Name: Een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het Muizen C1498 Cell Line en de bijbehorende Leukemie muismodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer het karakteriseren van C1498-cellen en de acute leukemie die ze veroorzaken bij muizen. Deze methode gebruikt flowcytometrie en cytochemie om ziekte mechanismen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen de "Ligue Nationale contre le Cancer" (Comité du Septentrion), de SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) en het Institut voor de Onderzoek naar Kanker in Lille (IRCL) bedanken voor hun steun aan dit werk. Ze willen Delphine Taillieu en het personeel van de dierenfaciliteit bedanken voor het huisvesten van de muizen en het handhaven van hun welzijn. We danken ook Raphaëlle Caillerez en Nathalie Jouy voor hun respectieve hulp bij microscopie en flowcytometrie.

<ol><li>Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, Ø, Selheim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+subclassification+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).</li>
<li>Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+of+free+C1498+%28granulocytic+leukemia%29+tumor+cells+in+the+peritoneal+fluid+and+the+blood+of+C57+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice.</a> Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).</li>
<li>Tanaka, K. K., Roberts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+studies+of+E.L.4+lymphoma+and+C+Leukemia+in+susceptible+%28C57BL%29+and+resistant+%28B10.D2%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice.</a> Cancer Res. 24 (1498), 1785-1797 (1964).</li>
<li>Law, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+influence+affecting+growth+of+transplantable+leukemias+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of an influence affecting growth of transplantable leukemias in mice.</a> Cancer Res. 4, 257-260 (1944).</li>
<li>Graham, J. D., McMahon Welch, C., Patchen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+an+implanted+murine+myelogenous+leukemia+C1498%5BTitle%5D)+AND+%22Ohio+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies of an implanted murine myelogenous leukemia C1498.</a> Ohio J. Sci. 75 (4), 202-208 (1975).</li>
<li>Boyer, M. W., Orchard, P. J., Gorden, K. B., Anderson, P. M., Mclvor, R. S., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+intercellular+adhesion+molecule+recognition+and+local+interleukin-2+provision+in+generation+of+an+in+vivo+CD8%2B+T-cell+immune+response+to+murine+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dependency on intercellular adhesion molecule recognition and local interleukin-2 provision in generation of an in vivo CD8+ T-cell immune response to murine myeloid leukemia.</a> Blood. 85 (9), 2498-2506 (1995).</li>
<li>Labelle, J. L., Truitt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+NKT+cell+tumor+previously+described+as+an+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine NKT cell tumor previously described as an acute myelogenous leukemia.</a> Leuk. Lymphoma. 43 (8), 1637-1644 (2002).</li>
<li>Bradner, W. T., Pindell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukemia+as+a+screen+for+cancer+chemotherapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukemia as a screen for cancer chemotherapeutic agents.</a> Cancer Res. 26 (4), Pt 2 375-390 (1966).</li>
<li>Lin, J. M., Li, B., Rimmer, E., VanRoey, M., Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+anti-tumor+efficacy+of+a+GM-CSF-secreting+tumor+cell+immunotherapy+in+preclinical+models+by+cytosine+arabinoside%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the anti-tumor efficacy of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in preclinical models by cytosine arabinoside.</a> Exp. Hematol. 36 (3), 319-329 (2008).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobinson%2C+JP+%22Handbook+of+Flow+Cytometry+Methods%22">Handbook of Flow Cytometry Methods</a>. , Wiley-Liss, Inc. New York, NY. (1993).</li>
<li>Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+identification+of+acute+myeloid+leukemia+with+monocytic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation.</a> Leukemia. 20 (7), 1321-1324 (2006).</li>
<li>Hassan, K., Qureshi, M., Shafi, S., Ikram, N., Akhtar, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia-FAB+classification+and+its+correlation+with+clinico-haematological+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pak.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia-FAB classification and its correlation with clinico-haematological features.</a> J. Pak. Med. Assoc. 43 (10), 200-203 (1993).</li>
<li>Quesenberry, P. J., Rappeport, J. M., Fountebouni, A., Sullivan, R., Zuckerman, K., Ryan, M. Inhibition of normal murine hematopoiesis by leukemic cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuesenberry%2C+PJ+%22N.Engl.J.+Med%22">N.Engl.J. Med</a>. 299 (2), 71-75 (1978).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181 (8), 5791-5802 (2008).</li>
<li>Loder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+development+in+the+spleen+takes+place+in+discrete+steps+and+is+determined+by+the+quality+of+B+cell+receptor-derived+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals.</a> J. Exp. Med. 190 (1), 75-89 (1999).</li>
<li>Robbins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extramedullary+hematopoiesis+generates+Ly-6C%28high%29+monocytes+that+infiltrate+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions.</a> Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

In eerdere studies werd de C1498-cellijn beschreven als een inductor van acute granulocytaire 5, myelomonocytaire 6 of 7 NKT cel leukemie. Echter, demonstratieve literatuurgegevens waren ofwel afwezig of onvolledig. De hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van verschillende technieken, zoals doorstroomcytometrie, immunofluorescentie, MGG kleuring en cytochemische analyses, C1498 gekweekte cellen te karakteriseren en de aard van de leukemie die wordt geïnduceerd in muizen na geïnjecteerd bepalen. Wanneer we in vitro gekweekte cellen C1498 fenotype na immunokleuring en flowcytometrie werden uitgevoerd, namen wij een aantal beperkingen, omdat deze cellen tot expressie paar celoppervlak hematopoïetische merkers die eerder in de literatuur beschreven 6,7. In overeenstemming met onze resultaten, leverde Labelle et al. Niet het celoppervlak expressie van volwassen TCR observeren op C1498-cellen met behulp van stroom cytometry kleuring. Echter, als ze naar een