Name: Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een Escherichia coli Cell-free transcriptie-vertaalsysteem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Leer residu-specifieke opneming van noncanonieke aminozuren in eiwitten met een Escherichia coli cell-free systeem. Deze methode ondersteunt onderzoek naar eiwitstructuur en functie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

E.G. Worst en A. Ott erkennen financiële ondersteuning door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) binnen het onderzoekscentrum SFB 1027, evenals de Universiteit van Saarland. E.G. Worst, A. Ott en V. Noireaux erkennen verder financiële steun door de Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). De auteurs danken Tobias Baumann en Stefan Oehm (Institut für Chemie, Technische Universität Berlin) voor het kritiek lezen.

De auteurs hebben niets te onthullen.

An-gemakkelijk te celvrij expressiesysteem als een haalbare strategie met residu-specifiek nemen NCAAs in eiwitten, wordt gepresenteerd. Hiertoe wordt het ruwe extract aangevuld met vector DNA dat codeert voor het eiwit van belang, de energiebuffer en de overeenkomstige aminozuren. Merk op dat het ruwe extract analyse gebruikte hoeveelheid hangt af van het ruwe extract eiwitconcentratie 34. De celvrije expressie efficiency wordt geoptimaliseerd, afhankelijk van het vector DNA constructie concentratie. De volumes van de energiebuffer componenten variëren afhankelijk van optimale Mg- en K-glutamaat concentraties om hoge opbrengsten van de celvrije expressie modeleiwit schakelen. Een voorlopige evaluatie van verwerking experiment kan bepaald worden door SDS-PAGE van het gezuiverde celvrije reactiemedium. Voor een meer gedetailleerde analyse wordt HPLC-ESI massaspectroscopie voorgesteld als een middel om te controleren op volledige, residu-specifieke INCORperforeren van de NCAA. Ter voorbereiding op de laatste, zijn spin-kolom systemen die worden gebruikt om His-tag zuivering mogelijk te maken en buffer uitwisseling met de kleine volumes die we gebruiken in dit protocol. Waaronder HPLC-ESI massaspectroscopie kan de gehele protocol worden uitgevoerd binnen 2 dagen. Het bevat geen bijzonder kritische stappen. Echter, concentratie optimalisaties van Mg- en K-glutamaat en van vector DNA cruciaal om hoge opbrengsten van het model eiwit tot expressie. Het gebruik van de zeer efficiënte expressie vector pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 wordt sterk aanbevolen. Elutie van His-gemerkte eiwitten meestal vanwege de hoge concentratie imidazool (&gt; 150 mM) en andere zouten zoals NaH 2 PO 4 (&gt; 300 mM) en NaCl (&gt; 50 mM) die hoge achtergrondruis massaspectroscopische analyse 49 genereren . Uitwisseling van dergelijke elutiebuffers met een geschikt eiwit opslag buffer stabiliseert het model protein en drastisch vermindert ruis achtergrond tijdens de massa-spectroscopische analyse. Hierdoor kan Arg vervangt in alle zes posities binnen het modeleiwit. In het expressiesysteem kan geen Arg residuen worden gedetecteerd. Dit vereenvoudigt het residu-specifieke incorporatie van Arg analogen vergelijking met andere expressiesystemen die verdere uitputting strategieën 29,30 vereisen. De gepresenteerde celvrije benadering omzeilt de inherente beperkingen van in vivo technieken die door Can toxiciteit of de sterke afhankelijkheid van mRNA sequentie in één eiwitproductie strategieën 24,31. Anders dan het gebruikte in vitro systeem, in vivo splitsing van Can to homoserine en hydroxyguanidine 31 optreedt. De celvrije systeem behoudt een voldoende hoeveelheid Lys concurreren met analogen zoals Hyl. De HPLC-ESI massa- spectroscopische analyse blijkt dat het model eiwit bevat zowel de canonical alsmede de analoge noncanonical in verschillende verhoudingen. Het residu-specifieke incorporatie van Lys is mogelijk in het algemeen, maar voor volledige vervanging, verdere uitputting strategieën, of speciaal ontworpen Aars en tRNA geoptimaliseerd voor de erkenning van NCAAs moeten worden ontwikkeld. We bereikten uitstekende opbrengsten van celvrije expressie, bewerkt modeleiwitten door toevoeging NCAA bij dezelfde concentratie als de canonieke degenen. De opnamedoelmatigheid afhankelijk van de aard van de Ncaa worden opgenomen. Nog hogere opbrengsten mogelijk nog realiseerbaar door het optimaliseren van de concentratie van de NCAA. De gepresenteerde resultaten tonen de toepasbaarheid van het gebruikte systeem voor de residu-specifieke incorporatie van NCAAs zolang zij de canonieke endogene translationele systeem geaccepteerd. Voor het residu-specifieke incorporatie van specifieke NCAAs, een verdere behoefte om te controleren of de residuen van de analoge CAA verstoring,b de expressie systeem. Celvrije transcriptie-translatie systemen kunnen worden geconstrueerd uit verschillende organismen reactie op verschillende eisen 54. De all E. coli transcriptie-translatie machines van de hier gepresenteerde celvrij systeem staat het gebruik van bacteriofaag en E. coli promotors, en ze kunnen handelen in parallel of na elkaar in cascades 55. De algemene toepasbaarheid en bruikbaarheid maken de methode een krachtig instrument voor verder onderzoek in aminozuur toxiciteit en therapeutische toepassing.

