Een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het Muizen C1498 Cell Line en de bijbehorende Leukemie muismodel

Het algemene doel van deze procedure is het karakteriseren van murine C1498-cellen en de acute leukemie die zij induceren na intraveneuze injectie in muizen. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat de murine myelomonoctische leukemie die wordt geïnduceerd na een injectie met C1498-cellen veel kenmerken van de menselijke ziekte vertoont. Dit diermodel kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de hematologie, zoals de mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van leukemie en immuundeficiëntie.

De implicaties van dit diermodel strekken zich uit tot de behandeling van leukemie, aangezien het het testen van nieuwe chemotherapeutische en immunotherapeutische middelen vergemakkelijkt. Begin met het overplaatsen van een vijf tot zes weken oude vrouwelijke congenische C57 black 6 muis naar een steriele laminaire flowkast. Plaats het dier vervolgens in een fixatieapparaat.

Laad vervolgens een spuit van 1 mL, uitgerust met een naald van 29 gauge, met 100 µL cellen. Pak de staart bij het distale uiteinde vast en desinfecteer de huid van de staart met een gaasje gedrenkt in 70% ethanol. Injecteer vervolgens langzaam 1 × 10⁶ cellen in een laterale staartvene.

Wanneer alle cellen zijn toegediend, wordt de naald verwijderd en wordt er met steriel gaas lichte druk uitgeoefend op de injectieplaats. Plaats het dier vervolgens terug in de kooi en monitor het nauwgezet gedurende de volgende weken. 17 tot 19 dagen later wordt een capillairbuisje ingebracht in de mediale canthus van het oog van het geanestheseerde leukemische dier.

Er wordt 100 tot 200 µL bloed uit de sinus orbitalis in de capillaire buis opgezogen. Verwijder de buis en stel de bloeding stil door voorzichtig een steriel gaasje op het oog te drukken. Draag het bloed vervolgens over naar een EDTA-buis en bewaar de buis op ijs tot aan de isolatie van mononucleaire cellen.

Om de mononucleaire bloedcellen te isoleren, voegt u eerst PBS toe, aangevuld met 1 mM EDTA, tot een eindvolume van 500 µL. Breng het monster vervolgens over naar een microcentrifugebuis. Gebruik daarna een spuit van 1 mL uitgerust met een naald van 30 gauge om voorzichtig 500 µL scheidingsoplossing onder het bloed aan te brengen, waarbij u er goed op let dat de lagen niet mengen.

Scheid de cellen door middel van centrifugatie en gebruik een pipet om de ondoorzichtige witte laag mononucleaire cellen over te brengen naar een nieuwe microcentrifugebuis. Was de immuuncellen vervolgens in één milliliter PBS. Centrifugeer deze en resuspendeer het pellet in 600 microliters FACS-buffer voor kleuring en analyse via flowcytometrie.

Om het beenmerg te isoleren, legt u de muis op zijn rug op een plastic plank en fixeert u de ledematen van het dier. Desinfecteer het dier met 70% ethanol. Snijd vervolgens elk been aan de bovenzijde van het femur boven het gewricht door en trek voorzichtig aan de tibiae om deze los te koppelen van de femura.

Gebruik een pincet en een schaar om de huid en spieren van de botten te verwijderen, en breng de botten over naar een petrischaal op ijs. Gebruik een schaar om de extremiteiten te verwijderen. Steek vervolgens een naald van 26 gauge, verbonden met een spuit van 10 milliliter met vijf milliliter koud PBS, in het uiteinde van één bot tegelijk en spoel het beenmerg in de schaal.

Druk de cel-suspensie meerdere keren door de naaldpunt om de beenmergcellen te dissociëren. Filter de cellen vervolgens door een nieuw filter van 70 micron in een conische buis van 50 milliliter om een single-cell suspensie te verkrijgen. Centrifugeer de cellen en resuspendeer het pellet in twee milliliter lysisbuffer.

Vul de buis onmiddellijk aan met maximaal 50 milliliters koude PBS en centrifugeer de cellen. Resuspendeer vervolgens het beenmergpellet in koude FACS-buffer in een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Om de beenmergcellen voor te bereiden op kleuring, plaatst u eerst objectglazen in wegwerpkamers met vooraf bevestigde filterkaarten en plaatst u de kamers in een cytocentrifuge.

Voeg 100 µL FACS-buffer toe aan elke kamer van de filterkaart en centrifugeer de slides kort. Voeg aan het einde van de centrifugatie 100 µL cellen toe aan elke kamer en centrifugeer de cellen. Verwijder vervolgens voorzichtig de slides uit de kamers om ze aan de lucht te laten drogen.

Om de beenmergcellen te kleuren, worden de objectglazen vijf minuten ondergedompeld in een Coplin-pot met May-Grunwald-oplossing. Verplaats de objectglazen vervolgens gedurende één minuut naar een pot met bufferoplossing met een pH van 6,8. Verplaats de objectglazen daarna gedurende 10 minuten naar Giemsa R-oplossing.

Volg dit met een wasbeurt van 10 seconden met pH-neutraal water. Laat de objectglazen na het wassen aan de lucht drogen en breng één druppel monteermedium aan op elk monster. Plaats vervolgens één rand van een dekglas op het objectglas en laat het dekglas voorzichtig op de cellen zakken, waarbij u zachtjes drukt om eventuele luchtbellen te verwijderen.

Vergeleken met de controledieren vertonen de dieren waarin C1498-cellen zijn geïnjecteerd een massale infiltratie van C1498-cellen in hun beenmerg, zoals waargenomen aan het blast-achtige uiterlijk van de cellen. De C1498-cellen die het beenmerg infiltreren, vertonen monocytische en granulocytaire fenotypes die respectievelijk duiden op monoblastische en myeloblastische cellen, wat karakteristiek is voor acute myelomonocytische leukemie. Flowcytometrische analyse van de frequenties van mononucleaire cellen in bloedmonsters van de geïnjecteerde C1498-muizen geeft aan dat ongeveer een kwart van de totale populatie witte bloedcellen bestaat uit leukemische cellen.

De frequenties van T- en B-lymfocyten zijn vergelijkbaar tussen de controlegroep en de dieren die zijn geïnjecteerd met C1498. Monocytenfrequenties worden echter op hogere niveaus waargenomen bij C1498-geïnjecteerde muizen, wat een kenmerk is van acute myelomonocytische leukemie. Bij het uitvoeren van de cytochemische procedures en de May-Grünwald Giemsa-kleuring is het belangrijk om te onthouden dat de juiste pH-waarden, temperaturen en incubatietijden moeten worden gehandhaafd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe acute myelomonocytaire leukemie kan worden gekarakteriseerd. Na de ontwikkeling hiervan baande deze techniek de weg voor onderzoekers in het veld van de hematologie om de aard van spontane en geïnduceerde acute leukemie in andere diermodellen te onderzoeken.