Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van menselijke endotheliale cellen uit de navelstrengader en het analyseren van cytoskeletdynamiek en celmigratie met behulp van time-lapse imaging van levende cellen. De in deze video beschreven methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van cel-, moleculaire- en mechanobiologie. Dit protocol kan bijvoorbeeld worden gebruikt om vast te stellen hoe celvorm en motiliteit worden gemoduleerd door interactie met verschillende ECM's.

Visuele demonstratie is essentieel omdat de stappen voor de monstervoorbereiding moeilijk uit te voeren zijn. Deze vereisen een nauwkeurige en tijdige behandeling van de cellen gedurende het gehele proces. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de beweeglijkheid van endotheelcellen tijdens angiogenese, kan zij ook worden toegepast op microscopische onderzoeken van vrijwel elk adherent celmodelsysteem.

Pak met een pincet een dekglas uit een bewaarpot met 100% ethanol en haal dit door de vlam van een bunsenbrander om het te steriliseren. Plaats het vervolgens in een petrischaal van 35 millimeter. Bereid voor elk monster één dekglas voor.

Voeg 10 µL van een 1 mg/mL fibronectine-stockoplossing en 990 µL PBS toe aan een 1,5 ml microcentrifugebuis. Pipetteer vervolgens 250 µL van de oplossing op elk dekglas. Verdeel de oplossing gelijkmatig over het oppervlak.

Incubeer de dekglasjes gedurende minimaal drie uur bij 37 °C. Spoel elk dekglasje voor gebruik drie keer af met 2 mL PBS. Bepaal met een hemocytometer het aantal gekweekte HUVECs en breng een volume dat 100.000 cellen per dekglasje bevat voor niet-migratie-experimenten, of 500.000 cellen per dekglasje voor migratie-experimenten, over naar een microcentrifugebuis.

Centrifugeer de cellen 4 minuten lang bij 1.400 ×g om ze te pelletteren. Resuspendeer na het centrifugeren voor elke te testen conditie maximaal één miljoen cellen in 100 µL elektroporatiebuffer en combineer deze met 1 µg cDNA. Breng de cellen over naar een elektroporatiecuvet.

Transfecteer de cellen en het DNA-mengsel met behulp van het programma dat is vastgesteld voor HUVEC-elektroporatie. Red vervolgens de getransfecteerde cellen door 500 µL compleet endotheliaal basaal medium toe te voegen. Zaai daarna het juiste celvolume uit op met fibronectine gecoate dekglasjes.

Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende drie tot vier uur om tijd te geven voor de expressie van de cDNA-constructen. Ter voorbereiding op de beeldvorming neemt u twee stroken dubbelzijdige tape van 2,5 cm bij 0,65 cm en bevestigt u deze horizontaal langs de boven- en onderrand van een schoon glazen objectglas. Let op dat het belangrijk is om een kleine ruimte tussen de tape en de rand van het objectglas over te laten voor het afsluiten van de kamer.

Plaats het dekglas met de celzijde naar beneden, zodanig dat de twee randen van het dekglas op de tape rusten. Gebruik een pincet om het dekglas voorzichtig aan te drukken en te fixeren. Voeg met een micropipet 40 µL imaging medium toe tussen het dekglas en het objectglas.

Zorg ervoor dat de ruimte tussen het dekglas en het objectglas volledig is gevuld met het beeldmedium. Dep eventueel overtollig medium weg met een papieren doekje. Afdicht alle randen van het objectglas met warm VALAP.

Controleer op lekkages door voorzichtig op het glazen dekglas te drukken. Plaats het gemonteerde en afgedichte dekglas op een microscooptafel die is voorverwarmd tot 37 °C. Leg met behulp van een spinning disk confocale microscoop time-lapse beeldsequenties, beelden van blauw fluorescent eiwit en DIC-beelden vast.

