Een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het Muizen C1498 Cell Line en de bijbehorende Leukemie muismodel

Het algemene doel van deze procedure is om Murine C1498-cellen en de acute leukemie die ze induceren na intraveneuze injectie in muizen te karakteriseren. Het grote voordeel van deze procedure is dat de muis-myelomonocytische leukemie die wordt geïnduceerd na een C1498-cellen injectie, veel kenmerken vertoont van de menselijke ziekte. Dit dierenmodel kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van hematologie te beantwoorden, zoals wat de mechanismen zijn die leiden tot leukemieontwikkeling en immuundeficiëntie.

De implicaties van dit dierenmodel strekken zich uit tot de behandeling van leukemie, aangezien het de testen van nieuwe chemo- en immunotherapeutische middelen vergemakkelijkt. Begin door een vrouwelijke congene C57 zwarte 6 muis van vijf tot zes weken oud over te brengen naar een steriele laminare stromingskast. Plaats vervolgens het dier in een begrenzer.

Laad vervolgens een een milliliter spuit voorzien van een 29 gauge naald met 100 microliter cellen. Pak het staartje van het distale uiteinde vast en desinfecteer de staarthuid met een met 70% ethanol doordrenkte gaasjes. Injecteer vervolgens langzaam eenmaal 10 tot de zesde cellen in een laterale staartader.

Wanneer alle cellen zijn afgegeven, verwijder de naald en oefen zachte druk uit op de injectieplaats met steriele gaasjes. Breng het dier vervolgens terug in zijn kooi met zorgvuldige monitoring gedurende de komende weken. 17 tot 19 dagen later, steek een capillaire buis in de mediale canthus van het oog van het verdoofde leukemie-dier.

100 tot 200 microliter bloed wordt uit de orbitale sinus in de capillaire buis getrokken. Verwijder de buis en controleer het bloeden met de zachte toepassing van een steriele gaasjespons op het oog. Breng vervolgens het bloed over in een EDTA-buis en bewaar de buis op ijs tot de isolatie van mononucleaire cellen.

Om de mononucleaire bloedcellen te isoleren, voeg eerst PBS toe dat is aangevuld met één millimolair EDTA tot een eindvolume van 500 microliter. Breng vervolgens het monster over naar een microcentrifugebuisje. Gebruik vervolgens een een milliliter spuit voorzien van een 30 gauge naald om zorgvuldig 500 microliter separaat oplossing onder het bloed te leggen, zorg ervoor dat de lagen niet worden gemengd.

Scheed de cellen door centrifugatie en gebruik een pipette om de ondoorzichtige witte mononucleaire cel laag over te brengen naar een nieuw microcentrifugebuisje. Was vervolgens de immuuncellen in één milliliter PBS. Centrifugeer ze en suspendeer het pellet in 600 microliter FACS buffer voor kleuring en analyse door middel van flowcytometrie.

Om het beenmerg te isoleren, plaats de muis op zijn rug op een plastic plank en zet de ledematen van het dier vast. Desinfecteer het dier met 70% ethanol. Snijd vervolgens elk been aan de bovenkant van het dijbeen boven de gewricht en trek zachtjes aan de scheenbeenderen om ze los te maken van het dijbeen.

Gebruik pincetten en schaar om de huid en spieren van de botten te verwijderen en breng de botten over in een petrischaal op ijs. Gebruik schaar om de uiteinden te verwijderen. Steek vervolgens een 26 gauge naald bevestigd aan een 10 milliliter spuit bevattende vijf milliliters koude PBS in het uiteinde van één bot tegelijk en spoel het beenmerg in de schotel.

Breng de cel suspensie meerdere keren door de naaldpunt om de beenmergcellen te verstoren. Filter vervolgens de cellen door een nieuwe 70 micron filter in een 50 milliliter conische buis om een enkele cel suspensie te verkrijgen. Centrifugeer de cellen en suspendeer het pellet opnieuw in twee milliliters lysis buffer.

Vul de buis onmiddellijk met maximaal 50 milliliter koude PBS en centrifugeer de cellen. Breng vervolgens het beenmerg pellet opnieuw op één maal 10 tot de zesde cellen per milliliter in koude FACS buffer. Om de beenmergcellen voor te bereiden op kleuring, plaats eerst dia's in wegwerpbare kamers met vooraf bevestigde filterkaarten en plaats de kamers in een cytocentrifuge.

Voeg 100 microliter FACS buffer toe aan elke filterkaartkamer en centrifugeer de dia's kort. Aan het einde van de draai toevoegen van 100 microliter cellen aan elke kamer en centrifugeer de cellen. Verwijder vervolgens de dia's voorzichtig uit de kamers voor het drogen in de lucht.

Om de beenmergcellen te kleuren, dompel de dia's gedurende vijf minuten in een coplin pot met May-Grunwald oplossing. Breng vervolgens de dia's over in een pot met bufferoplossing met een pH van 6,8 gedurende één minuut. Breng vervolgens de dia's over in Giemsa R oplossing gedurende 10 minuten.

Gevolgd door een 10 seconden wassen met pH-neutraal water. Laat de dia's na het wassen drogen en breng één druppel montage medium aan op elk monster. Plaats vervolgens een rand van een dekglas op de dia en laat het dekglas voorzichtig op de cellen zakken, waarbij voorzichtig wordt gedrukt om eventuele luchtbellen te verwijderen.

In vergelijking met controledieren vertonen de C1498-cel geïnjecteerde dieren een massale infiltratie van C1498-cellen in hun beenmerg, zoals waargenomen door het blast-achtige uiterlijk van de cellen. De beenmerg infiltrerende C1498-cellen vertonen monocytische en granulocytische fenotypes die kenmerkend zijn voor respectievelijk monoblastische en myeloblastische cellen, kenmerkend voor acute myelomonocytische leukemie. Flowcytometrische analyse van de frequenties van mononucleaire cellen in bloedmonsters van de C1498 geïnjecteerde muizen geeft aan dat ongeveer een kwart van de gehele witte bloedcelpopulatie bestaat uit leukemie cellen.

T en B lymfocytcellen frequenties zijn vergelijkbaar tussen controle- en C1498 geïnjecteerde dieren. Monocytcellen frequenties worden echter waargenomen op hogere niveaus in C1498 geïnjecteerde muizen, een kenmerk van acute myelomonocytische leukemie. Bij het uitvoeren van de cytochemie en May-Grunwald Giemsa procedures is het belangrijk om te onthouden de juiste pH-waarden, temperaturen en incubatietijden te handhaven.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u acute myelomonocytische