NKT-cellijn nadat ze CD3e en TCRVβ8.2 mRNA 7 gedetecteerd. We observeerden ook intracellulaire expressie van TCRVβ CD3e ketens en moleculen in de meeste cellen (&gt; 70%), maar hun hematopoietische lineages kon niet worden bepaald omdat er ook gelijktijdig intracellulaire expressie van Mac-3-molecuul. Myeloperoxidase, MGG kleuring en evaluaties om functionele esterasen behulp cytochemie analyseren aangetoond dat de C1498 cellijn had een myeloïde oorsprong en was samengesteld uit monoblast en myeloblasten. Deze resultaten waren overeenstemmend met het percentage Mac-3 + cellen die in flow cytometrie werden verkregen kleuring analyse. Hoewel niet kwantitatief, stappen behelzen belangrijke experimenten uit te voeren. Zij blijven, tot nu toe, de beste bestaande werkwijzen voor het karakteriseren van de lijn en differentiatie stadium van hematopoietische cellen die geen of f uitdrukkenew specifieke fenotypische markers. Flowcytometrie kleuring was nuttig voor het aantonen van de ontwikkeling van acute leukemie in muizen na congenic C1498 cellen intraveneus werden geïnjecteerd. De CD45.2 + C1498 cellen die geïnfiltreerd in het perifere bloed en verschillende organen werden geïsoleerd, en hun frequenties werden bepaald. Kwantificering werd ook uitgevoerd aan inherente medullaire en milt cellen te analyseren na immunofenotypering. Beperkingen werden ondervonden bij de C1498 cel fenotype in organen werd onderzocht omdat zij geuit enkele hematopoietische markers (slechts een paar van hen waren B220 +). De aard van de waargenomen acute leukemie, May-Grünwald Giemsa kleuring en analyse van de activiteiten van monocytische definiëren en granulocyten esterasen werden uitgevoerd met beenmerg. De resultaten toonden aan dat C1498 cellen behouden hun myeloblastische en monoblastic morfologie en functie, waaruit het ontstaan ​​van myelomonocytische leukemie. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Als tegenprestatie voor de kritische stappen in dit protocol beschreven, moet bijzondere aandacht worden besteed aan de pH bij het uitvoeren van cytochemische reacties en MGG kleuring, omdat fouten in pH kan leiden tot een onjuiste interpretatie van de resultaten. Bijvoorbeeld α-naftyl butyraat esterase activiteit specifiek voor monocytcellen Pas bij een pH van 6,0 omdat granulocyten en lymfocyten ook positief voor deze test bij hogere pH waarden kunnen bevlekken. Fixeren van de cellen wordt niet aanbevolen voor het uitvoeren van MGG kleuring, en we toonden aan dat alleen CAF fixatie bevredigende resultaten bij het uitvoeren van esterases cytochemische reacties met behulp van C1498-cellen. Om de expressie van CD115 molecuul en de detectie door flowcytometrie, alle monsters (bijvoorbeeld bloed, beenmerg en milt cellen) worden op ijs gehouden tijdens de procedure behouden. Indien geen kleuring wordt waargenomen in stromingscytometrie of / en immunofluorescentie experimenten, de referentie van de antilichamen, de bewaring recommendations en hun verdunningen moeten worden gecontroleerd. De in de tabel materialen / apparatuur referenties zijn geselecteerd vanwege flowcytometrie of immunofluorescentie toepassingen. De primaire / secundaire antilichamen of hun geconjugeerde fluoroforen kunnen hun activiteiten hebben verloren door verkeerde opslag (bijvoorbeeld blootstelling aan licht of warmte), onjuiste verdunning uitgebreide bevriezen / ontdooien of het gebruik van verontreinigde buffers. Ren positieve controles om ervoor te zorgen dat ze goed werken. Gebruik muis beenmerg en milt afgeleide cellen waarvan bekend is dat het eiwitten van belang tot expressie. Om een ​​hoge achtergrond en niet-specifieke kleuring te vermijden, zorg ervoor dat de cellen goed worden gewassen en bewaard bij een hoge luchtvochtigheid (voor immunofluorescentie) en dat de antilichamen worden verdund volgens de instructies. Met dezelfde concentratie en verdunning van het isotype controle-antilichaam en het primaire antilichaam om nauwkeurig de achtergrondniveau in het monster. Voor esterase cytochemie experimenten, dereagentia kunnen worden getest met behulp van positieve en negatieve controleglaasjes die gezuiverde muis milt granulocytaire (Ly6G +) en monocytische (CD115 +) cellen. De in deze studie beschreven procedure toonde aan dat veel van de functies leukemische waargenomen bij muizen na de injectie van C1498-cellen gedeelde gemeenschappelijke kenmerken met humane acute myeloïde leukemie 11,12. Het binnengedrongen leukemische cellen resulteerde in een vermindering van rijpe en onrijpe (voorlopers en voorlopers) medullaire hematopoietische cellen. C1498-cellen aanwezig bij hoge frequentie (&gt; 20%) in het perifere bloed, evenals monocytische cellen. Hepatomegalie en splenomegalie waargenomen het gevolg van de infiltratie van leukemische cellen en significante toename in B lymfocyten en myeloïde cellen werden ook waargenomen splenomegalie begeleiden. Trombopenie werd ook waargenomen wanneer bloedplaatjes aantallen werden geschat met behulp van een hematologie-analyse. Het was te zienn, middels in vitro experimenten, dat C1498 cellen remmen normale muizen hematopoiese secreteren oplosbare factoren 13. In verscheidene tumor muismodellen zijn onrijpe myeloïde cellen (met inbegrip van monocytische cellen en granulocyten) ook aangetoond dat migreren van het beenmerg naar de milt waar ze remmen anti-tumorspecifieke T-celactivering en proliferatie 14. Aldus kan de verlaging van hematopoietische cellen dat werd waargenomen in het beenmerg resulteerde uit ofwel een tekort aan hematopoiese en / of hun emigratie. Dit laatste mechanisme zou de aanwezigheid van monocytose in het perifere bloed of waarneming vergrote myeloïde fracties in de milt verklaren. Het is ook denkbaar dat deze cellen kon worden ontleend verbeterde milt hematopoiese. Inderdaad, onder steady-state condities, sommige subsets van milt B-cellen werden geïdentificeerd als voorlopers van rijpe B-lymfocyten 15. Bovendien, onder inflammatoire aandoeningen, medullary stamcellen en voorlopers cellen is aangetoond dat verhuizen naar de milt om de productie van rijpe monocyten 16 induceren. Dit protocol maakt het niet mogelijk om conclusies over de mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van leukemie en andere functionele en moleculaire assays worden toegepast om dit te doen trekken. Echter, deze gegevens bevatten gedetailleerde informatie over de klinische kenmerken van acute myeloïde leukemie en zullen de onderzoekers te evalueren en de effecten van nieuwe therapeutische middelen te begrijpen helpen.

