Name: In Vitro Permeatie van FITC-geladen Ferritins Across een Rat bloed-hersenbarrière: een model om de Levering van Nanoformulated Molecules Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Leer een gevalideerd in vitro model van de bloed-hersenbarrière met rat hersenmicrovasculaire endotheelcellen en astrocyten. Deze methode toont aan dat ferritine nanokooien de permeatie van FITC-gekapselde moleculen aanzienlijk verbeteren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken Assessorato alla Sanità, Regione Lombardia en Sacco Hospital (NanoMeDia Project) voor de financiering van het onderzoek.

1. Vaststelling van de BBB Model Opmerking: Voor de vaststelling van de BBB-model dat we raden u aan in de handel verkrijgbare primaire RBMECs en RCA. Alle stappen moeten worden uitgevoerd met steriele reagentia en disposables, behandeld in een laminaire stroming kap. <ol><li> Cel cultuur <ol><li> Coat celkweekkolven met poly-L-lysine 100 ug / ml (1 uur bij KT) of fibronectine 50 ug / ml (1 uur bij 37 ° C) naar de verbinding van RCA of RBMECs bevorderen, respectievelijk. Vervolgens dooi 1 x 10 6 RCA en 5 x 10 5 RBMECs in endotheelcellen Medium, aangevuld met 5% foetaal runderserum, 1% endothele celgroei toeslag en 1% penicilline / streptomycine (SECM). Zaad RCA in een T175 kolf in 20 ml SECM en RBMECs in een T75 kolf in 10 ml SECM. Opmerking: Het ontdooien en zaaien passages van RCA en RBMECs moeten worden aangepast in termen van celdichtheid en tijd in kweek, volgens het aantal experimentele condities te testen met de BBB model. door starting met 1 flacon 1 x 10 6 RCA en 1 flesje van 5 x 10 5 RBMECs, kan men verkrijgen tot 20 BBB-dragende inserts. </li><li> Handhaaf de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige atmosfeer gedurende ongeveer 6 dagen, tot ongeveer 80% confluentie voor RCA en meer dan 90% confluentie voor RBMECs. Los cellen met behulp van trypsine-EDTA-oplossing (trypsine 1: 250) gedurende 5 minuten (1 ml trypsine T75 flessen en 2 ml voor T175 kolven). Stop trypsine activiteit SECM (2: 1), centrifuge celsuspensies bij 750 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellets in 60 ml SECM. </li><li> Splits de RBMECs in 3 T175 kolven en cultuur in SECM voor nog eens 3 dagen voor het zaaien op inserts. Tel het totale aantal levende RCA, door het observeren van een celsuspensie verdund 1: 1 met trypan blauw onder een optische microscoop in een Burker kamer. </li></ol></li><li> Cel zaaien op Inserts <ol><li> Behandel een zijde van de polyethyleen tereftalaat (PET) membraan van 6 multiwell-tranent inzetstukken met poly-L-lysine 100 ug / ml en de andere kant met fibronectine 50 ug / ml, bij bevestiging van RCA en BMECs mogelijk. Behandel de inzetstukken met een pincet om contact met de PET-membraan te voorkomen. <ol><li> Plaats de inserts in een plaat met 6 putjes en voeg fibronectine-oplossing (minimum 500 ui) in de bovenste kamer. Na 1 uur incubatie bij 37 ° C, verwijder de fibronectine oplossing, neemt de inzetstukken van de multiwell-plaat en zet ze ondersteboven op de bodem van een 150 cm2 petrischaal, die hier wordt gebruikt als een steriele drager voor de al gecoate wisselplaten. </li><li> Voorzichtig voeg 800 pl poly-L-lysine op de onderzijde van het inzetstuk (zie figuur 1A, genoemd zaaien RCA), en houdt de oplossing op de inzetstukken voor 1 uur bij KT. </li><li> Verstuif de oplossing en laat de inserts drogen bij kamertemperatuur gedurende 15-30 min. De inzetstukken zijn nu klaar voor zaaien van cellen, maar kan ook worden opgeslagen in de multi-well plaat een aantaldagen bij 4 ° C, alvorens de BBB-constructie. Opmerking: Probeer tenminste 3 beklede inserts vrij te houden van cellen, worden gebruikt als controles om BBB inrichting valideren door FD40 fluxmetingen. </li></ol></li><li> Zaad RCA (35.000 / cm2) op de onderzijde van de poly-L-lysine beklede inserts, druppelsgewijs 800 gl celsuspensie op de omgekeerde insert (Figuur 1A). Laat de RCA vering van de inzetstukken voor 4 uur bij KT, om efficiënte hechting van de cellen aan het membraan mogelijk. </li><li> Zuig de residuele oplossing, plaats de inserts in putjes die 2 ml SECM en onderhouden van de multiwell-plaat bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige atmosfeer, verandert de SECM elke 2 dagen. </li><li> Na 3 dagen, als de RCA hebben bekleed de onderkant van het inzetstuk, zaad RBMECs op de bovenzijde van het inzetstuk, de volgende stappen: <ol><li> Maak RBMECs van T175 kolven en tel hettotale levende cellen, zoals in stappen 1.1.2 en 1.1.3. </li><li> Zaad RBMECs (60.000 / cm 2) op het bovenoppervlak van het inzetstuk in SECM (1000 pl) (Figuur 1B), waardoor 3 inzetstukken met alleen de astrocyten voor gebruik als TEER achtergrond. Plaats de plaat met meerdere holtes in standaard kweekomstandigheden. De systeem-cultuur gedurende ten minste 3 dagen, veranderen de SECM in de binnen en onderkamer elke 2 dagen. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. BBB Validation <ol><li> TEER Measurement <ol><li> Op de 3e dag van co-cultuur, check de TEER door het invoegen van de BBB-dragende inserts in een geschikte kamer (dat heeft een pet en waar zowel de kamer en de dop bevatten een paar voltage-sensing en stroomelektrodes), gevuld met 4 ml SECM. Verbinding maken met een epitheelweefsel volt / ohmmeter. </li><li> Samen met de TEER afmetingen van de cel BBB-systemen, noteer de TEER waarden van de 3 inserts met het RCA thop zal worden afgetrokken van de waarden verkregen met de BBBs. Vermenigvuldig het resulterende TEER waarden door het oppervlak van het inzetstuk (4,2 cm2) om de resultaten Ω cm x 2 drukken. </li><li> Vanuit de 3e dag van co-cultuur, het meten van de TEER elke dag. Opmerking: Na een eerste periode waarin de TEER toeneemt, moet de geregistreerde waarden stabiel gedurende ten minste twee opeenvolgende dagen (meestal tussen de 5e en de 7e dag van co-kweek). Op dat punt is de BBB is klaar voor de tweede stap van de validatie (paragraaf 2.2) en / of voor de trans-BBB experimenten. Opmerking: de in paragraaf 2.1 beschreven procedure kan worden uitgevoerd op dezelfde BBB-systemen gewijd aan de volgende permeabiliteit experimenten (deel 3). Werken onder steriele omstandigheden. </li></ol></li><li> Trans-BBB Flux van FITC-dextran 40 (FD40) <ol><li> Meet de FD40 flux van de bovenste naar de onderste kamer van de BBB modellen vergeleken met die over 3 lege inserts(Zie de opmerking van paragraaf 1.2.1) volgens de volgende stappen: <ol><li> Voeg 1 mg / ml FD40 (verdund in SECM) in het bovenste compartiment van de BBBs, en na 1, 2 en 3 uur trekken 200 gl SECM van de onderste kamer en meet de fluorescentie-intensiteit van spectrofluorimeter (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, spleet 5). </li><li> Haal de waarden voor SECM achtergrond fluorescenceby van 500 ul maagd medium met dezelfde analytische parameters. Trek de SECM achtergrond fluorescentie van alle FD40 fluorescentie waarden. </li><li> Bepaal de hoeveelheid doordrongen FD40 ten opzichte van de waargenomen fluorescentie waarden met een ijkkromme bereid met bekende concentraties (bijv. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 ug / ml) van de fluorescerende tracer opgelost in 500 pl SECM. </li><li> Bereken de schijnbare permeabiliteit coëfficiënt (P app) vanaf het gemiddelde flux waarden op: P app = J / AC <br/&gt; Waarin J de flux van het molecuul (mol / sec), A is de permeatie gebied (cm2) en C is de concentratie van het molecuul in het bovenste compartiment (mol / cm 3). Opmerking: Drie of meer BBB-systemen die geschikt zijn TEER waarden hebben bereikt, mogen uitsluitend worden besteed aan deze validatie procedure, en mag niet worden gebruikt voor de volgende permeabiliteit experimenten (deel 3). Steriliteit is niet verplicht. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Trans-BBB Permeatie van FITC-loaded Ferritins (FNN) Opmerking: Een recombinant variant van humaan ferritine (Fn), geproduceerd in Escherichia coli en geassembleerd in nanocages (FNN) voor het inkapselen van verschillende fluorescerende moleculen, is verkrijgbaar bij de NanoBioLab van Prof. Prosperi (Universiteit van Milaan-Bicocca, Italië). FNN worden geladen met FITC volgens een eerder beschreven protocol 13 en de concentraties van zowel Fn en de geladen moleculen nauwkeurig determined. <ol><li> Trans-BBB Flux van FITC en FITC-FNN <ol><li> Meet de FITC-FNN flux van de bovenste naar de onderste kamer van gevalideerde BBB modellen (meestal op de 5e - 7e dag van co-kweek), vergeleken met die van de vrije kleurstof na 7 en 24 uur incubatie, volgens de volgende stappen: <ol><li> Add FITC-FNN (50 ug / ml FNN, 1,1 uM FITC) of een gelijke hoeveelheid vrije FITC in de bovenste kamer van ten minste 6 BBB systemen voor elke formulering, om 2 ml SECM oplossing onttrekken aan de onderste kamer van tenminste 3 inserts na 7 uur, en de onderste kamer van andere inzetstukken 3 na 24 uur. </li><li> Meet de fluorescentie-intensiteit van 500 pl van de verzamelde monsters van spectrofluorimeter (λ ex 488 nm, em 515 nm λ, spleet 5). </li><li> Het verkrijgen van de SECM achtergrond fluorescentie door het meten van 500 ul van medium met dezelfde analytische parameters. Trek de SECM achtergrond fluorescentieuit alle FITC of FITC-FNN fluorescentie waarden. </li><li> Bepaal de concentratie van gepermeëerde of FITC FITC-FNN door vergelijking van de verkregen fluorescentiewaarden met twee verschillende kalibratiecurven gemaakt met bekende concentraties (bijv. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) van de vrije of nanoformulated kleurstof opgelost in 500 pi SECM. </li></ol></li></ol></li><li> FITC-FNN Localization in RBMECs <ol><li> Verwijderen SECM uit de bovenste kamer van de BBB systemen, was de inzetstukken met PBS en bevestig de RBMECs op tenminste twee inzetstukken per proefgroep door toevoeging van 500 pi paraformaldehyde (4% in fosfaatbuffer zoutoplossing-PBS) in het bovenste compartiment 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Was de inzetstukken driemaal met PBS om resten te verwijderen paraformaldehyde. Opmerking: Vanaf dit punt, steriliteit niet nodig. </li><li> Snij geschikte stukken van de PET-membraan, en ga verder met de immunodecoration van de cellen volgens de volgende stappen: <ol><li> Permeabilize RBMECs met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten. Voer een blokkeringsstap gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een oplossing die 2% runderserumalbumine (BSA), 2% geit serum in PBS. Incubeer de monsters met een anti-Von Willebrand factor (VWF) aan 1:20 verdunning gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Na driemaal wassen met PBS, blootstellen van de cellen gedurende 2 uur bij KT een 2% BSA, 2% geitenserum oplossing die een geschikt secundair antilichaam bij een 1: 300 verdunning om de anti-VWR en DAPI een onthullen 1: 1500 verdunning voor kernen detectie. </li></ol></li><li> Monteer de inzetstukken op microscoop dia&#39;s met behulp van een antifade montage-oplossing (een druppel per insert fragment), sluit het monster met een deksel slip. Analyseer door confocale microscopie met behulp van een olie-immersie lens op 40x vergroting, 1,5 zoom en 1024 x 1024 pixels resolutie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+compounds+that+cross+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier.</a> BMC Neurol. 9 (1), 3(2009).</li>
<li>Löscher, W., Potschka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+brain+disease+and+the+role+of+efflux+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).</li>
<li>Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theranostic+quantum+dots+for+crossing+blood-brain+barrier+in+vitro+and+providing+therapy+of+HIV-associated+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy.</a> Front Pharmacol. 15 (4), 140(2013).</li>
<li>Masserini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+for+Brain+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles for Brain Drug Delivery.</a> ISRN Biochem. , (2013).</li>
<li>Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+nanomedicines+for+neuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Towards nanomedicines for neuroAIDS.</a> Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+central+nervous+system+by+polymeric+nanoparticles%3A+What+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliver.+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know.</a> Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).</li>
<li>Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritins%3A+a+family+of+molecules+for+iron+storage%2C+antioxidation+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).</li>
<li>Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+denaturation%2Frenaturation-based+production+process+for+ferritin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles.</a> Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).</li>
<li>Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+on+endothelium+of+brain+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries.</a> Nature. 312, 162-163 (1984).</li>
<li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+physiology%2C+pathology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp.+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).</li>
<li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li>
<li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells.</a> J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).</li>
<li>Fiandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoformulation+of+antiretroviral+drugs+enhances+their+penetration+across+the+blood+brain+barrier+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice.</a> Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).</li>
<li>Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting-up+an+in+vitro+model+of+rat+blood-brain+barrier+%28BBB%29%3A+a+focus+on+BBB+impermeability+and+receptor-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport.</a> J. Vis. Exp. , e51278(2014).</li>
<li>Perrière, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+in+vitro+model+of+rat+blood-brain+barrier+for+molecular+analysis+of+efflux+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters.</a> Brain Res. 1150, 1-13 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De in vitro werkwijze beschreven een nuttig gevalideerd benadering van de trans-BBB levering van fluorescerende moleculen bij nanoformulation met nanodeeltjes bestuderen. Hier gebruiken we FNN, die een goede kandidaat voor de translocatie van lading moleculen over de BBB bestuderen vertegenwoordigt. FNN wordt beschouwd als de gouden nanovector voor trans-BBB afgifte van geneesmiddel / agentia aangezien het betrekking heeft op de TfR1 receptor, die tot expressie wordt gebracht op het luminale membraan van BMECs ...