De genetische code is universeel naar de biosfeer. Het codeert voor een set van 20 canonieke aminozuren, die soms selenocysteïne of pyrrolysine 1 2 verlengd. Het is het ribosoom dat de genetische code met behulp van tRNA&#39;s in ketens van aminozuren die vouwen in eiwit vertaald. De functionele groepen van de canonieke aminozuren, in combinatie met posttranslationele modificaties dragen een uitzonderlijk groot aantal eiwitfunctie 3,4. In principe kunnen functionele beperkingen als gevolg van de beperkte reeks van canonieke aminozuren worden overwonnen door verdere integratie, noncanonical aminozuren (NCAAs) die nieuwe verbindingen en nieuwe functionaliteiten 3,4 in te schakelen. Er zijn twee complementaire benaderingen voor de integratie van NCAAs: de site- of residu-specifieke opname. De eerste methode houdt in aanzienlijke technische moeilijkheden, omdat de canonieke set van aminoacyl-tRNA-synthetases (JAV) en tRNA&#39;s moeten worden uitgebreid met een orthogonaal Aars-tRNA paar die niet mag communiceren met de endogene vertaling machines. Gebaseerd op zorgvuldige techniek Deze benadering omvat NCAAs als enkelvoudige puntmutaties in het gewenste eiwit sites. Site-specifieke incorporatie van NCAAs genetisch gecodeerd door een codon dat niet is toegewezen aan een canonieke aminozuren (CAA), meestal een stopcodon 5-9. Deze methode verandert met op een bepaalde plaats in plaats van over het gehele eiwit 10-13. In contrast, residu-specifieke incorporatie berust op onjuiste erkenning van de noncanonical aminozuur door de canonieke vertaling van machines. De incorporatie optreedt als gevolg van het ontbreken van substraatspecificiteit van de aars. Het residu-specifieke incorporatie van NCAAs, gebouwd op het werk van Cohen en collega&#39;s 14, heeft geleid tot belangrijke toepassingen 3,10, waaronder bio-orthogonale labeling 15-17 van eiwittenof structuuropheldering van eiwitten in röntgenkristallografie 18. Als natuurlijke Aars algemeen de voorkeur aan hun verwante aminozuur over een isostructurele NCAA, efficiënt in vivo residu-specifieke incorporatie vereist meestal een auxotrofe gastheer voor expressie niet in staat is het synthetiseren van de canonieke analoog van de NCAA. De gastheercellen worden gekweekt in groeimedium dat slechts een lage concentratie van de analoge CAA levert. Uitputting ervan in combinatie met de opeenvolgende suppletie met de NCAA dwingt de expressie gastheer NCAA nemen in het model eiwit op meerdere canoniek voorgeschreven plaatsen. In tegenstelling tot de plaatsspecifieke aanpak, heeft dit meestal een diepe impact op de gehele eiwitstructuur, wat leidt tot aanzienlijke wijzigingen fysische en chemische eigenschappen van eiwitten 19,20. De meeste van de NCAAs zijn groeiremmers voor expressiegastheer 3 mocht worden opgenomen in veel andere proteins naast die van de rente gedurende recombinante genexpressie. Dit beperkt duidelijk de in vivo benadering. De in vivo incorporatie van aminozuren die toxisch zijn of sterke invloed op de eiwitstructuur blijft bijzonder uitdagend. Echter, deze moleculen behoren tot de meest veelbelovende eiwitten met bijzondere functies ingenieur. Een voorbeeld is het toxisch, noncanonical natuur voorkomende L-canavanine (Can), een analogon van L-arginine (Arg). Het beïnvloedt en blokkeert Arg geassocieerde, regulerende en katalytische reactie trajecten, en haar aanwezigheid in de levende cel kan leiden tot een onmiddellijke dood 3,21-23. Haar opname in eiwitten op arginine posities kunnen eiwit stabiliteit 21-23 te verminderen. Door de resulterende toxiciteit expressie van Canavanine bevattende eiwitten in Escherichia coli (E. coli) en andere gebruikelijke expressiegastheren blijft een uitdaging. Daarom, volledig in vivo incorporation Can helemaal Arg posities correct werd eenmaal 24 bevestigd met behulp van een enkele uitgewerkte-eiwit productiesysteem. Echter, Can voorgesteld als een antikankermiddel 25-27, en als stimulator voor auto-immuunziekten bij mensen 28. Bovendien is het onderwerp van verscheidene onderzoeken naar de anti-metabolische, antibacterieel, antischimmel en antivirale eigenschappen 25. Deze eigenschappen verhogen een vraag naar efficiënte en eenvoudig te voeren methoden te drukken kan bevattende eiwitten voor farmaceutische, medische en functionele studies. Hoewel vele problemen die verbonden zijn met in vivo productie kan worden omzeild met behulp celvrije expressiesystemen in vitro residu-benaderingen zijn slechts weinig onderzocht. De celvrije residu-specifieke incorporatie van een L-tryptofaan analoge 29 en meerdere NCAAs 30 gemeld. Deze werkwijzen zijn gebaseerd op de zeer efficseerde T7 RNA polymerase. De T7 RNA polymerase inhoudt bacteriofaag-achtige transcriptie, waardoor genetische functionaliteit in vergelijking met endogene transcriptie verlagen. Totale residu-specifieke incorporatie van Can een modeleiwit helemaal Arg posities Onlangs werd 31 onder toepassing van een celvrij expressiesysteem 32. Een kleine wijziging van hetzelfde systeem ingeschakeld plaatsspecifieke inbouw van verschillende pyrrolysine analogen in een model eiwit via stopcodon onderdrukken 33. De gebruikte cel-free-systeem 31-33 is gebaseerd op een all E. coli transcriptie-vertaalsysteem. Toch maakt eiwitexpressie zo efficiënt in de huidige systemen bacteriofaag (0,5-1 mg / ml recombinant eiwit) 32, terwijl steeds veel van de oorspronkelijke transcriptie-translatie modulariteit. In dit werk wordt een gedetailleerd protocol verschaft over de wijze waarop het residuUE-specifieke incorporatie van NCAAs kan worden gerealiseerd met deze alle E. coli-cel-free-systeem 32. Bovendien, verdere stappen om de tot expressie gebrachte eiwitten voor een goede evaluatie via HPLC-ESI massaspectroscopie bereiden voorgesteld. Om de eigenschappen van deze cel-free-systeem uit te breiden, werkt dit niet alleen betrekking op de gepubliceerde incorporatie van Can 31, maar presenteert ook nieuwe gegevens met betrekking tot de noncanonical L-lysine analoog L-hydroxy-lysine. De volgende protocol voor het residu-specifieke incorporatie van NCAAs is een bewerking van een protocol onlangs gepubliceerd in Jupiter 34. Het laatste protocol beschrijft hoe zeer efficiënte celvrije expressie met standaard aminozuren uit te voeren. Bovendien presenteert de bereiding van het ruwe celvrije extract, de aminozuuroplossing, energie voorraadoplossing en de energiebuffer in deze benadering. Het volgende protocol is gericht op gemodificeerde stappen in vergelijking met de vorige pROTOCOL teneinde de residu-specifieke incorporatie van NCAAs mogelijk. Gekalibreerde pipetten, low-bindende pipet tips en micro-centrifuge buizen worden aanbevolen voor de bereiding. Hierna worden IUPAC afkortingen voor de aminozuren gebruikt.