Acute myeloïde leukemie (AML) wordt gekenmerkt door een ongecontroleerde proliferatie van hematopoietische myeloïde cellen die zijn geblokkeerd in verschillende stadia van rijping. Deze ontregeling kan invloed hebben op de granulocyten, monocyten, erythrocytaire of megaryocytic differentiatieomzettingswegen 1. AML cellen accumuleren in het beenmerg, wat leidt tot verminderde hematopoiese, waardoor trombopenie, lymfopenie en anemie. De leukemische cellen ook binnenvallen het bloed en niet-lymfoïde organen. De C1498 muismodel wordt al tientallen jaren als een model voor acute leukemie omdat kankercellen van een leukemische 10 maanden oude C57BL / 6 (H-2 b) vrouwtjes werden geïsoleerd in 1941. De literatuur beschrijft de invasie in het bloed , hematopoëtische organen (bijvoorbeeld de milt en lymfeknopen) en niet-hematopoëtische organen (bijvoorbeeld de lever, longen, ovaria en nieren) door zeer proliferatieve C1498 cellen nadat ze werden geïnjecteerd via een ininjecterende, subcutaan of intra-peritoneale route in gevoelige muizen 2-4. Echter was dit muismodel gerapporteerd ofwel granulocytaire 2,5 of 6 myeloïde leukemie veroorzaken. Meer recent een studie gepubliceerd in 2002 beschreef deze vorm van kanker als muizen NKT cel leukemie 7. Aldus verschilt de literatuur betreffende de aard van deze cellijn C1498 en bijbehorende leukemie induceert bij muizen. Deze verschillen zijn voornamelijk te wijten aan een gebrek aan gedetailleerde en actuele gepubliceerde informatie over de cellen en de leukemische ziekten in het algemeen, omdat veel studies werden uitgevoerd in de 1950-1970&#39;s. Hier hebben we een gedetailleerd protocol te beschrijven hoe C1498 cellen te karakteriseren en de aard van de leukemische ziekte die wordt geïnduceerd door de intraveneuze injectie in muizen geanalyseerd. Het eerste deel van dit protocol is gewijd aan een beschrijving van C1498-cellen die zijn gekweekt in vitro. fluorescerende antilichamen tegen oppervlak en intracellulaire hematopoïetische merkers werden gebruikt om het fenotype te bepalen middels flowcytometrie. De aanwezigheid van myeloperoxidase werd beoordeeld met behulp van immunofluorescentie microscopie, werden de hematopoietische afkomst en differentiatiestadium geëvalueerd met cytochemie de activiteit van esterasen beoordelen en May-Grünwald Giemsa kleuring werd uitgevoerd. De C1498 cellen werden vervolgens geïnjecteerd in muizen, en de acute leukemie ziekte die geïnduceerd wordt beschreven in het tweede deel van dit manuscript. Dezelfde technieken werden gebruikt om de frequenties en de fenotypen van leukemische cellen en inherent in het beenmerg, perifeer bloed, milt en non-hematopoïetische organen (lever en longen) te bepalen. Dit protocol is zeer reproduceerbaar en de hier gepresenteerde gegevens helpt onderzoekers om de effecten van nieuwe therapeutische strategieën te beoordelen. Dit leukemie muismodel is al gebruikt om te testen immunotherapie benaderingen eennd verschillende kanker chemotherapeutische geneesmiddelen 8,9. Hun effectiviteit werd geëvalueerd door bepaling van de ontwikkeling van tumorlast overlevingskansen. Dit protocol kan worden gebruikt om extra informatie over de verdeling en verblijfkosten van leukemie en andere hematopoietische celpopulaties tijdens de behandeling te bieden.