De weerstand van het centrale zenuwstelsel (CNS) aandoeningen (bijv. Kanker, epilepsie, depressie, schizofrenie en HIV-geassocieerde neurologische aandoening) farmacologische therapieën door verschillende mechanismen, met inbegrip van zware geneesmiddelpermeatie over de bloed-hersenbarrière (BBB) . De BBB is de grens die hersenweefsel van de stoffen in het bloed isolaten. Binnen deze barrière, een laag brein microvasculaire endotheelcellen (BMECs), ondersteund door pericyten en astrocyten eindvoetjes van astrocyten, verantwoordelijk voor de hoge selectiviteit van de BBB die oplosbare geneesmiddelen met een molecuulgewicht hoger dan 400 Da 1. Andere drugsgebruik resistentiemechanisme is gekoppeld aan de aanwezigheid op BMECs geneesmiddel efflux transporters (P-glycoproteïne en multidrug resistentie eiwitten), die samenwerken om geneesmiddelpenetratie te reduceren tot het CNS en het vergemakkelijken van de extrusie hersenen 2. In het laatste decenniumEen groot aantal nanotechnologische benaderingen ontwikkeld om de klinische en biologische uitdaging van het leveren van geneesmiddelen over de BBB 3-6 voldoen. In deze context, ferritine nanobolletjes (FNN) vertegenwoordigen een volledig innovatieve en veelbelovende oplossing. FNN zijn 12 nm bolletjes van 24 zelfassemblerende ferritine (Fn) monomeren, die zijn aangebracht in een holle sferische structuur van 8 nm binnendiameter. Ferritin subeenheden kan worden gedemonteerd bij zure pH en weer in elkaar gezet in een vorm-geheugen mode door aanpassing van de pH tot neutraal, waardoor verschillende organische moleculen in te kapselen. Daarom FNN vormen een interessant model voor de ontwikkeling van multifunctionele geneesmiddelafgiftesystemen 7,8. Bovendien kunnen FNN interageren met BMECs door de specifieke herkenning van transferrinereceptor (TfR) 1, die is uitgedrukt op het luminale membraan van deze cellen 9. Tot dusver verschillende in vitro modellen van de BBB ontwikkeld in order om trans-BBB permeabiliteit toe te lichten om verschillende drugs, toxiciteit in de richting van de BBB of de interactie van moleculen met efflux transporters. Sterker nog, zijn deze modellen als geldig beschouwd in vitro benaderingen voor een snelle screening van actieve moleculen alvorens in vivo studies. Deze modellen bestaan ​​uit één endotheliale laag BMECs of samen gekweekt BMECs en astrocyten (zeldzamer pericyten), verkregen uit dierlijke (rat, muis, varken en rund) of humane cellijnen 10,11,12. De transendotheliale elektrische weerstand (TEER) en de schijnbare permeabiliteit (P app) van tracers met een bepaald molecuulgewicht stellen twee belangrijke parameters die worden gebruikt om de kwaliteit van het in vitro model te bepalen. Hier beschrijven we de tewerkstelling van een BBB in vitro model, gebaseerd op een co-cultuur van rat BMECs (RBMECs) en rat corticale astrocyten (RCA) naar de trans-BBB doordringen van ferritine nanocages inkapselen fluoresceïne isothi bestuderenocyanate (FITC).