<table><tbody><tr><td>Beschermende bril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z758841</td><td></td></tr><tr><td>Nitrilbovenhandschoenen (maat S)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z768960</td><td>Catalogusnummers andere maten: Z768979 voor M, Z768987 voor L en Z768995 voor XL</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock buis 1,5 ml (PCR schoon)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Microbalans Discovery DV114CM</td><td>Ohaus, Greifensee, Zwitserland</td><td>80104140</td><td></td></tr><tr><td>Microspatula (L 6 5/8 in., roestvrij staal, staaf diam. 0,09 in.)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z243213</td><td></td></tr><tr><td>L-Canavanine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C9758</td><td>Acute toxiciteit: draag oogbescherming, stofmasker, beschermende handschoenen</td></tr><tr><td>Hydroxylysine (racemisch mengsel)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H0377</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-handschoenen (maat S, waterbestendig)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z183490</td><td>Catalogusnummers andere maten: Z183512 voor M, Z183520 voor L en Z183539 voor XL</td></tr><tr><td>RTS Aminozuur Sampler</td><td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Duitsland</td><td>BR1401801</td><td>Voor zelfgemaakte bereiding van aminozuur stockoplossingen, volg dit protocol35 en gebruik het solide aminozuur kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteïne (30089-25G), L-histidine (53319-25G) en L-lysine (L5501-5G)&nbsp; (alle van Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>23160</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (van E. coli, verpakkingsgrootte 100 mg)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>10109541001</td><td>Catalogusnummer voor verpakkingsgrootte van 500 mg is 10109550001</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>NAD (van gist)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A9501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamaat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamaat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td><td>Addgene, Cambridge, USA</td><td>Plasmid #40019</td><td></td></tr><tr><td>4-20% voorgegoten Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 banen)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Duitsland</td><td>TG 81610</td><td></td></tr><tr><td>SDS lopende buffer (10 x concentraat, 5.000 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Duitsland</td><td>TG 50001</td><td></td></tr><tr><td>SDS laadbuffer (2 x concentraat, 50 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Duitsland</td><td>TG 05002</td><td></td></tr><tr><td>Ongekleurde eiwitmarker, breed bereik (2-212 kDa)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>P7702S</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>1060091011</td><td>Toxisch bij inademing, bij contact met de huid en indien ingeslikt: draag beschermende handschoenen en werk onder afzuigkap</td></tr><tr><td>Azijnzuur (99,8%)</td><td>VWR International, Darmstadt, Duitsland</td><td>20104.447</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blauw G-250 (10 g)</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Duitsland</td><td>902120</td><td></td></tr><tr><td>His-Spin Eiwit Miniprep kit</td><td>Zymo Research Europe, Freiburg, Duitsland</td><td>P2002</td><td>Product ook gedistribueerd door Zymo Research Corporation, Irvine, USA&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol, 99%</td><td>VWR International, Darmstadt, Duitsland</td><td>24397.296DB</td><td></td></tr><tr><td>CentriPure Z25 mini spin kolommen</td><td>Genaxxon bioscience, Ulm, Duitsland</td><td>CP-0205-Z100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator 5301</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td>5301 000.210</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td><td>113012032</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bead-beating buisjes (polypropyleen microvialen)</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>522S</td><td></td></tr><tr><td>Beads, 0,1&nbsp;mm diam.</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli stam</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA eiwit assay Kit</td><td>Bio-Rad, M&uuml;nchen, Duitsland</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenicol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes, 1,5&nbsp;ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>

residu-specifieke opneming van noncanonical aminozuren in eiwitten model behulp van een<em&gt; escherichia coli</em&gt; cell-free transcriptie-vertaalsysteem