```html
<table><tbody><tr><td>C1498 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB 49</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Ly5.1</td><td>Charles River</td><td>B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl</td><td></td></tr><tr><td>Cells culture reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Gibco (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco&nbsp;&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, Gibco&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry staining reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse B220 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0452</td><td>clone RA3-6B2, final dilution 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse B220 biotin (2)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0452</td><td>clone RA3-6B2, 1/400</td></tr><tr><td>anti-mouse CD3 eFluor450 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0032</td><td>clone 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD3 PE (2)</td><td>BD biosciences</td><td>555275</td><td>clone 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3)</td><td>ebiosciences</td><td>15-0031</td><td>clone 145-2C11, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD4 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0041</td><td>clone GK1.5, 1/500</td></tr><tr><td>anti-mouse CD4 PE (2)</td><td>ebiosciences</td><td>12-0041</td><td>clone GK1.5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse CD8 biotin (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0081</td><td>clone 53-6.7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD8 eFluor450 (2)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0081</td><td>clone 53-6.7, 1/500</td></tr><tr><td>anti-mouse CD11a biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-0111</td><td>clone M17/4, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD11b PE&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>12-0112</td><td>clone M1/70, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse CD16/32 biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-0161</td><td>clone 93, 1/400</td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking)&nbsp;</td><td>BD biosciences</td><td>553141</td><td>clone 2.4G2</td></tr><tr><td>anti-mouse CD18 biotin (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0181</td><td>clone M18/2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD18 FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-0181</td><td>clone M18/2, 1/50</td></tr><tr><td>anti-mouse CD19 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0193</td><td>clone 1D3, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse CD21/35 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0211</td><td>clone 8D9, 1/50</td></tr><tr><td>anti-mouse CD31 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0311</td><td>clone 390, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD34 eFluor660</td><td>ebiosciences</td><td>50-0341</td><td>clone RAM34, 1/20</td></tr><tr><td>anti-mouse CD44 PE</td><td>BD biosciences</td><td>553134</td><td>clone IM7, 1/50</td></tr><tr><td>anti-mouse CD45.2 FITC&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>11-0454</td><td>clone 104, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD49b/Pan NK PE</td><td>&nbsp;BD biosciences</td><td>553858</td><td>clone DX5, 1/50</td></tr><tr><td>anti-mouse CD80 biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-0801</td><td>clone 16-10A1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse CD86 biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-0862</td><td>clone GL1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse CD107b (Mac-3) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5989</td><td>clone M3/84, 1/40</td></tr><tr><td>anti-mouse CD115 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1152</td><td>clone AFS98, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD117 eFluor450</td><td>ebiosciences</td><td>48-1171</td><td>clone 2B8, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD127 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1271</td><td>clone A7R34, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD150 APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-1501</td><td>clone 9D1, 1/20</td></tr><tr><td>anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-5982</td><td>clone MIH5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5981</td><td>clone D7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse Ly-6C APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-5932</td><td>clone HK1.4, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse Ly-6G&nbsp; (Gr-1) biotin (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-5931</td><td>clone RB6-8C5, 1/400</td></tr><tr><td>anti-mouse Ly-6G FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-9668</td><td>clone 1A8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-5999</td><td>clone 28-14-8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-5321</td><td>clone M5/114.15.2, 1/1000</td></tr><tr><td>anti-mouse NK1.1 PE</td><td>BD biosciences</td><td>557391</td><td>clone PK136, 1/50</td></tr><tr><td>anti-mouse TCRVb FITC</td><td>BD biosciences</td><td>553170</td><td>clone H5

een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het muizen c1498 cell line en de bijbehorende leukemie muismodel

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

De intraveneuze injectie van C1498-cellen in syngene of congene muizen is uitgevoerd sinds 1941. Deze injecties leiden tot de ontwikkeling van acute leukemie. De aard van deze ziekte is nog niet goed gedocumenteerd in de literatuur. Hier geven we een technisch protocol voor het karakteriseren van C1498-cellen in vitro en voor het bepalen van de aard van de geïnduceerde leukemie in vivo. Het eerste deel van deze procedure is gericht op het bepalen van hematopoietische afkomst en het stadium van differentiatie van gekweekte cellen C1498. Hiertoe wordt meerdere parametrische flowcytometrische kleuring gebruikt om hematopoietische cel markers detecteren. Immunofluorescentiemicroscopie, cytochemie en May-Grünwald Giemsa kleuring worden vervolgens uitgevoerd om de expressie van myeloperoxidase, de activiteit van esterases en cellulaire morfologie beoordelen respectievelijk. Het tweede deel van dit protocol is gewijd aan het beschrijven van de leukemie ziekte die wordt opgewekt invivo. Dit laatste kan worden bereikt door het bepalen van de frequentie van leukemische en inherent cellen in het bloed, hematopoëtische organen (bijvoorbeeld, beenmerg en milt) en niet-lymfoïde weefsel (zoals lever en longen) met specifieke kleuring en flowcytometrie analyse. De aard van de leukemie wordt vervolgens bevestigd met May-Grünwald Giemsa kleuring en kleuring voor specifieke esterasen in het beenmerg. Hier presenteren we de resultaten die werden verkregen met behulp van dit protocol in vergelijkbare leeftijd C1498- en PBS-geïnjecteerde muizen.

