Name: RNA-interferentie op basis van onderzoek naar de functie van heat shock protein 27 tijdens cornea epitheliale wondheling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Leer RNA-interferentie om de functie van HSP27 te onderzoeken tijdens cornea epitheliale wondheling. Deze methode maakt gerichte knockdown van genexpressie mogelijk voor inzicht in eiwitfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de Student Research Grant (13-14) van de Universiteit van Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea en een subsidie ​​(2014-464) van de Asan Institute for Life Sciences, Seoul, Korea.

1. Cell Line <ol><li> Cultuur 10 6-telomerase geïmmortaliseerde humane corneale epitheelcellen (HCECs) in een 6-puts plaat (dichtheid: 1039,9 cellen / mm 2) in een 37 ° C incubator met 5% CO2 atmosfeer via luchtwegepitheel groeimedium (BEGM) tot bereiken ze 95% samenvloeiing. </li></ol> 2. Western Blot Analyse Na het aanmaken van Epitheliale Scratch Wonden <ol><li> Streak een steriele 200 ul pipetpunt over het oppervlak van een putje van confluente cultuur HCECs viermaal per schaaltje in een biologische veiligheidskast (klasse II, Type A2) en incubeer HCECs afzonderlijk in een 37 ° C incubator met 5% CO2 atmosfeer gedurende 1, 5, 10, 30, 60 en 120 min. </li><li> Gebruik een 6-wells plaat zes verschillende monsters volgens de incubatietijd na corneale epitheel verwonding. </li><li> Wassen gewonden HCEC monolagen driemaal met 1x PBS en voeg 2,0 ml BEGM aan elk putje. </li><li> Maak HCECs gebruik van 2ml 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) per putje gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 900 g gedurende 5 min in een 15 ml buis en zuig trypsine-EDTA met een 1 ml pipet. </li><li> Schorsen HCECs met 1 ml 1x PBS en overbrengen naar een 1,5 ml buis. </li><li> Centrifugeer HCECs bij 10.000 xg gedurende 15 sec en zuig 1x PBS onder toepassing van een 1 ml pipet. </li><li> Resuspendeer HCECs in 100 ul ijskoude lysisbuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride [PMSF], proteaseremmers [1 pM pepstatine A, 1 uM leupeptine en 0,1 uM aprotinine] en 0,5% Triton X-100 [pH 7]) en goed mengen. </li><li> Incubeer cellen gedurende 30 minuten op ijs om cellysis te induceren. </li><li> Centrifugeer lysaten bij 4 ° C bij 10.000 xg gedurende 15 min, en vervolgens over supernatanten vers 1,5 ml buisjes (90 gl aliquots) en bewaar ze bij -80 ° C. </li><li> Bepaal totale eiwitconcentraties van cellysaten met behulp van de Bradford protein assay. 9 </li><li> Load 30 ug totaal cel eiwitten in een 10% of 12% acrylamide gel voor natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en daarna elektroforetisch overdracht gescheiden eiwitbanden op nitrocellulose filters met een 200 mA gedurende 1 uur bij 4 ° C te gebruiken in western blot assays. </li><li> Blok nitrocellulose filtermembranen met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST) gedurende 1 uur, voeg primaire konijnen polyklonale antilichamen tegen niet-gefosforyleerd HSP27 (1: 1000 verdunning) of primaire konijnen polyklonaal antilichaam tegen gefosforyleerd HSP27 (1 : 1000 verdunning) in 5% runderserumalbumine (BSA), en incubeer de membranen overnacht bij 4 ° C op een schudder. </li><li> Detecteren immuunreactieve banden middels mierikswortel peroxidase-geconjugeerd geit anti-konijn antilichamen (1: 10.000 verdunning) in 5% BSA na het wassen gedurende 10 minuten 3 keer met