Analyseer de microtubulusdynamiek en co-lokalisatie zoals beschreven in het bijbehorende document. Om een celmigratie-assay uit te voeren, moeten de getransfecteerde cellen na de elektroporatiestap worden gered door 80 µL volledig endotheliaal basaal medium toe te voegen. Pipetteer vervolgens het volledige monster van 80 µL als één enkele druppel op het midden van een gedroogd, met fibronectine gecoat dekglas.

Verspreid de druppel niet. Het drogen van het dekglas is noodzakelijk om te voorkomen dat de druppel van 80 µL uiteenvalt bij contact met het dekglas. Deze methode maakt het mogelijk om HUVEC's te concentreren binnen een klein gebied van het dekglas, waardoor de snelle vorming van een confluente monolaag cellen wordt bevorderd.

Incubeer het dekglas bij 37 °C gedurende drie tot vier uur om de cellen de tijd te geven zich te hechten tot een confluente monolaag. Spoel de glaasjes vervolgens twee keer met volledig endotheliaal basaal medium om alle niet-gehechte cellen te verwijderen. Om een wondrand in de HUVEC-monolaag te creëren, gebruikt u een pincet om het dekglas voorzichtig op zijn plaats te houden en trekt u met een scheermesje stevig over het centrum van de cellaag.

Laat de cellen drie uur herstellen in een incubator van 37 °C. Assembleer en monteer vervolgens de dekglasjes voor beeldvorming zoals voorheen. Neem fasecontrastbeelden op met intervallen van 10 minuten gedurende 12 uur met behulp van een 10X 0,45 numerieke apertuur fase-objectief en een 0,52 numerieke apertuur condensator met een lange werkafstand.

Gebruik het ND Acquisition-paneel van het softwareprogramma voor beeldacquisitie. Kwantificeer tot slot de vertakking en migratie van HUVEC's zoals beschreven in het bijbehorende document. HUVEC's werden getransfecteerd om mApple-gelabeld-EB3, een microtubuli end-binding protein, tot expressie te brengen en er werden time-lapsebeelden opgenomen.

Ruwe beelden van EB3 worden links getoond. Blauwe EB3-kometen die zijn gevolgd met plusTipTracker-software worden rechts getoond. Kometen die binnen elk frame zijn gedetecteerd, werden gekoppeld op basis van hun positieverandering van frame naar frame om EB3-tracks en een visuele EB3-track-overlay te genereren, zoals hier wordt weergegeven.

Langzame, kortstondige microtubuligroei is in het rood weergegeven, langzame, langdurige microtubuligroei is in het groen weergegeven, snelle, kortstondige microtubuligroei is in het geel weergegeven en snelle, langdurige microtubuligroei is in het blauw weergegeven. Om de vertakking van endotheelcellen te analyseren, werden een DIC-beeld en een fluorescentiebeeld van een individuele HUVEC vastgelegd bij een 60-voudige vergroting. Rond de celrand in het fluorescentiebeeld is handmatig een begrenzing getekend.

De oorsprong van de vertakkingen werd vervolgens bepaald door een rechte lijn over de vertakking te trekken, door de grootste krommingshoek aan weerszijden van de vertakking. Vertakkingen die langer waren dan breed en een minimale lengte van 10 microns hadden, werden geteld, waarbij de lengte werd gemeten vanaf de oorsprong van de vertakking tot de distale tip van de vertakking. Om de migratie van endotheelcellen vanaf de wondrand te beoordelen, werden HUVECs bij een hoge dichtheid gekweekt en werd er live-cell time-lapse imaging uitgevoerd na het toebrengen van de wond, zoals beschreven in deze video.

Zoals hier wordt getoond, migreerden endotheelcellen aan de wondrand directioneel naar het wondgebied. Deze beweging werd geanalyseerd met het nucleolus als fiduciaire marker om de migratiesnelheid, persistentie en afstand te volgen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u HUVEC's moet kweken, transfecteren en voorbereiden voor imaging-experimenten naar celvorm en cytoskeletdynamiek of voor studies naar celmigratie aan de wondrand.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals polyacrylamide- of collageenconjugatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking aan de celinteractie met gemodificeerde ECM's. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.