<table><tbody><tr><td>Rat Brain Microvascular Endothelial Cells&nbsp;</td><td>Innoprot</td><td>P10308</td><td>geïsoleerd uit Sprague Dawley rattenhersenweefsel, cryobewaard bij passage één en geleverd bevroren</td></tr><tr><td>Cortical Astrocytes&nbsp;</td><td>Innoprot</td><td>P10202</td><td>geïsoleerd uit rattenhersenweefsel van 2 dagen, cryobewaard bij passage één en geleverd bevroren.</td></tr><tr><td>Endotheelcel medium kit</td><td>Innoprot</td><td>P60104</td><td>ECM (500 ml) en foetaal bovien serum (25 ml), endotheelcel groeistimulans (5 ml) en penicilline/streptomycine (5 ml). Warm in 37 &deg;C waterbad op voor gebruik en bescherm tegen licht</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA zonder Fenol Rood</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920D</td><td>Warm in 37 &deg;C waterbad op voor gebruik</td></tr><tr><td>Fluoresceïne isothiocyanate-dextran 40.000</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>bescherm tegen licht</td></tr><tr><td>paraformaldehyde&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>verdunning in chemische kap</td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat bufferoplossing zonder Ca en Mg</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp;X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>runderserum albumine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>geitenserum&nbsp;</td><td>EuroClone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>muis monoklonaal anti-Von Willebrand Factor</td><td>Dako</td><td>M0616</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 546-geconjugeerd antilichaam tegen muis IgGs</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A-11003</td><td>bescherm tegen licht</td></tr><tr><td>DAPI (4&rsquo;,6-diamidino-2-fenylindole)&nbsp;</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>bescherm tegen licht</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>dezelfde oplossing kan meerdere keren worden gebruikt</td></tr><tr><td>fibronectine uit runderplasma&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td>dezelfde oplossing kan meerdere keren worden gebruikt</td></tr><tr><td>Polyethyleentereftalaat (PET) inzetstukken</td><td>Falcon</td><td>F3090</td><td>Transparante Polyethyleentereftalaat (PET) membranen; oppervlakte: 4,2 cm2; poriëngrootte 0,4 &micro;m/oppervlakte</td></tr><tr><td>T75 Primo TC fles</td><td>EuroClone</td><td>ET7076</td><td></td></tr><tr><td>T175 Primo TC fles</td><td>EuroClone</td><td>ET7181</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2 Epitheelweefsel Volt/Ohmmeter&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>World Precision Instruments Germany</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>Endohm- 24SNAP cup</td><td>World Precision Instruments Germany</td><td>ENDOHM-24SNAP</td><td></td></tr><tr><td>Licht/fluorescentiemicroscoop met camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module</td><td>&nbsp;inverteerbare microscoop voor levende cellen met camera&nbsp;</td></tr><tr><td>Confocale Microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SPE</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorimeter</td><td>Jasco</td><td>FP-8000</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro permeatie van fitc-geladen ferritins across een rat bloed-hersenbarrière: een model om de levering van nanoformulated molecules studie