TBST. </li><li> Incubeer het membraan in de western blotting luminol reagentia (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membraan) gedurende 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het membraan uit reagens oplossing verwijdert overtollige vloeistof met een absorberende handdoek, en plaats in een plastic zeil protector. </li><li> Werken in een donkere kamer met een kluis licht, plaatsen bedekt membraan in een film cassette met eiwit zijde naar boven. </li><li> Plaats röntgenfilm bovenop membraan en blootgesteld gedurende 1 minuut. </li></ol> 3. siRNA Transfectie Assay 10 <ol><li> Cultuur HCECs bij 5 x 10 5 cellen / putje in een 6-wells plaat in een 37 ° C incubator met 5% CO2 atmosfeer via BEGM totdat ze 95% confluentie bereiken. </li><li> Verdun de transfectiereagens (2,5 of 7,5 pl) met 100 ul verminderde serum medium voor transfectie (de verdunningsfactor was 41 of 14,3) en los de HSP27-specifieke en scrambled controle siRNA in 100 pl gereduceerd serum medium te creëren 10 of 50 nM HSP27-specifieke en scrambled siRNA controle. </li><li> Meng 100 μ; L siRNA oplossing met 100 gl verdunde transfectiereagens (1: 1 verhouding) en incuberen van het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg de siRNA-lipidecomplexen aan cellen. Dan na 4 uur veranderingsmedia voltooid BEGM en incubeer de cellen gedurende 2 dagen bij 37 ° C. </li><li> Analyseer getransfecteerde cellen door western blotting, zoals beschreven in de secties 4,1-4,7. </li></ol> 4. Western Blot Assay voor siRNA getransfecteerde cellen 11 <ol><li> Extract HSP27-specifieke en scrambled controle-siRNA getransfecteerde HCECs in een biologische veiligheidskast met 100 ul ijskoude lysisbuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF), proteaseremmers en 0,5% Triton X-100, pH 7). </li><li> Incubeer cellen gedurende 30 minuten op ijs om cellysis te induceren. </li><li> Pellet lysaten bij 10.000 g gedurende 15 min en vervolgens over te dragen supernatanten frisse 1,5 ml tubes (90 gl aliquots) en bewaar ze bij -80 ° C. </li><li> Bepaal proteïneconcentraties van de cellysaten met behulp van de Bradford eiwit assay. 9 </li><li> Laad monsters met gelijke hoeveelheden van de totale celeiwitten op een 10% of 12% acrylamidegel, onderwerpen de gel aan SDS-PAGE en elektroforetisch overdracht van de gescheiden eiwitbanden op nitrocellulose filters met een 200 mA gedurende 1 uur bij 4 ° C gebruikt in western blot assays. </li><li> Blok nitrocellulose filtermembranen met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST) gedurende 1 uur, voeg primaire antilichamen tegen gefosforyleerd en niet-gefosforyleerd HSP27 (1: 1000 verdunning), gefosforyleerde Akt (1: 1000 verdunning), niet-gefosforyleerde Akt (1: 1000 verdunning gebruikt als celoverleving marker), Bcl-2-geassocieerde X eiwit (1: 1000 verdunning gebruikt als een pro-apoptotisch eiwit) en glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH; 1 : 200 verdunning gebruikt als beladingscontrole) in 5% runderserumalbumine (BSA), enIncubeer de membranen overnacht bij 4 ° C op een schudder. </li><li> Detecteren immuunreactieve banden middels mierikswortel peroxidase-geconjugeerd geit anti-konijn antilichamen (1: 10.000 verdunning) in 5% BSA na 3 keer wassen met TBST, 10 min per wasbeurt. </li><li> Incubeer het membraan in de western blotting luminol reagentia (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membraan) gedurende 