Om de C1498 muismodel karakteriseren, gingen we met twee grote stappen. Eerst werden de cellen C1498 kenmerk hun hematopoietische afkomst en maturatie in vitro (figuur 1) te bepalen. Deze cellen werden vervolgens geïnjecteerd in congene muizen, en de aard van de geïnduceerde leukemische ziekten is onderzocht op verschillende eigenschappen te bepalen: leukemische infiltratie, hun fenotype, een kwantificering van de hematopoietische cellen (volwassen en voorlopers / voorlopers) in beenmerg, de frequenties van C1498-cellen en rijpe hematopoietische cellen in het bloed en een evaluatie van orgaan zwelling (in de milt, lever en longen) en cellulaire samenstelling. De C1498 cel fenotypes in vitro te karakteriseren, werden de cellen gelabeld met antilichamen gericht tegen moleculen die door hematopoietische voorlopers en volgroeide cellen (tabel 1) uitgedrukt en de resultaten werden geanalyseerd onder toepassing van stroming cytometry. De C1498-cellen waren positief voor celoppervlakte-expressie van Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (&gt; 25%), en zij toonden intracellulaire expressie van CD3e, T-celreceptor (TCR) Vp ketens en Mac -3 (figuren 2A en B). De cellen waren negatief voor de celoppervlak markers Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1 en pan-NK moleculen en voor de intracellulaire expressie van CD4 en CD8 (data niet getoond) . Zij werden vervolgens onderzocht op merkers van hematopoietische stamcellen en voorlopers (tabel 1). Ze waren ook negatief voor celoppervlak expressie van CD117, CD34, Sca-1, CD150 en CD16 / 32 (gegevens niet getoond). Deze leukemische cellen werden vervolgens getest op de expressie van adhesie, antigeenpresentatie en co-stimulerende moleculen te bepalen. De cellen brachten de oppervlakte markers LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), en H-2D b en waren negatief voor MHC klasse II, CD80, CD86 en CD274 (gegevens niet getoond). C1498 cellen therefore uitgedrukt zowel myeloïde (Mac-1, Mac-3) en lymfatische markers (B220, CD3, TCR). Om beter te karakteriseren hun hematopoietische afkomst, werd myeloperoxidase expressie bepaald met immunofluorescentie microscopie. Alle cellen waren positief voor de myeloperoxidase, die hun myeloïde oorsprong (Figuur 3A) geverifieerd. Een meerderheid van de cellen ook positief voor gekleurd α-naftyl butyraat esterases (Figuur 3B, linker paneel), en sommige gekleurd voor het naftol AS-D chlooracetaat esterases (zwarte pijlen) (Figuur 3B, rechter paneel). De resultaten geven aan dat de cellen bevatten mengsels van monocytische cellen en granulocyten. Na May-Grünwald Giemsa kleuring werd uitgevoerd, werden de C1498 cellen waargenomen dat een ontploffing-achtige morfologie te tonen met een hoge nucleo-cytoplasmatische ratio, 3-5 nucleoli in de kern, een perinucleaire halo, tal van vacuolen en een basofiele cytoplasma (Figuur 3C ). thons, is de C1498 cellijn bestaat uit monoblast en myeloblasten. De C1498-cellen (CD45.2 +) werden vervolgens intraveneus geïnjecteerd in CD45.1 + muizen. De muizen bezweken 17 tot 19 dagen na de cellen werden geïnjecteerd. Deze muizen werden opgeofferd zodat de leukemie soort kunnen worden geanalyseerd voor hun dood aan de ziekte. De controlemuizen die waren geïnjecteerd met PBS, werden geanalyseerd tegelijkertijd voor de vergelijking. De C1498-cellen geïnjecteerde muizen weergegeven massale infiltratie van C1498-cellen in beenmerg, zoals blijkt uit de explosie-achtige uiterlijk van de cellen na May-Grünwald Giemsa kleuring werd uitgevoerd (Figuur 4A). Zij behouden eveneens hun monocyt en granulocyten fenotypen (Figuur 4B en C), waaruit een opeenstapeling van monoblastic en myeloblastische cellen die kenmerkend is voor acute myelomonocytische leukemie. om determine of medullaire hematopoietische cellen aantallen lager waren volgende leukemische cellen invasie, CD45.2 + C1498 cellen, B-lymfocyten, monocyten en granulocyten populatie (met inbegrip van voorouders, voorlopers en volgroeide cellen), werden gekwantificeerd met behulp van immunofluorescentie kleuring en multi-parametrische flowcytometrie analyse. Leukemische cellen vertegenwoordigde 16-36% van de hematopoietische cellen (gegevens niet getoond). De andere celtypen werden alle in aanzienlijk lagere aantallen in het C1498-geïnjecteerde muizen dan in de PBS-geïnjecteerde muizen (met 5-voudig gemiddeld B cellen, 4-voudige gemiddeld myeloïde cellen en 3-voudig gemiddeld voor monocytische subsets) (Figuur 5A tot C). Een onderzoek van de frequenties van mononucleaire cellen in leukemische en controlemuis bloedmonsters aangetoond dat ze een vergelijkbaar percentage lymfocyten (figuur 6A), maar een hogere frequentie van monocytische bevatteen leukemische cellen. Deze kenmerken zijn representatief voor acute myelomonocytische leukemie 11 (figuur 6B). Onder de andere kenmerken van acute myelomonocytische leukemie 12, het C1498-geïnjecteerde muizen gepresenteerd met gezwollen lever (hepatomegalie), longen en milt (splenomegalie) (Figuur 7A). Verschillende frequenties van CD45.2 + C1498 cellen werden gedetecteerd in deze organen middels immunofluorescentie kleuring en flowcytometrie-analyse (Figuur 7B). Aangezien splenomegalie kan het gevolg zijn van grote aantallen geïnfiltreerde monocyten, schatten we ook de verhoudingen van milt populaties. Het aantal cellen in het lymfatische B, monocyt en granulocyten celfracties significant groter, met gemiddeld 2-voudig, 2,5-voudig en 3-voudig, respectievelijk, in leukemische milten dan in de controle milten (figuur 7C). thin-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van het protocol instellen voor het karakteriseren in vitro gekweekte C1498 cellijnen en in vivo beschrijvingen van acute leukemie. De hematopoietische afkomst en het differentiatiestadium van weefsel gekweekte C1498 cellen werden eerst bepaald. C1498 cellen werden vervolgens geïnjecteerd in congene muizen om de ontwikkeling van acute leukemie veroorzaken. De isolatie van beenmerg, perifeer bloed, milt, lever en longen werd uitgevoerd om de frequenties fenotypes en morfologische veranderingen na de C1498 cellen infiltratie bepalen. IV: Intraveneuze MGG:. May-Grünwald Giemsa <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <html> ad / 54270 / 54270fig2.