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

De canonieke set van aminozuren leidt tot een uitzonderlijk breed scala aan eiwitten functionaliteit. Toch is de set van residuen legt nog steeds beperkingen op mogelijke eiwit toepassingen. De integratie van noncanonical aminozuren kan dit bereik vergroten. Er zijn twee complementaire benaderingen voor de integratie van noncanonical aminozuren. Voor plaatsspecifieke integratie, naast de endogene canonieke translationele machines, een orthogonaal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair moet worden dat geen interactie met de canonieke degenen. Derhalve een codon dat niet is toegewezen aan een canoniek aminozuur, gewoonlijk een stopcodon, is ook vereist. Deze genetische code uitbreiding maakt de opname van een noncanonical aminozuur op één bepaalde plaats in het eiwit. De hier gepresenteerde werk beschrijft residu-specifieke integratie, waar de genetische code wordt toegewezen binnen de endogene translationele systeem. De vertaling van een machineccepts de noncanonical aminozuur als vervanging op te nemen in canoniek voorgeschreven locaties, dat wil zeggen, zijn alle instanties van een canonieke aminozuren in het eiwit vervangen door een noncanonical. De opname van noncanonical aminozuren kan de eiwitstructuur veranderen, waardoor aanzienlijke wijzigingen fysische en chemische eigenschappen. Noncanonical aminozuuranalogen vaak als celgroei inhibitoren expressiegastheren aangezien endogene eiwitten wijzigen beperkend vivo eiwitproductie. In vivo incorporatie van toxische noncanonical aminozuren in eiwitten blijft bijzonder uitdagend. Hier wordt een celvrij benadering voor een volledige vervanging van L-arginine door het noncanonical aminozuur L-canavanine gepresenteerd. Het omzeilt de inherente problemen van in vivo expressie. Daarnaast wordt een protocol doeleiwitten bereiden massaspectrale analyse omvatte. Er wordt aangetoond dat L-lysine kan worden vervangen door L-hydroxy-lysine,zij het met een lager rendement. In principe kan elk noncanonical aminozuuranaloog met de onderhavige methode zolang de endogene in vitro translatiesysteem herkend worden opgenomen.