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Cerebrale microvasculaire endotheelcellen, ondersteund door periccyten en astrocyten-eindvoeten, zijn verantwoordelijk voor de lage penetratie van grote, in water oplosbare geneesmiddelen door de bloed-hersenbarrière (BBB), wat moeilijkheden veroorzaakt voor effectieve farmacologische therapieën. In de afgelopen jaren zijn er verschillende strategieën ontwikkeld om de doelgerichte aflevering in de hersenen te bevorderen, met als doel de geneesmiddelaflevering en -activiteit op deze locatie te verbeteren, inclusief innovatieve nanosystemen voor geneesmiddelaflevering over de BBB. In deze context biedt een in vitro aanpak, gebaseerd op een vereenvoudigd cellulair model van de BBB, een nuttig hulpmiddel om het effect van nanoformuleringen op de trans-BBB-penetratie van moleculen te onderzoeken. Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een dubbellaagse BBB, bestaande uit co-gecultiveerde, commercieel verkrijgbare primaire rattenhersenmicrovasculaire endotheelcellen en astrocyten. Een multiparametrische aanpak voor de validatie van het model, gebaseerd op de meting van de trans-endotheliële elektrische weerstand en de schijnbare permeabiliteit van een dextran met hoog moleculair gewicht, wordt ook beschreven. Als bewijs van concept voor het gebruik van dit BBB-model om het effect van verschillende nanoformuleringen op de translocatie van fluorescerende moleculen over de barrière te bestuderen, beschrijven we het gebruik van fluoresceïne isothiocyanate (FITC), geladen in ferritine-nanodeeltjes. Het vermogen van ferritinen om de trans-BBB-penetratie van FITC te verbeteren, werd aangetoond door fluxmetingen en confocale microscopieanalyses. De resultaten suggereren dat dit een nuttig systeem is voor het valideren van nanosystemen voor de aflevering van geneesmiddelen over de BBB.

