Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Het algemene doel van dit experiment is om menselijke pluripotente stamcellen met een hoge efficiëntie en reproduceerbaarheid te differentiëren tot cardiomyocyten. Dit protocol kan worden opgeschaald in een bioreactor of worden aangepast voor het differentiëren van cellijnen die gevoelig zijn voor enkelcelkweek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de modellering van hartaandoeningen met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen.

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze kosteneffectief is en een hoge efficiëntie, reproduceerbaarheid en toepasbaarheid heeft voor zowel humane embryonale als geïnduceerde pluripotente stamcellen. Onze demonstrator vandaag is Hananeh Fonoudi, momenteel promovendus aan het Victor Chang Cardiac Research Institute, afkomstig van het Royan Institute. Gebruik vóór het coaten een schoonmaakborstel en gedestilleerd water om al het stof of cultuurresidu grondig te verwijderen uit een 100 milliliter spinner flask met een glazen pendel.

Vul de kolf vervolgens met 70% ethanol. Spoel de kolf na 30 minuten af met gedestilleerd water en vul deze met vijf molair natriumhydroxide. Spoel de kolf de volgende ochtend vijf minuten onder stromend water af en vul deze met één molair zoutzuur.

Spoel de kolf na 15 minuten nog vijf minuten onder stromend water, gevolgd door twee spoelingen met dubbel gedestilleerd water. Plaats de kolf in een veiligheidskabinet om te drogen. Voeg vervolgens 1,5 milliliters siliconiseringsoplossing toe aan de kolf en roteer de kolf horizontaal om alle oppervlakken met silicon te bedekken.

Verwarm de gecoate kolf gedurende één uur bij 100 °C in een droogoven. Wanneer de kolf is afgekoeld, spoelt u deze drie keer gedurende 15 minuten met gedeïoniseerd water. Steriliseer de container vervolgens in een autoclaaf bij 121 °C gedurende 20 minuten.

Nadat ongedifferentieerde sferoïden minimaal drie keer zijn gepasseerd met de methode voor passage van enkelvoudige cellen, wordt een pipet van vijf milliliter gebruikt om alle ongedifferentieerde sferoïden over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter. Spoel de putjes met één milliliter medium voor humane embryonale stamcellen om eventuele resterende sferoïden te verzamelen en voeg dit spoelmiddel samen met de geoogste sferoïden. Laat de sferoïden vijf minuten bezinken tot er een los pellet is gevormd.

Aspireer vervolgens het supernatant, waarbij u erop let geen sferoïden te verwijderen. Spoel daarna de sferoïden gedurende vijf minuten met één milliliter PBS en incubeer ze in 5 milliliter Trypsin EDTA bij 37 °C. Stop na vier tot vijf minuten de reactie met één milliliter medium voor humane embryonale stamcellen en gebruik een P1000-pipet om de sferoïden te dissociëren tot een enkelcellige suspensie.

Nadat de cellen zijn geteld via trypaanblauw-exclusie, worden de cellen geresuspendeerd op een concentratie van 200.000 cellen per milliliter in geconditioneerd medium aangevuld met basale fibroblastengroeifactor en ROCK-remmer, waarna 100 milliliter van de celsuspensie wordt overgebracht naar de gesiliconiseerde bioreactorfles. Plaats de fles op de agitator bij 35 RPM. Verhoog na 24 uur de agitatie naar 40 RPM.

Stop na 48 uur het schudden gedurende vijf tot tien minuten totdat alle hervormde sferoïden naar de bodem van de kolf zijn gezakt, en vervang de helft van het medium door geconditioneerd medium aangevuld met basic fibroblast growth factor. Start vervolgens de agitator opnieuw op 40 RPM voor nog eens 24 uur, waarbij de helft van het medium de komende drie dagen dagelijks via hetzelfde proces wordt vervangen. Stop op dag vijf de agitator gedurende vijf tot tien minuten.

Breng vervolgens alle sferoïden over naar een buis van 50 milliliter met 50 milliliter of minder medium. Verwijder het overgebleven medium uit de kolf, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen sferoïden in het vat achterblijven. Verwijder daarna voorzichtig het supernatant van de bezonken sferoïden en was de celclusters in 25 milliliter PBS met calcium en magnesium.

Verwijder na vijf tot tien minuten het wasmiddel en resuspendeer de sferoïden in 40 milliliter RPMI-B27-medium aangevuld met glycogen synthase kinase-3-remmer, ROCK-remmer en polyvinylalcohol. Breng alle sferoïden terug naar de bioreactorfles. Voeg vervolgens vers RPMI-B27-medium toe tot een totaalvolume van 100 milliliter en start de agitatie opnieuw bij 40 RPM.

Volg na 24 uur hetzelfde proces om het medium te vervangen door RPMI-B27 medium. Volg na nog eens 24 uur hetzelfde proces en vervang het medium door RPMI-B27 plus IWP2, purmorphamine en SB43. Laat dit 48 uur staan.