Dit protocol begeleidt bij de celvrije residu-specifieke incorporatie van NCAAs in modeleiwitten. Zij stelt voor SDS-PAGE voor een voorlopige evaluatie van de integratie experiment en verdere stappen om het model eiwitten voor te bereiden op een geschikte HPLC-ESI massa spectroscopische analyse. Hier representatieve resultaten van de celvrije residu-specifieke incorporatie van de Arg analoog kan, evenals de Lys analoge L-hydroxy-lysine (Hyl) worden gepresenteerd. De ander aminozuur oplossingen, de energiebuffer, de vector DNA dat codeert voor het modeleiwit en celvrij reacties worden bereid zoals boven beschreven. De verwijzing celvrije reactiemengsel is voorzien van de aminozuuroplossing bestaande uit de 20 CAAS. Voor elk experiment wordt een negatieve controle celvrije reactiemengsel geleverd met de aminozuursequentie oplossing die de canonieke analoog van de Ncaa betrokken mist. Voor elk ca.oach, een celvrije reactiemengsel drukt de model-eiwit in aanwezigheid van de aminozuuroplossing, waarbij de CAA wordt vervangen door de analoge noncanonical. His-tag zuivering, bufferuitwisseling en HPLC-ESI massaspectrometrische analyse worden uitgevoerd volgens de hierboven beschreven protocol. Het model eiwit het C-terminale His-tag deGFP 32, een afgeknotte versie van EGFP 53. Zijn één letter aminozuurvolgorde zijn te vinden in (Aanvullend materiaal 2). Dit model eiwit bevat 6 Arg en 18 Lys posities, respectievelijk. De expressie vector is pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Bij volledige omzetting van de Ncaa, kan men aannemen dat de negatieve controlereactie drukt geen deGFP, aangezien een van de 20 CAAS ontbreekt. Integendeel moet deGFP detecteerbaar in de andere twee reacties: de natieve een in de afbeeldrence celvrije reactie en de gewijzigde proteïne in de celvrije reactie die is voorzien van de NCAA. Figuur 1A toont de voorbereidende SDS-PAGE evaluatie van de Can incorporatie experiment. De verwijzing celvrije reactie heeft de hoogste deGFP expressie niveau. In het celvrije reactiemengsel dat is voorzien Can wordt deGFP uitgedrukt op iets lagere concentratie. Nr deGFP expressie kan worden gedetecteerd in de negatieve controle. Dit SDS-PAGE resultaat is een goede indicatie voor een succesvolle integratie van Can in het doeleiwit deGFP. Om de hypothese volledige integratie van kan bewijzen in deGFP, zowel gezuiverde model eiwitten, gevisualiseerd in figuur 1B, worden geanalyseerd door middel van HPLC-ESI massaspectroscopie. Figuur 1C toont de deconvoluted massaspectra van het gezuiverde deGFP moleculen. De deconvoluted massa van degF<html> P, dat wordt uitgedrukt in de referentie-cel-free reactie is 26,192.8 Da. Voor deGFP uitgedrukt in de Can met celvrije reactie een massa van 26202,5 ​​Da verschijnt. De verwachte massa&#39;s voor de inheemse deGFP6Arg en de gewijzigde deGFP6Can met Arg volledig worden vervangen door Can zijn 26.193 Da en 26.204 Da, respectievelijk. De massa verschil van 1,5 Da voor deGFP6Can is binnen de fout van het spectrum deconvolutie. Aldus wordt de volledige opname van Can in deGFP helemaal 6 Arg posities bevestigd. De twee pieken van verminderde intensiteit overeen met de inheemse deGFP6Arg en gewijzigde deGFP6Can die hun volwassen fluorofoor niet bereiken. De fluorofoor autokatalytische gegenereerd door het elimineren van een H 2 O molecuul, gevolgd door oxidatie. Dit leidt tot een massa verhoogd met 20 Da als dit proces niet verder. pg &quot;/&gt; Figuur 1. SDS-PAGE evaluatie van het experiment kan ingewerkt en HPLC-ESI massaspectroscopie van de celvrije expressie gebracht en gezuiverd deGFP moleculen. (A) Voorafgaande evaluatie van de Can ingewerkt experiment met behulp van SDS-PAGE. Van links naar rechts: Protein standaard referentie celvrije reactiemengsel, negatieve controle en celvrije reactiemengsel verschaffen Can plaats van Arg. (B) SDS-PAGE na His-tag zuivering en buffer uitwisseling van het tot expressie deGFP moleculen. Van links naar rechts: Eiwit standaard, gezuiverd deGFP van de referentie-reactie gezuiverd deGFP uit de Can bevatten reactie. (C) Bevestiging van de volledige integratie van Can door HPLC-ESI massaspectroscopie. De verwachte massa van de inheemse deGFP en de gewijzigde deGFP met Arg volledig vervangen door Can zijn 26.193 Da en 26.204 Da, respectievelijk. Elk spectrum wordt genormaliseerd naar de hoogste intensiteit (tellingen). Piekposities zijn aangegevenin Da. Voor visualisatie doeleinden worden de gel lanes geëxtraheerd uit de gel beelden, samengevoegd worden omgezet in grijsschaal formaat, wordt optimaal aangepaste en contrast en helderheid worden verbeterd. Original gel rijstroken worden gepresenteerd in Aanvullend materiaal 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Figuur 2A toont de voorbereidende SDS-PAGE evaluatie van de Hyl incorporatie experiment. In het celvrije reactiemengsel dat is voorzien Hyl, wordt deGFP uitgedrukt. Anders dan het eerste experiment kan een zwakke deGFP band worden waargenomen in de negatieve controlereactie. Dit zou het gevolg Lys residuen in het celvrije reacties. Dit maakt een flauwe deGFP uitdrukking in de negatieve controle reactie, waar noch Lys noch Hyl worden toegevoegd. Voor H<html> PLC-ESI massaspectroscopie, de deGFP moleculen van het celvrije reactiemengsel voorzien Hyl gezuiverd en de buffer wordt uitgewisseld (figuur 2B). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> Figuur 2. SDS-PAGE evaluatie van de Hyl incorporatie experiment (A) Van links naar rechts:. Negatieve controle celvrije reactiemengsel celvrije reactiemengsel bevattende Hyl en eiwitstandaard. (B) SDS-PAGE na His-tag zuivering en buffer uitwisseling van het tot expressie deGFP moleculen. Van links naar rechts: Gezuiverd deGFP uit de Hyl die reactie en eiwit standaard. Voor visualisatie doeleinden worden de gel lanes geëxtraheerd uit de gel beelden, samengevoegd worden omgezet in grijsschaal formaat, wordt optimaal aangepaste en contrast en helderheid worden verbeterd. Original gel rijstroken worden gepresenteerd in Aanvullend materiaal 3.