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het membraan uit reagens oplossing verwijdert overtollige vloeistof met een absorberende handdoek, en plaats in een plastic zeil protector. </li><li> Werken in een donkere kamer met een kluis licht, plaatst het overdekte membraan in een film cassette met het eiwit zijde naar boven. </li><li> Plaats röntgenfilm bovenop het membraan en blootgesteld gedurende 1 minuut. </li></ol> 5. Scratch-geïnduceerde Directional verwonden Assay Evaluatie van de Cel Migratie 12 <ol><li> In een biologisch veiligheidskabinet, maak een wond door over het oppervlak te slepen een steriele pipet tip van een goed die confluente culturen vanHSP27-specifieke siRNA getransfecteerde of roerei controle-siRNA getransfecteerde HCECs. </li><li> Onmiddellijk na verwonding, was de cellen tweemaal met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en te onderhouden in BEGM culturen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 atmosfeer gedurende 24 uur na verwonding. </li><li> Fotograferen HCEC beelden met behulp van een rechtopstaande microscoop bij 100X vergroting 24 uur na verwonding en uit te voeren achtergrond afvlakking met behulp van de Filter commando in beeldanalyse software. </li><li> Met behulp van de opdracht Select Metingen, bepalen de Area of ​​Interest (AOI) met dezelfde grootte veelhoekige vorm die loodrecht kan dekken van begin tot eind van de oorspronkelijke wond, en het bepalen van drie verschillende AOI in het gewonde gebied van elk monster. </li><li> Automatisch tellen het aantal cellen in elk veld met behulp van de graaf / Size Maatregel menu-opties. </li></ol> 6. Flowcytometrieanalyse van apoptose <ol><li> Cultuur HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde en controleiRNA getransfecteerde HCECs bevattende 10 nM siRNA elk bij een concentratie van 5 x 10 5 cellen / putje in 6-putjesplaten tot de cellen bereikt 95% confluentie in een 37 ° C incubator met 5% CO2 atmosfeer in BEGM. </li><li> Los HCECs gebruik 2 ml 0,25% trypsine-EDTA per putje gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 900 g gedurende 5 min in een 15 ml buis en zuig trypsine-EDTA met een 1 ml pipet. </li><li> Was de cellen tweemaal met koud PBS en resuspendeer de cellen in 1x bindingsbuffer (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl en 25 mM CaCl2) bij een concentratie van 10 6 cellen / ml. </li><li> Transfer 100 ul celsuspensie (1 x 10 5 cellen) in een 5 ml cultuur buis. </li><li> Voeg 5 ul fluorescéine isothiocyanaat-geconjugeerd annexine V en 5 ui propidium iodide. </li><li> Voorzichtig vortex de cellen en incubeer ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Voeg 200 ul van 1 x bindingsbuffer aan elke buis en analyseren van de cellen door een stroom cytometer binnen 1 uur. </li></ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële of geheime belangen in materialen of methoden in deze studie genoemd.

In deze huidige studie hebben we de potentiële rol van HSP27 in wondgenezing van het hoornvliesepitheel geëvalueerd met behulp van in vitro benaderingen. De cruciale stappen omvatten siRNA-transfectie voor HSP27 knock-down om de functie van HSP27 in cellen die aan stress werden blootgesteld te observeren. Opmerkelijk was dat een rol voor HSP27 werd onthuld door deze experimenten in epitheelcelmigratie en apoptose tijdens wondgenezing van het hoornvliesepitheel. In tegenstelling tot eerdere studies10 d...