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. Fenotypische analyse van C1498-cellen na in vitro cultuur. Representatieve flowcytometrie dot plots en histogrammen van celoppervlak (A) en intracellulaire (B) C1498-moleculen die tot expressie werden geassocieerd met volwassen hematopoietische celdifferentiatie getoond. C1498-cellen werden geoogst van kweken, gewassen en gelabeld met fluorescente antilichamen die specifiek zijn voor het celoppervlak CD11b, CD18 en B220 merkers of hun isotype controles waren. Voor intracellulaire kleuring werden de cellen gefixeerd, gepermeabiliseerd en geëtiketteerd met antilichamen gericht tegen Mac-3, CD3e en een gemeenschappelijke epitoop van de TCR (T-celreceptor) Vp keten of hun isotype controles. Analyses werden uitgevoerd met behulp van venstertijd met levende cellen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <html> ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" /> Figuur 3. Functionele en morfologische karakterisering van Gekweekte C1498 Cells. C1498 cellen werden geoogst uit culturen en gecentrifugeerd op objectglaasjes voor microscopie. (A) Kleuring voor myeloperoxidase expressie werd uitgevoerd onder toepassing van immunofluorescentie. (B) Cytochemische reacties werden gebruikt voor de α-naftyl butyraat esterase (NBE) en naftol AS-D-chlooracetaat esterase analyseren (CAE) activiteiten in C1498-cellen. Cellen werden als positief beschouwd voor elk label als bruin en rood-paars, grote cytoplasmatische granules werden respectievelijk waargenomen worden. (C) May-Grünwald Giemsa (MGG) kleuring van C1498-cellen. Voor elke kleuring experiment wordt de microscopie objectiefvergroting aangegeven. Elk beeld is representatief voor drie afzonderlijke experimenten.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" /> Figuur 4. Bone Marrow morfologie PBS en C1498-geïnjecteerde muizen. Beenmerg cellen werden uit PBS en C1498-cellen geïnjecteerde muizen geïsoleerd en gecentrifugeerd op dia&#39;s voor microscopie. (A) May-Grünwald Giemsa (MGG) kleuring. (B ) α-naftyl butyraat esterase (NBE) en (C) naftol AS-D chlooracetaat esterase (CAE) functies werden geëvalueerd middels cytochemie. In paneel A, de band (onrijpe) of gesegmenteerd (volwassen) neutrofielen minder zichtbaar in het beenmerg van de C1498-geïnjecteerde muizen dan de PBS-geïnjecteerde muizen. Paneel B en C geven aan dat er een accumulatie van monocytische cellen en granulocyten in de leukemische beenmerg vergelijking met de nummers waargenomen in de controle beenmerg. Allemicroscopische analyses werden uitgevoerd met behulp van een 100X vergroting doelstelling. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" /> Figuur 5. Kwantitatieve Analyse van Medullaire Populaties in PBS en C1498-geïnjecteerde muizen. Beenmerg cellen werden uit PBS en C1498-cellen geïnjecteerde muizen geïsoleerd en naar schatting nadat cel telling werd uitgevoerd. De frequenties van de verschillende celpopulaties werden vastgesteld na immunokleuring en levende cellen gated flowcytometrieanalyse. (A) de B cellen opgenomen CD19 + B220 + -cellen in fasen van pro-B-cellen B-lymfocyten (B) granulocytische cellen in de volwassen CD3 - en CD11b + + Ly6G lineages De precursoren een inbegrepen. nd onvolwassen en volwassen granulocyten (C) De monocytische subsets werden gedefinieerd als CD3 - CD115 + en omvatte cellen in de voorlopercellen te monocyten stadia rijpen. n = 7 muizen / groep en de gegevens worden gepresenteerd als histogrammen tonen de gemiddelden ± SEM. *** P &lt;0,0001 en **, p &lt;0,01, t-testen ongepaarde Student&#39;s vergelijken PBS en C1498-geïnjecteerde muizen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" /> Figuur 6. Bloed Analyse van mononucleaire cel subsets in PBS en C1498-geïnjecteerde muizen. Representatieve flowcytometrie dot plots van (A) T en B lymfocyten percentages, die respectievelijk zijn gedefinieerd als CD3 + en B220 + cellen in PBS- en C1498 cellen geïnjecteerd. muizen (B) monocytische cel frequenties in C1498 leukemische en controle (PBS) muizen werden bepaald door het analyseren van CD115 + Ly6C - en CD115 + Ly6C hoge cellen. De analyse werd uitgevoerd door gating levende cellen. Om leukemische en controle muizen te vergelijken, CD45.2 + C1498-cellen werden uitgesloten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 7" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" /> Figuur 7. Schatting van Milt Populaties in leukemie en controle muizen. (A) Representatieve foto van lever, long en milt zwelling in leukemische muizen in vergelijking met controle muizen. De milten werden verzameld en gewogen en splenocyten werden geteld na weefselverstoring. (B) Histogram die leukemische cellen frequenties diffErent organen na immunokleuring werd gedurende CD45.2 + cellen en de resultaten werden geanalyseerd met flowcytometrie. (C) Schattingen van milt B, myeloïde en monocytische celaantallen na immunokleuring en flowcytometrie analyse gating uitgevoerd om levende CD19 + B220 + identificeren , CD3 - CD11b + Ly6G +, CD3 - CD11b + Ly6C - en CD3 - CD11b + Ly6C hoge cellen. De schaalbalken getoond voor de longen, milt en lever geven 1 cm. .. n = 5-8 muizen / groep en de gegevens worden weergegeven in histogrammen als gemiddelden ± SEM *, p &lt;0,05, ** p = 0,0033, t-proef ongepaarde Student&#39;s vergelijken PBS en C1498-geïnjecteerde muizen <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">Zoom klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody&gt; <tr><td> Cell Type </td><td> Membraan of intracellulaire Molecules </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Voorlopers en volgroeide cellen </td><td></td></tr><tr><td> NK-cellen </td><td> NK1.1 +, pan-NK + </td></tr><tr><td> NKT cellen </td><td> NK1.1 +, pan-NK +, TCR Vbeta + (8.2), CD3 + </td></tr><tr><td> T-lymfocyten </td><td> TCR Vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 + </td></tr><tr><td> B-cellen en B-lymfocyten precursors </td><td> B220 +, CD19 +, CD21 / 35 + </td></tr><tr><td> granulocytic precursoren en granulocyten </td><td> Ly6G +, Mac-1 +, CD11b + </td></tr><tr><td> monocytische precursoren en monocyten / macrofagen </td><td> CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> progenitors </td><td></td></tr><tr><td> multipotente voorlopercellen </td><td> CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin- CD150-) </td></tr><tr><td> -Lymfoïde primer multipotente voorlopercellen </td><td> CD117hi Sca-1hi CD127 + (Lin) </td></tr><tr><td> gemeenschappelijke lymfoïde voorlopers </td><td> CD117lo Sca-1LO CD127 + (Lin) </td></tr><tr><td> gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Liri Sca-1-) </td></tr><tr><td> granulocyten-macrofaag voorlopercellen </td><td> CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Liri Sca-1-) </td></tr><tr><td> megakaryocyt-erytroïde voorlopers </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Liri Sca-1-) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematopoietische stamcellen </td><td> CD117 + Sca-1 + CD150 + (Lin- CD34-) </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Merkers van hematopoietische cellijnen en differentiatie. CD: cluster van differentiatie; Lin: markers van rijpe cellen; lo:lage expressie; hi: hoge expressie; int: gemiddeld meningsuiting; NK: natural killer cellen; TCR: T-celreceptor.