Tijdens het opzetten van de BBB model, celhechting en groei op de inzetstukken kunnen worden geanalyseerd met een lichtmicroscoop door het transparante karakter van de PET membranen. RCA, geënt bij een dichtheid van 35.000 cellen / cm2, hechten efficiënt de onderzijde van het inzetstuk na 4 uur incubatie bij kamertemperatuur (Figuur 2A) en groeien aan het membraanoppervlak bedekken in 3 dagen, nemen een spoelvormige morfologie (Figuur 2B). RBM...

Een methode om een in vitro model van de bloed-hersenbarrière te vestigen op basis van een co-cultuur van endotheelcellen van rattenhersenmicrovatsculair en astrocyten wordt beschreven en gevalideerd. Dit systeem bleek een geldige tool te zijn om het effect van nanoformulering op de trans-barrière penetratie van fluorescerende moleculen te bestuderen.

In Vitro Permeatie van FITC-geladen Ferritins Across een Rat bloed-hersenbarrière: een model om de Levering van Nanoformulated Molecules Studie

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Het algemene doel van deze procedure is om een gevalideerde aanpak te beschrijven voor het bestuderen van de transport over de bloed-hersenbarrière van nanoformuleringen van fluorescerende moleculen, waarbij ferritin-nanokooien geladen met FITC als proof of concept dienen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de resistentie van ziekten in het centrale zenuwstelsel tegen farmacologische therapieën, als gevolg van de lage permeatie van geneesmiddelen door de bloed-hersenbarrière. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om aan te tonen hoe een nanoformulering de permeatie van ingekapselde moleculen door de bloed-hersenbarrière kan verbeteren, gebruikmakend van een aanpak op een enkel BBB-model.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van aandoeningen met neurologische effecten, omdat deze in staat is de hoge selectiviteit van de bloed-hersenbarrière voor de meeste geneesmiddelen te overwinnen. Deze methode kan inzicht bieden in de efficiëntie van ferritine-nanokooien als afgiftesysteem voor geneesmiddelen over de bloed-hersenbarrière. De methode is toegepast met FITC, maar kan ook worden ingezet

in-vitro-permeation-fitc-loaded-ferritins-across-rat-blood-brain

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video describes a permeability assay to evaluate the permeability of in vitro blood-brain barrier using sodium fluorescein molecules.