Het eerste kloppen wordt gewoonlijk na zeven dagen waargenomen. Voor de snelle differentiatie van humane pluripotente stamcellijnen die niet zijn aangepast aan enkelcelkweek, wordt een 70 tot 80% confluente humane pluripotente stamcelkweek, gegroeid op embryonale fibroblastcellen van muis, eerst gedurende 30 tot 60 seconden behandeld met 5 milliliter dissociatie-oplossing. De dissociatie-oplossing mag alleen blijven staan tot de MEF's rond worden en de randen van de hPSC-kolonies duidelijk zichtbaar worden.

Als de cellen te lang worden gelaten, zullen ze niet correct differentiëren. Vervang op het juiste tijdstip snel de dissociatie-oplossing door 75 milliliters collagenase type IV en incubeer de cellen gedurende vijf tot 15 minuten bij 37 °C, waarbij de cultuur elke paar minuten onder de microscoop wordt gecontroleerd. Wanneer hele kolonies beginnen los te laten, vervang dan de collagenase door 1,5 milliliters medium voor menselijke embryonale stamcellen en gebruik een P1000-pipet om voorzichtig hele celkolonies van de bodem van de plaat los te maken.

Cellen moeten voorzichtig worden losgemaakt, zodat de koloniën niet in kleine stukjes uiteenvallen. Gebruik vervolgens een pipette van 5 ml om de cellen over te brengen naar een conische buis van 15 ml en was de wells met 1 ml menselijk embryonaal stamcelmedium, waarbij eventuele resterende cellen in de 15 ml buis worden verzameld. Na vijf minuten sedimentatie wordt het supernatant voorzichtig vervangen door 2 ml vers menselijk embryonaal stamcelmedium aangevuld met basic fibroblast growth factor.

Hanteer een nieuwe pipette van 5 mL om de cellen over te brengen naar een ultra-low attachment plaat en incubeer de kolonies gedurende 6 tot 12 uur. Gebruik aan het einde van de incubatie een pipette van 5 mL om de kolonieaggregaten voorzichtig over te brengen naar een nieuwe buis van 15 mL en verzamel eventuele resterende aggregaten met een spoeling van RPMI-B27 medium. Zodra de kolonies zijn bezonken, wordt het supernatant vervangen door vers RPMI-B27 medium aangevuld met een glycogen synthase kinase-3 remmer, waarna de kolonies voorzichtig worden overgebracht naar laminine-gecoate platen voor adhesie bij 37 °C.

Vervang na 24 uur het medium door RPMI-B27 medium. Vervang na nogmaals 24 uur het medium door RPMI-B27 met IWP2, purmorfamine en SB43. De eerste hartslag is gewoonlijk na zeven dagen waarneembaar.

Tot nu toe is het statische suspensiedifferentiatieprotocol getest op vijf menselijke embryonale stamcellijnen en vier menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellijnen, wat resulteerde in meer dan 90% kloppende sferoïden per lijn, wat de hoge reproduceerbaarheid van dit protocol tussen verschillende menselijke pluripotente stamcellijnen aantoont. De differentiërende sferoïden vertonen in een geroerde suspensiebioreactoromgeving een vergelijkbaar gedrag als in het statische systeem, waarbij ongeveer 100% van de sferoïden op dag 10 werd waargenomen als kloppend. Inderdaad onthullen coupes van kloppende sferoïden, verzameld op dag 30, respectievelijk de cytoplasmatische en nucleaire expressie van cardiaal troponine T en de cardiale transcriptiefactor NKX2.5.

Verder, wanneer ongedifferentieerde sferoïden worden vervangen door ongedifferentieerde celaggregaten, verschijnen er zeven dagen na differentiatie kloppende clusters. Met 42 geteste humane geïnduceerde pluripotente stamcellijnen werden tegen dag 15 gemiddeld populaties van meer dan 60% cardiac troponin T-positieve cellen gegenereerd. De kloppende clusters vertonen tevens een vergelijkbare cytoplasmatische expressie van cardiac troponin T en nucleaire expressie van NKX2.5 als waargenomen bij de sferoïden die in de stirred suspension bioreactor zijn gegenereerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om hPSCs te gebruiken die gedurende ten minste drie passages voorafgaand aan de differentiatie in de bioreactor zijn aangepast aan enkeltcellcultuur. Deze procedure kan worden gecombineerd met andere methoden voor het verrijken van cardiomyocyten om een zuivere populatie cellen te verkrijgen. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor de commercialisering van uit hPSC's afgeleide cardiomyocyten.

Het heeft potentie voor gebruik in klinische, farmaceutische toepassingen, weefselengineering en de ontwikkeling van organen of organoïden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe menselijke pluripotente stamcellen efficiënt kunnen worden gedifferentieerd tot cardiomyocyten en hoe de kweek in een bioreactor kan worden opgeschaald.