Het manuscript geeft een technische procedure die kan worden gebruikt om C1498 celkweken karakteriseren in vitro en acute leukemie geïnduceerd in muizen na de injectie. Fenotypische en functionele analyses worden uitgevoerd met behulp van flowcytometrie, immunofluorescentie microscopie, cytochemie en May-Grünwald Giemsa kleuring.

Een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het Muizen C1498 Cell Line en de bijbehorende Leukemie muismodel

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Het algemene doel van deze procedure is het karakteriseren van murine C1498-cellen en de acute leukemie die zij induceren na intraveneuze injectie in muizen. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat de murine myelomonoctische leukemie die wordt geïnduceerd na een injectie met C1498-cellen veel kenmerken van de menselijke ziekte vertoont. Dit diermodel kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de hematologie, zoals de mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van leukemie en immuundeficiëntie.De implicaties van dit diermodel strekken zich uit tot de behandeling van leukemie, aangezien het het testen van nieuwe chemotherapeutische en immunotherapeutische middelen vergemakkelijkt. Begin met het overplaatsen van een vijf tot zes weken oude vrouwelijke congenische C57 black 6 muis naar een steriele laminaire flowkast. Plaats het dier vervolgens in een fixatieapparaat.Laad vervolgens een spuit van 1 mL, uitgerust met een naald van 29 gauge, met 100 µL cellen. Pak de staart bij het distale uiteinde vast en desinfecteer de huid van de staart met een gaasje gedrenkt in 70% ethanol. Injecteer vervolgens langzaam 1 × 10⁶ cellen in een laterale staartvene.Wanneer alle cellen zijn toegediend, wordt de naald verwijderd en wordt er met steriel gaas lichte druk uitgeoefend op de injectieplaats. Plaats het dier vervolgens terug in de kooi en monitor het nauwgezet gedurende de volgende weken. 17 tot 19 dagen later wordt een capillairbuisje ingebracht in de mediale canthus van het oog van het geanestheseerde leukemische dier.Er wordt 100 tot 200 µL bloed uit de sinus orbitalis in de capillaire buis opgezogen. Verwijder de buis en stel de bloeding stil door voorzichtig een steriel gaasje op het oog te drukken. Draag het bloed vervolgens over naar een EDTA-buis en bewaar de buis op ijs tot aan de isolatie van mononucleaire cellen.Om de mononucleaire bloedcellen te isoleren, voegt u eerst PBS toe, aangevuld met 1 mM EDTA, tot een eindvolume van 500 µL. Breng het monster vervolgens over naar een microcentrifugebuis. Gebruik daarna een spuit van 1 mL uitgerust met een naald van 30 gauge om voorzichtig 500 µL scheidingsoplossing onder het bloed aan te brengen, waarbij u er goed op let dat de lagen niet mengen.Scheid de cellen door middel van centrifugatie en gebruik een pipet om de ondoorzichtige witte laag mononucleaire cellen over te brengen naar een nieuwe microcentrifugebuis. Was de immuuncellen vervolgens in één milliliter PBS. Centrifugeer deze en resuspendeer het pellet in 600 microliters FACS-buffer voor kleuring en analyse via flowcytometrie.Om het beenmerg te isoleren, legt u de muis op zijn rug op een plastic plank en fixeert u de ledematen van het dier. Desinfecteer het dier met 70% ethanol. Snijd vervolgens elk been aan de bovenzijde van het femur boven het gewricht door en trek voorzichtig aan de tibiae om deze los te koppelen van de femura.Gebruik een pincet en een schaar om de huid en spieren van de botten te verwijderen, en breng de botten over naar een petrischaal op ijs. Gebruik een schaar om de extremiteiten te verwijderen. Steek vervolgens een naald van 26 gauge, verbonden met een spuit van 10 milliliter met vijf milliliter koud PBS, in het uiteinde van één bot tegelijk en spoel het beenmerg in de schaal.Druk de cel-suspensie meerdere keren door de naaldpunt om de beenmergcellen te dissociëren. Filter de cellen vervolgens door een nieuw filter van 70 micron in een conische buis van 50 milliliter om een single-cell suspensie te verkrijgen. Centrifugeer de cellen en resuspendeer het pellet in twee milliliter lysisbuffer.Vul de buis onmiddellijk aan met maximaal 50 milliliters koude PBS en centrifugeer de cellen. Resuspendeer vervolgens het beenmergpellet in koude FACS-buffer in een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Om de beenmergcellen voor te bereiden op kleuring, plaatst u eerst objectglazen in wegwerpkamers met vooraf bevestigde filterkaarten en plaatst u de kamers in een cytocentrifuge.Voeg 100 µL FACS-buffer toe aan elke kamer van de filterkaart en centrifugeer de slides kort. Voeg aan het einde van de centrifugatie 100 µL cellen toe aan elke kamer en centrifugeer de cellen. Verwijder vervolgens voorzichtig de slides uit de kamers om ze aan de lucht te laten drogen.Om de beenmergcellen te kleuren, worden de objectglazen vijf minuten ondergedompeld in een Coplin-pot met May-Grunwald-oplossing. Verplaats de objectglazen vervolgens gedurende één minuut naar een pot met bufferoplossing met een pH van 6,8. Verplaats de objectglazen daarna gedurende 10 minuten naar Giemsa R-oplossing.Volg dit met een wasbeurt van 10 seconden met pH-neutraal water. Laat de objectglazen na het wassen aan de lucht drogen en breng één druppel monteermedium aan op elk monster. Plaats vervolgens één rand van een dekglas op het objectglas en laat het dekglas voorzichtig op de cellen zakken, waarbij u zachtjes drukt om eventuele luchtbellen te verwijderen.Vergeleken met de controledieren vertonen de dieren waarin C1498-cellen zijn geïnjecteerd een massale infiltratie van C1498-cellen in hun beenmerg, zoals waargenomen aan het blast-achtige uiterlijk van de cellen. De C1498-cellen die het beenmerg infiltreren, vertonen monocytische en granulocytaire fenotypes die respectievelijk duiden op monoblastische en myeloblastische cellen, wat karakteristiek is voor acute myelomonocytische leukemie. Flowcytometrische analyse van de frequenties van mononucleaire cellen in bloedmonsters van de geïnjecteerde C1498-muizen geeft aan dat ongeveer een kwart van de totale populatie witte bloedcellen bestaat uit leukemische cellen.De frequenties van T- en B-lymfocyten zijn vergelijkbaar tussen de controlegroep en de dieren die zijn geïnjecteerd met C1498. Monocytenfrequenties worden echter op hogere niveaus waargenomen bij C1498-geïnjecteerde muizen, wat een kenmerk is van acute myelomonocytische leukemie. Bij het uitvoeren van de cytochemische procedures en de May-Grünwald Giemsa-kleuring is het belangrijk om te onthouden dat de juiste pH-waarden, temperaturen en incubatietijden moeten worden gehandhaafd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe acute myelomonocytaire leukemie kan worden gekarakteriseerd. Na de ontwikkeling hiervan baande deze techniek de weg voor onderzoekers in het veld van de hematologie om de aard van spontane en geïnduceerde acute leukemie in andere diermodellen te onderzoeken.