Blood-Brain Barrier Mimic Permeability Assay: An In Vitro Assay to Assess the Permeability of BBB Mimic to Tracer Molecules

This video demonstrates a method to study permeation through an in vitro blood-brain barrier (BBB) model using astrocytes and endothelial cells on a membrane insert, with free FITC and FITC-loaded ferritin. FITC-ferritin bound to receptors on endothelial cells and crossed the membrane barrier to the lower chamber while free FITC showed restricted permeation and remained in the upper chamber.

Studying the Permeation of FITC and FITC-Ferritin through an In Vitro Blood-Brain Barrier Model

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

Het doel van het protocol is te presenteren van een geoptimaliseerde procedure tot vaststelling van een in vitro bloed - hersenbarrière (BBB) model gebaseerd op primaire varkens endothelial hersencellen (pBECs). Het model toont hoge reproduceerbaarheid, hoge dichtheid, en is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire drugontdekking mensenhandel.

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

In deze studie presenteren wij een gemakkelijke en efficiënte procedure voor de beoordeling van de verstoring van de bloed - hersenbarrière neurodegeneratieve omstandigheden. Onze om doel te bereiken, we geïnfundeerd ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd (FITC)-albumine in muis jugular ader en de lekkage in de hersenen parenchym door fluorescentie microscopie geëvalueerd.

Beoordeling van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit door intraveneuze infusie van FITC-geëtiketteerden albumine in een muismodel van neurodegeneratieve ziekte

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Drug targeting aan tumoren van het centrale zenuwstelsel is een grote uitdaging. Hier beschrijven we een protocol om te produceren van een in vitro nabootsen van de bloed-hersen tumor-barrière lymfkliertest en/of menselijke cellen gebruiken en bespreken het belang ervan voor de voorspelbaarheid van het centrale zenuwstelsel tumor targeting in vivo.

Predicting In Vivo Payloads levering met behulp van een bloed-hersen Tumor-barrière in een schotel

Dit protocol illustreert een in vitro endotheelceltranscytosetest als een model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren door het vermogen van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen te meten om mierikswortelperoxidase over cellen te transporteren in caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen.

Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

In deze studie wordt fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld (FITC) dextran toegediend aan muizen via orale maagsonde om de intestinale permeabiliteit zowel in vivo als in plasma- en fecale monsters te evalueren. Omdat de darmbarrièrefunctie in veel ziekteprocessen wordt beïnvloed, kan deze directe en kwantitatieve test in verschillende onderzoeksgebieden worden gebruikt.

Beoordeling van de integriteit van de darmbarrière bij muizen met fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld dextran

"E-DNA" sensoren, reagentless hebben elektrochemische biosensoren die goed presteren, zelfs wanneer direct uitgedaagd in het bloed en andere complexe matrices, aangepast aan de detectie van een breed scala van nucleïnezuur, eiwitten en kleine moleculen analyten. Hier presenteren we een algemene procedure voor de fabricage en het gebruik van dergelijke sensoren.

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

Leer een gevalideerd in vitro model van de bloed-hersenbarrière met rat hersenmicrovasculaire endotheelcellen en astrocyten. Deze methode toont aan dat ferritine nanokooien de permeatie van FITC-gekapselde moleculen aanzienlijk verbeteren.

In Vitro Permeatie van FITC-geladen Ferritins Across een Rat bloed-hersenbarrière: een model om de Levering van Nanoformulated Molecules Studie (Video) | JoVE Journal

In Vitro Permeatie van FITC-geladen Ferritins Across een Rat bloed-hersenbarrière: een model om de Levering van Nanoformulated Molecules Studie

Meer video's verkennen