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3 toont het massaspectrum van deconvoluted gezuiverd deGFP moleculen. Figuur 3A bevestigt de hypothese van reeds aanwezige Lys resten in het celvrije reacties. De overheersende piek van het spectrum komt overeen met de inheemse deGFP (verwachte massa: 26.193 Da). Opnieuw kan deGFP moleculen van een 20 Da grotere massa die hun fluorofoor ontwikkelden gedetecteerd. Lys resten worden bij voorkeur op de tRNA Lys geladen door lysyl-tRNA-synthetase leidt tot een hoog expressieniveau van het natieve deGFP18Lys. De massa verschil tussen Hyl en Lys is 16 Da. Door de aanwezigheid van Hyl dat concurreert met de Lys-resten mogelijk deGFP species worden gegenereerd (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (Figuur 3B). Toegegeven, de piek van deGFP1Hyl + 17Lys overlapt met de top van de natieve deGFP die haar fluorofoor (figuur 3A) en de massa van enkele toppen verschilt meer dan 2 Da van de verwachte massa produceerde. Deze massa verschillen kunnen worden toegeschreven aan hoge geluidsniveaus vanwege lage hoeveelheden van de deGFP species. Echter, Hyl gewoonlijk opgenomen door het celvrije systeem. Verdere verbeteringen moeten gebeuren Lys residuen schaffen in het celvrije reacties. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> . Figuur 3. HPLC-ESI massaspectroscopie van de gezuiverde deGFP moleculen van het celvrije reactiemengsel bevattende Hyl (A) de natieve deGFP18Lys wordt voornamelijk waargenomen (verwachte massa: met fluorofoor 26.193 Da, zonder rijpe fluorofoor 26.213 Da). (B)Vergroting onthult het bestaan ​​van alle mogelijke deGFP soorten (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). De verwachte massa is 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). Het spectrum wordt genormaliseerd naar de hoogste intensiteit (tellingen). Peak posities zijn aangegeven in Da. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> Aanvullend materiaal 1. Berekening template. In paragraaf 2, de voorbereiding van de energiebuffer master mix wordt geïllustreerd met behulp van ruw extract porties van 30 ui en optimale Mg- en K-glutamaat concentraties van respectievelijk 3 mm en een 30 mm. Dit voorbeeld leidt tot een master mix volume 3 energiebuffer porties oplevert. in sectie 3, is de voorbereiding van de cel-vrije reactie geïllustreerd met behulp van een 90 nM DNA-voorraad-oplossing die leidt tot een optimale vector DNA concentratie van 10 nM in de cel-vrije reactie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> Een passende traceerbaarheid, is het gebruik van de berekening matrijs geïllustreerd door insertie van deze typische waarden die afwijken van bovenstaand voorbeeld: Ruw extract volume: 28 pl, optimale Mg-glutamaat: 2 mM optimaal K-glutamaat: 40 mM, aantal van de gewenste buffer monsters: 100, optimale vector-concentratie in celvrije reactie: 8 nm, DNA-vector stock-oplossing: 150 nm. Voer eerst 28 pl als ruw extract volume in het oranje gebied van de eerste sjabloon sectie. Voer dan in het tweede sjabloon deel 2 mM eend 40 mM als optimale Mg- en K-glutamaat concentraties in de oranje velden. Rekening houdend met de optimale Mg- en K-concentraties de samenstelling een 15 ul energiebuffer, evenals een overeenkomstige, opgeschaald 16 pi aliquot wordt berekend. Hieronder daarom voer 100 als gewenste aantal energiebuffer monsters (16 pl). De template past de volumes van de verschillende bufferbestanddelen voor de 1700 pi master mix als volgt: 204 pl van 100 mM Mg-glutamaat voorraadoplossing, 136 gl 3 M K-glutamaat voorraadoplossing, 728,73 ui 14x energie oplossing, 510 ul van 40% PEG-8000 en 121,27 ul steriele DDH 2 O. Tenslotte, in de derde sjabloonsectie, voert 8 nM en 150 nM als vector optimale concentratie in het celvrije reactiemengsel respektievelijk vector DNA voorraadoplossing concentratie. De template past de volumes van de verschillende componenten die aan de 28 pl ruw extract worden toegevoegd aan de bereiding van een 90 pl rondencelvrije reactiemengsel als volgt: 15 pl energiebuffer, 15 ui van één van de 3 verschillend samengestelde aminozuuroplossingen, 4,80 ui vector DNA-oplossing (150 nM) en 27,20 uit steriel DDH 2 O. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> Aanvullend materiaal 2. Een brief aminozuurvolgorde van het model eiwit deGFP. Dit model eiwit bevat 6 Arg en 18 Lys posities. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> Aanvullend materiaal 3. Volledige lengte en ongemodificeerde gel lanen die corresponderen met de gel afbeeldingen weergegeven figuur 1 en 2. De lanen gel die in elk afzonderlijk s<html> ubfigure worden uit dezelfde SDS polyacrylamidegel. In figuur 1 en 2 deze lanen werden samengevoegd voor presentatiedoeleinden. Molecuulgewichten van de eiwitstandaard banden zijn weergegeven naast de figuren. (A.1) Uncropped gel rijstroken van figuur 1A. Van links naar rechts: Protein standaard referentie celvrije reactiemengsel, negatieve controle en celvrije reactiemengsel verschaffen Can plaats van Arg. (A.2) Uncropped gel rijstroken van figuur 1B. Van links naar rechts: Eiwit standaard, gezuiverd deGFP van de referentie-reactie gezuiverd deGFP uit de Can bevatten reactie. (B.1) Uncropped gel rijstroken van figuur 2A. Van links naar rechts: Negatieve controle celvrije reactiemengsel celvrije reactiemengsel bevattende Hyl en eiwitstandaard. (B.2) Uncropped gel rijstroken van figuur 2B. Van links naar rechts: Gezuiverd deGFP uit de Hyl die reactie en eiwit standaard.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een gebruiksvriendelijk, celvrij expressieprotocol voor de residurespecifieke incorporatie van niet-canonieke aminozuuranalogen in eiwitten, inclusief downstream-analyse, wordt gepresenteerd voor medisch, farmaceutisch, structureel en functioneel onderzoek.

Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cell-free transcriptie-vertaalsysteem

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Het algemene doel van deze procedure is om residuspecifiek niet-canonieke aminozuuranaloog in modelproteïnen in te bouwen met behulp van een celvrij expressiesysteem en om een downstream analyse uit te voeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de medisch-farmaceutische en structurele biologie, zoals die over niet-canonieke aminozuren in de proteïnestructuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat toxische aminozuren in modelproteïnen kunnen worden ingebouwd in de afwezigheid van een levende gastheer. Begin het experiment met volledige voorraadoplossingen van de 20 canonieke aminozuren, of CAAs, en de eerder bereide niet-canonieke aminozuurvoorraadoplossing, of ncAA, op kamertemperatuur. Zodra de oplossingen ontdooid zijn, moeten ze regelmatig worden gevortexd om neergeslagen aminozuren opnieuw op te lossen, waarna de aminozuren op ijs worden geplaatst. Breng vervolgens 1,4 milliliter steriel dubbel gedestilleerd water over in een centrifugebuis van 15 milliliter en plaats deze op ijs. Voeg 175 microliter van elke aminozuurvoorraadoplossing na elkaar toe, vortex de buis na elke toevoeging grondig en plaats de oplossing terug op ijs. Na toevoeging van alle aminozuren moet de buis grondig worden gevortexd. Incubeer de buis totdat de oplossing zo helder mogelijk is. Verdeel de aminozuur mastermix-oplossing in drie gelijke volumes van 1,35 milliliter in reactiebuisjes van 1,5 ml en houd deze op ijs. Voeg 50 microliter van de 168 millimolaire voorraadoplossing van de CAA die analoog is aan de ncAA toe aan het eerste verdeelde volume, om de aminozuuroplossing te maken die alle 20 CAAs bevat. Vortex de oplossing grondig en plaats de buis vervolgens terug op ijs. Aliquoteer de oplossing in reactiebuisjes en label deze als plus CAA. Bevries de aliquoten snel in vloeibare stikstof en bewaar ze bij minus 80 graden Celsius. Voeg vervolgens 50 microliter steriel dubbel gedestilleerd water toe aan het tweede verdeelde volume aminozuur mastermix om een aminozuurmengsel te bereiden dat 19 CAAs bevat, vortex de oplossing grondig en plaats deze op ijs. Aliquoteer de oplossing en label de buisjes als minus CAA. Voeg ten slotte 50 microliter van de 168 millimolaire voorraadoplossing van de ncAA toe aan de laatste 1,35 milliliter, om een aminozuurmengsel te bereiden dat 19 CAAs en de ncAA bevat. Vortex het mengsel grondig en plaats het terug op ijs. Aliquoteer, label en bevries de buisjes. Ontdooi op ijs drie aliquoten van 30 microliter ruw extract (één plus CAA-aliquot, één minus CAA-aliquot en één ncAA-aliquot), drie aliquoten energierbuffer en de vector-DNA-oplossing. Plaats steriel dubbel gedestilleerd water op ijs. Voeg vervolgens 15 microliter energiebuffer toe, pipetteer dit op en neer en vortex de oplossing voorzichtig om te mengen. Voeg 15 microliter van de plus CAA-aminozuuroplossing aliquot, 10 microliter van 90 nanomolaire vector-DNA-oplossing en 20 microliter steriel dubbel gedestilleerd water toe aan de 30 microliter ruw extract. Stel de negatieve controle in door 15 microliter energiebuffer, 15 microliter minus CAA, 10 microliter 90 nanomolaire vector-DNA-oplossing en 20 microliter steriel dubbel gedestilleerd water toe te voegen aan de 30 microliter ruw extract. Voer de ncAA-reactie uit door 15 microliter energiebuffer, 15 microliter plus ncAA, 10 microliter 90 nanomolaire vector-DNA-oplossing en 20 microliter steriel dubbel gedestilleerd water te combineren met de 30 microliter ruw extract. Incubeer vervolgens al deze buisjes. Verdun 10 minuten voor het uitvoeren van de SDS-PAGE één microliter van elke viskeuze celvrije reactie in vier microliter steriel dubbel gedestilleerd water in reactiebuisjes. Vortex grondig en centrifugeer de vloeistoffen kort met een minicentrifuge. Voeg vijf microliter 2X loading buffer toe aan de vijf microliter verdunde celvrije reactie. Vortex grondig en centrifugeer de vloeistoffen met een minicentrifuge. Plaats de reactiebuisjes in een warmteblok en zorg ervoor dat de doppen goed gesloten zijn. Breng ondertussen de running buffer over in de gelelektroforesekamer. Na verhitting moeten de vloeistoffen worden gecentrifugeerd met een minicentrifuge. Na het centrifugeren moeten de buisjes kort worden gevortexd en het centrifugeren worden herhaald. Breng 15 microliter proteïnestandaard en 10 microliter van elk monster over in de wells en start de elektroforese. Haal de gel voorzichtig uit de cassette en fixeer de gel gedurende 30 minuten. Breng de gel vervolgens 60 minuten over in kleuringsoplossing. Na het kleuren moet de gel 60 tot 120 minuten in ontkleuringsoplossing worden geplaatst. Meng gelijke volumes his-bindingsbuffer en de celvrije reactie, en pipetteer het mengsel op en neer. Vortex vervolgens voorzichtig de buis. Zet daarna het kolomsysteem in elkaar. Vortex de voorraadoplossing van de his-affiniteitsgel grondig totdat de gelhars volledig is opgelost. Breng met een pipetteertip van één milliliter 250 microliter gelhars over in de kolom. Centrifugeer de kolom gedurende vijf tot 10 seconden bij 13 tot 15 000 ×g. Zorg ervoor dat de gelhars volledig is uitgelopen en breng vervolgens 150 tot 300 microliter van het mengsel van de celvrije reactie en his-bindingsbuffer over naar de kolom. Centrifugeer de kolom. Gooi de flow-through weg en plaats de kolom terug in de opvangbuis. Voeg 250 microliter his-wasbuffer toe en tik en vortex de kolom voorzichtig om de gelhars opnieuw te suspenderen. Centrifugeer de kolombuis. Gooi de opvangbuis weg en plaats de kolom in een nieuwe standaard reactiebuis van 1,5 milliliter. Voeg 150 microliter elutiebuffer toe en suspendeer de gelhars opnieuw door te tikken en voorzichtig te vortexen. Centrifugeer vervolgens de kolom om het gezuiverde proteïne in de elutiebuffer te verdunnen. Verwijder eerst de bodemdop van de gelfiltratie-spincolumn en verwijder dan de bovendop. Plaats de kolom in een wasbuis van twee milliliter en centrifugeer de kolom om de gelbewaarbuffer te verwijderen. Gooi de flow-through weg, voeg vervolgens tot 400 microliter proteïnebewaarbuffer toe en centrifugeer de kolom. Herhaal deze stap één keer, zodat de volledige proteïnebewaarbuffer in de gel is geladen. Plaats de kolom in een schone opvangbuis en voeg voorzichtig tot 100 microliter van de oplossing van het gezuiverde modelproteïne direct op het midden van het gelbed toe. Centrifugeer de kolom. Na de bufferuitwisseling wordt de volledige 100 microliter modelproteïne-oplossing in een open buis in de roterende vacuümconcentrator geplaatst. Sluit het deksel van de concentrator en start de rotatie bij 30 graden Celsius. Deze SDS-PAGE toont de succesvolle inbouw van L-canavanine, of Can, in het doeleiwit deGFP, waarbij de referentie celvrije reactie het hoogste deGFP-expressieniveau heeft. De celvrije Can-reactie levert een iets lagere deGFP-concentratie op, terwijl er geen deGFP-expressie wordt gedetecteerd in de negatieve controle. Er werd een SDS-PAGE uitgevoerd na his-tag purificatie en bufferuitwisseling van de tot expressie gebrachte deGFP-moleculen. HPLC