a-detailed-protocol-for-characterizing-murine-c1498-cell-line-its

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn prognostische in verschillende uitgezaaide tumoren. Dit manuscript beschrijft de gouden standaard CellSearch systeem (CSS) CTC opsomming platform en hoogtepunten gemeenschappelijke misclassificatie fouten. Daarnaast worden twee aangepast protocollen beschreven gebruiker gedefinieerde marker karakterisering van CTCs en CTC opsomming in preklinische muismodellen van metastase met deze technologie.

Aanpassing van semiautomated doorgeven Tumor Cell (CTC) Testen voor Klinisch en preklinisch onderzoek naar toepassingen

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

De overdracht van bm12-lymfocyten naar een C57BL/6-ontvanger is een gevestigd model van systemische lupus erythematosus. Hier beschrijven we hoe de ziekte kan worden geïnitieerd met behulp van dit model en hoe T-folliculaire helpercellen, germinale centrum B-cellen en plasmacellen kunnen worden gekenmerkt door middel van flowcytometrie.

De bm12 Induceerbare model van systemische lupus erythematosus (SLE) in C57BL / 6 muizen

Dit manuscript geeft een beschrijving van de methodologie die wordt gebruikt om muizenmodellen voor transductie-transplantatie te vestigen. Er wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van technische fouten die moeten worden vermeden bij het uitvoeren van beenmergtransplantaties. Er moet een duidelijk begrip worden verkregen van het belang van hoog viraal titer, transfectie/transductie en bestraling.

Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve aandoening

We beschrijven hier protocollen voor de validatie van het genetische en chemische van c-Fos en Dusp1 als een drug target in met behulp van in vitro en in vivo genetische en gehumaniseerd Muismodellen leukemie. Deze methode kan worden toegepast op een doelwit voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.

Methoden voor de evaluatie van de rol van c-Fos en Dusp1 in afhankelijkheid van de oncogen

We beschrijven een methode voor het gebruik van Multi parameter flow cytometrie te detecteren mitochondriale reactieve zuurstof soorten (ROS) in Murine gezonde hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) en leukemie cellen van een muismodel van acute myeloïde leukemie (AML) gedreven door MLL-AF9.

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

Dit protocol beschrijft de isolatie van dubbelnegatieve thymocyten uit de thymus van de muis, gevolgd door retrovirale transductie en co-cultuur op het delta-achtige 4-tot expressie brengende beenmerg stromale cellijn co-cultuursysteem (OP9-DL4) voor verdere functionele analyse.

Co-cultuur en transductie van murine thymocyten op delta-achtige 4-tot expressie brengende stromale cellen om oncogenen in T-cel leukemie te bestuderen

Hier wordt intra-peritoneale injectie van leukemiecellen gebruikt om acute myeloïde leukemie (AML) bij muizen vast te stellen en te verspreiden. Deze nieuwe methode is effectief bij de seriële transplantatie van AML-cellen en kan dienen als een alternatief voor diegenen die problemen en inconsistenties kunnen ervaren met intraveneuze injectie bij muizen.

Intra-peritoneale transplantatie voor het genereren van acute myeloïde leukemie bij muizen

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om micro-omgevingspopulaties in het beenmerg te isoleren en te karakteriseren op basis van muizenmodellen van myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie. Deze techniek identificeert veranderingen in de niet-hematopoëtische beenmergniche, inclusief de endotheliale en mesenchymale stromale cellen, met ziekteprogressie.

Identificatie van micro-omgevingspopulaties in het beenmerg bij myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie

Het protocol heeft tot doel een muismodel te beschrijven voor het genereren van recidieven van acute lymfatische leukemie, gebaseerd op de dynamiek van de respons op inductiechemotherapie.

Muismodel van leukemie Terugval naar inductiechemotherapie voor acute lymfoblastische leukemie

Leer het karakteriseren van C1498-cellen en de acute leukemie die ze veroorzaken bij muizen. Deze methode gebruikt flowcytometrie en cytochemie om ziekte mechanismen te bestuderen.

Een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het Muizen C1498 Cell Line en de bijbehorende Leukemie muismodel

Meer video's verkennen