methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van cel-, moleculaire- en mechanobiologie. Dit protocol kan bijvoorbeeld worden gebruikt om vast te stellen hoe celvorm en motiliteit worden gemoduleerd door interactie met verschillende ECM's.Visuele demonstratie is essentieel omdat de stappen voor de monstervoorbereiding moeilijk uit te voeren zijn. Deze vereisen een nauwkeurige en tijdige behandeling van de cellen gedurende het gehele proces. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de beweeglijkheid van endotheelcellen tijdens angiogenese, kan zij ook worden toegepast op microscopische onderzoeken van vrijwel elk adherent celmodelsysteem.Pak met een pincet een dekglas uit een bewaarpot met 100% ethanol en haal dit door de vlam van een bunsenbrander om het te steriliseren. Plaats het vervolgens in een petrischaal van 35 millimeter. Bereid voor elk monster één dekglas voor.Voeg 10 µL van een 1 mg/mL fibronectine-stockoplossing en 990 µL PBS toe aan een 1,5 ml microcentrifugebuis. Pipetteer vervolgens 250 µL van de oplossing op elk dekglas. Verdeel de oplossing gelijkmatig over het oppervlak.Incubeer de dekglasjes gedurende minimaal drie uur bij 37 °C. Spoel elk dekglasje voor gebruik drie keer af met 2 mL PBS. Bepaal met een hemocytometer het aantal gekweekte HUVECs en breng een volume dat 100.000 cellen per dekglasje bevat voor niet-migratie-experimenten, of 500.000 cellen per dekglasje voor migratie-experimenten, over naar een microcentrifugebuis.Centrifugeer de cellen 4 minuten lang bij 1.400 ×g om ze te pelletteren. Resuspendeer na het centrifugeren voor elke te testen conditie maximaal één miljoen cellen in 100 µL elektroporatiebuffer en combineer deze met 1 µg cDNA. Breng de cellen over naar een elektroporatiecuvet.Transfecteer de cellen en het DNA-mengsel met behulp van het programma dat is vastgesteld voor HUVEC-elektroporatie. Red vervolgens de getransfecteerde cellen door 500 µL compleet endotheliaal basaal medium toe te voegen. Zaai daarna het juiste celvolume uit op met fibronectine gecoate dekglasjes.Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende drie tot vier uur om tijd te geven voor de expressie van de cDNA-constructen. Ter voorbereiding op de beeldvorming neemt u twee stroken dubbelzijdige tape van 2,5 cm bij 0,65 cm en bevestigt u deze horizontaal langs de boven- en onderrand van een schoon glazen objectglas. Let op dat het belangrijk is om een kleine ruimte tussen de tape en de rand van het objectglas over te laten voor het afsluiten van de kamer.Plaats het dekglas met de celzijde naar beneden, zodanig dat de twee randen van het dekglas op de tape rusten. Gebruik een pincet om het dekglas voorzichtig aan te drukken en te fixeren. Voeg met een micropipet 40 µL imaging medium toe tussen het dekglas en het objectglas.Zorg ervoor dat de ruimte tussen het dekglas en het objectglas volledig is gevuld met het beeldmedium. Dep eventueel overtollig medium weg met een papieren doekje. Afdicht alle randen van het objectglas met warm VALAP.Controleer op lekkages door voorzichtig op het glazen dekglas te drukken. Plaats het gemonteerde en afgedichte dekglas op een microscooptafel die is voorverwarmd tot 37 °C. Leg met behulp van een spinning disk confocale microscoop time-lapse beeldsequenties, beelden van blauw fluorescent eiwit en DIC-beelden vast.Analyseer de microtubulusdynamiek en co-lokalisatie zoals beschreven in het bijbehorende document. Om een celmigratie-assay uit te voeren, moeten de getransfecteerde cellen na de elektroporatiestap worden gered door 80 µL volledig endotheliaal basaal medium toe te voegen. Pipetteer vervolgens het volledige monster van 80 µL als één enkele druppel op het midden van een gedroogd, met fibronectine gecoat dekglas.Verspreid de druppel niet. Het drogen van het dekglas is noodzakelijk om te voorkomen dat de druppel van 80 µL uiteenvalt bij contact met het dekglas. Deze methode maakt het mogelijk om HUVEC's te concentreren binnen een klein gebied van het dekglas, waardoor de snelle vorming van een confluente monolaag cellen wordt bevorderd.Incubeer het dekglas bij 37 °C gedurende drie tot vier uur om de cellen de tijd te geven zich te hechten tot een confluente monolaag. Spoel de glaasjes vervolgens twee keer met volledig endotheliaal basaal medium om alle niet-gehechte cellen te verwijderen. Om een wondrand in de HUVEC-monolaag te creëren, gebruikt u een pincet om het dekglas voorzichtig op zijn plaats te houden en trekt u met een scheermesje stevig over het centrum van de cellaag.Laat de cellen drie uur herstellen in een incubator van 37 °C. Assembleer en monteer vervolgens de dekglasjes voor beeldvorming zoals voorheen. Neem fasecontrastbeelden op met intervallen van 10 minuten gedurende 12 uur met behulp van een 10X 0,45 numerieke apertuur fase-objectief en een 0,52 numerieke apertuur condensator met een lange werkafstand.Gebruik het ND Acquisition-paneel van het softwareprogramma voor beeldacquisitie. Kwantificeer tot slot de vertakking en migratie van HUVEC's zoals beschreven in het bijbehorende document. HUVEC's werden getransfecteerd om mApple-gelabeld-EB3, een microtubuli end-binding protein, tot expressie te brengen en er werden time-lapsebeelden opgenomen.Ruwe beelden van EB3 worden links getoond. Blauwe EB3-kometen die zijn gevolgd met plusTipTracker-software worden rechts getoond. Kometen die binnen elk frame zijn gedetecteerd, werden gekoppeld op basis van hun positieverandering van frame naar frame om EB3-tracks en een visuele EB3-track-overlay te genereren, zoals hier wordt weergegeven.Langzame, kortstondige microtubuligroei is in het rood weergegeven, langzame, langdurige microtubuligroei is in het groen weergegeven, snelle, kortstondige microtubuligroei is in het geel weergegeven en snelle, langdurige microtubuligroei is in het blauw weergegeven. Om de vertakking van endotheelcellen te analyseren, werden een DIC-beeld en een fluorescentiebeeld van een individuele HUVEC vastgelegd bij een 60-voudige vergroting. Rond de celrand in het fluorescentiebeeld is handmatig een begrenzing getekend.De oorsprong van de vertakkingen werd vervolgens bepaald door een rechte lijn over de vertakking te trekken, door de grootste krommingshoek aan weerszijden van de vertakking. Vertakkingen die langer waren dan breed en een minimale lengte van 10 microns hadden, werden geteld, waarbij de lengte werd gemeten vanaf de oorsprong van de vertakking tot de distale tip van de vertakking. Om de migratie van endotheelcellen vanaf de wondrand te beoordelen, werden HUVECs bij een hoge dichtheid gekweekt en werd er live-cell time-lapse imaging uitgevoerd na het toebrengen van de wond, zoals beschreven in deze video.Zoals hier wordt getoond, migreerden endotheelcellen aan de wondrand directioneel naar het wondgebied. Deze beweging werd geanalyseerd met het nucleolus als fiduciaire marker om de migratiesnelheid, persistentie en afstand te volgen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u HUVEC's moet kweken, transfecteren en voorbereiden voor imaging-experimenten naar celvorm en cytoskeletdynamiek of voor studies naar celmigratie aan de wondrand.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals polyacrylamide- of collageenconjugatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking aan de celinteractie met gemodificeerde ECM's. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video protocol illustreert de isolatie en de cultuur van humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) van menselijke navelstreng. Eenmaal geïsoleerd deze cellen kunnen worden gebruikt voor in-vitro angiogenese assays, zoals de Optimized fibrinegel Bead Assay ook aangetoond door de Hughes lab.