residue-specific-incorporation-noncanonical-amino-acids-into-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier presenteren we chimera assemblage door plasmideherstel en restrictie-enzymplaatsinzending (CAPRRESI), een protocol gebaseerd op de invoeging van restrictie-enzymplaatsen in synoniem-DNA-sequenties en functioneel plasmideherstel. Dit protocol is een snelle en goedkope methode voor het smelten van proteïne-coderende genen.

CAPRRESI: Chimera Assembly Door Plasmide Recovery En Restriction Enzyme Site Insertion

Biochemische en structurele analyses van geglycosyleerde eiwitten vereist relatief grote hoeveelheden van homogene monsters. Hier presenteren we een efficiënte chemische methode voor site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten gezuiverd van bacteriën door zich te richten van reactieve Cys thiolen.

Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten

Synthetische biologie waardoor de engineering van eiwitten met ongekende eigenschappen met behulp van het co-translational inbrengen van niet-canonieke aminozuren. Hier, presenteerden we hoe een spectraal rood-verschoven variant van een GFP-type fluorophore met roman fluorescentie spectroscopische eigenschappen, genoemd "goud" fluorescent proteïne (GdFP), wordt geproduceerd in E. coli via selectieve druk opneming (SPI).

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Uitbreiding van de genetische code dient als een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van een breed scala aan biologische processen, met inbegrip van eiwit acetylation. Hier tonen we een facile protocol misbruiken van deze techniek voor het genereren van homogeen geacetyleerd eiwitten op specifieke sites in Escherichia coli cellen.

Een Facile Protocol voor het genereren van Site-Specifically geacetyleerd eiwitten in Escherichia Coli

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Het protocol stelt de Escherichia coli-selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in het lactococcal antimicrobiële peptide nisine gebaseerd. De eigenschappen kunnen worden gewijzigd tijdens de recombinante expressie via substitutie met de gewenste ncAAs in de gedefinieerde groei media. Resulterende mutaties in de topicale worden toegewezen door groei remming testen en fluorescentie microscopie.

Antimicrobiële peptiden geproduceerd door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren

De endonucleases van de beperking met nieuwe opeenvolgingsspecificiteit kunnen van enzymen worden ontwikkeld die een gedeeltelijk gedegenereerde opeenvolging erkennen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat we met succes gebruikt om de volgorde specificiteit van NlaIV enzym te veranderen. De belangrijkste ingrediënten van het protocol zijn de in vitro compartimentering van de transcriptie/vertaalreactie en selectie van varianten met nieuwe sequentiespecifiekekenmerken.

In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

Hier presenteren we een methode om geacetyleerde histoneiwitten uit te drukken met behulp van genetische code-uitbreiding en gereconstitueerde nucleosomen in vitro te assembleren.

Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli

Om de beperkingen van klassieke site-directed mutagenese te overwinnen, werden proline analogen met specifieke modificaties opgenomen in verschillende fluorescerende eiwitten. We laten zien hoe de vervanging van waterstof door fluor of van de enkele door dubbele bindingen in prolineresiduen ("moleculaire chirurgie") fundamentele eiwiteigenschappen beïnvloedt, inclusief hun vouwing en interactie met licht.

Residu-specifieke uitwisseling van Proline door Proline-analogen in fluorescerende eiwitten: hoe "moleculaire chirurgie" van de ruggengraat de vouwing en stabiliteit beïnvloedt

Dit protocol beschrijft de omgekeerde emulsiemethode die wordt gebruikt om een celvrije expressie (CFE) -systeem in te kapselen in een gigantisch unilamellair blaasje (GUV) voor het onderzoek naar de synthese en incorporatie van een modelmembraaneiwit in de lipidedubbellaag.

Reconstitutie van het bacteriële glutamaatreceptorkanaal door inkapseling van een celvrij expressiesysteem

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Leer residu-specifieke opneming van noncanonieke aminozuren in eiwitten met een Escherichia coli cell-free systeem. Deze methode ondersteunt onderzoek naar eiwitstructuur en functie.

Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een Escherichia coli Cell-free transcriptie-vertaalsysteem (Video) | JoVE Journal

Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een

Meer video's verkennen