Isolatie van de Mens navelstreng endotheel cellen (HUVEC)

In dit artikel wordt eerst een procedure voor het isoleren van humane endotheelcellen van de navelstreng aderen en dan laat zien hoe deze cellen te gebruiken om neutrofielen transmigratie onderzoeken op stromingscondities. Door een laag volume stromingskamer gemaakt van een polymeer met de optische eigenschappen van glas levende cellen fluorescerende beeldvorming zeldzame celpopulaties is ook mogelijk.

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Hier een nieuwe regio van belang analyse protocol gebaseerd op het sorteren van best-fit ellipsen toegewezen aan regio's positief signaal binnen twee-dimensionale time beeld lapse sequenties wordt aangetoond. Dit algoritme kan onderzoekers in staat te stellen volledig kunnen onderzoeken fysiologische Ca 2 +-signalen met een minimale input van de gebruiker en vooringenomenheid.

Geautomatiseerde analyse van Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalen in reeksen afbeeldingen

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

Om de microvasculaire stroom te kwantificeren uit hoge snelheid capillaire flow beeld sequenties, ontwikkelden we medewerkers (ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow) software. In het volledige afbeeldingsveld en na verloop van tijd evalueert het personeel stroomsnelheden en genereert het een reeks ruimtelijke kaarten met kleurcodering voor visualisatie en tabellaire uitvoer voor kwantitatieve analyses.

Ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow in Microvasculatuur

Dit protocol is gewijd aan de microtubule plus-end visualisatie door EB3-eiwittransfectie om hun dynamische eigenschappen in primaire celkweek te bestuderen. Het protocol werd geïmplementeerd op menselijke primaire huidfibroblasten verkregen van patiënten met de Ziekte van Huntington.

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model gebaseerd op humane primaire huidfibroblasten

De huidige studie beschrijft een protocol om de veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's) tijdens virale infectie te volgen met behulp van een real-time celanalysesysteem (RTCA).

Monitoring van veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader bij virale infectie met behulp van op impedantie gebaseerde real-time celanalyse

Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

Leer hoe je microtubuli-dynamiek analyseert in levende humane navelstreng endotheelcellen met behulp van time-lapse beeldvorming. Deze methode onthult cytoskeletgedrag en celmigratie voor angiogenese-onderzoek.

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen (Video) | JoVE Journal

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

Meer video's verkennen