Corneale epitheliale cellen (LME) continu afgestoten in traanfilm, terwijl ze tegelijkertijd vervangen door cellen van de limbus en corneale epitheliale basale lagen. 1 verschillende extrinsieke stressoren kunnen de apoptose en afschilfering van CECs induceren. 2 De heat shock eiwitten (HSP) zijn sterk geconserveerd en kunnen worden onderverdeeld in twee families op basis van molecuulgrootte. 3 de grootste HSP-familie omvat HSP90, HSP70 en HSP60 en de kleine familie omvat HSP27. 4 de fosforylatie van HSP27 speelt een belangrijke rol in celoverleving spelen en is vereist voor celmigratie vanwege de rol van dit eiwit in actine remodellering. 5-7 Daarom hebben we geprobeerd om de mogelijke rol van HSP27 fosforylatie in CEC migratie en apoptose getest in een in vitro model van epitheliale wondgenezing. RNA-interferentie (RNAi) met behulp van kleine of korte interfererende RNA (siRNA) heeft generated belangstelling voor zowel fundamenteel als toegepast biologie, omdat het mogelijk maakt de expressie van elk gen van belang worden overreden. 8 Hierin gebruikten we HSP27-specifiek siRNA om de bijdrage van HSP27 CEC wondgenezing en apoptose beoordelen. Traditionele werkwijzen voor RNAi gen knock-in cellen gebruiken synthetische RNA duplexen, waaronder twee niet-gemodificeerd 21-meer oligonucleotiden die kunnen worden samengesteld om siRNA&#39;s te maken. De RNAi siRNA dat we in deze studie is een eenvoudige en efficiënte methode om cellen te transfecteren, en dit reagens werkt met verschillende geïmmortaliseerde cellijnen. In deze studie tonen we de voor deze analyse methoden, met inbegrip van een scratch-geïnduceerde directionele wond assay, western blotting, siRNA transfectie assay, immunofluorescentietest, en flowcytometrie.

<table><tbody><tr><td>Biologische veiligheidskast</td><td>CHC LAB Co.Ltd,&nbsp; Daejeon, Republiek Korea&nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>Klasse II, Type A2&nbsp;</td></tr><tr><td>Stealth RNAi&trade; siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>RNAi siRNA; versleutelde controle-siRNA en HSP27-specifiekere siRNA</td></tr><tr><td>BEGMTM</td><td>Lonza, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>Bronchiaal epitheel groeimedium&nbsp;</td></tr><tr><td>Protease remmer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>P8340,P7626</td><td>1 &#956;M Pepstatin A, 1 &#956;M Leupeptin, 0.1 &#956;M Aprotinine</td></tr><tr><td>Bradford eiwit assay&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>#500-0001</td><td>Bradford eiwit assay&nbsp;</td></tr><tr><td>Nitrocellulose filters&nbsp;</td><td>Amersham, Little Chalfont, UK</td><td>RPN3032D</td><td>Western blotting membraan</td></tr><tr><td>Non-gefosforyleerd HSP27&nbsp;</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab12351</td><td>1:1,000 verdunning (Totaal HSP27)</td></tr><tr><td>Gefosforyleerd HSP27 (Ser85)</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab5594</td><td>1:1,000 verdunning HSP27 werd gefosforyleerd bij Ser85</td></tr><tr><td>Lipofectamine&reg; RNAiMAX reagens&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>Gefosforyleerd Akt (Ser473)</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>Nr. 4060</td><td>1:1,000 verdunning Akt werd gefosforyleerd bij Ser473 (celoverlevingsmarker)</td></tr><tr><td>Non-gefosforyleerd Akt&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>Nr. 4061</td><td>1:1,000 verdunning (Totaal Akt)</td></tr><tr><td>Bcl-2-geassocieerd X-eiwit&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>Nr. 4062</td><td>1:1,000 (anti-apoptotisch eiwitmarker)</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>Nr. 4063</td><td>1:1,000 ladingscontrolemarker (huishoudgen)</td></tr><tr><td>Paardenradijs peroxidase-geconjugeerde geiten anti-konijn antilichamen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>1:10.000 verdunning</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>31985</td><td>gereduceerd serummedium voor transfectie</td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware</td><td>Olympus, Inc., Tokyo, Japan</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Skim melkpoeder&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Duitsland</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>Nr.-0497</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>Nr.-0241</td><td></td></tr><tr><td>Zes wel cultuurbord</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>140675</td><td>35,00 mm diameter / wel</td></tr><tr><td>24-wel cultuurbak</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Orbitaal shaker</td><td>N-Bioteck, Inc., Seoul, Zuid-Korea</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>Rundserum albumine</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td></td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>X-Ray Film</td><td>Kodak, Rochester, NY</td><td></td><td>Medische X-Ray Cassette met Green 400 Scherm&nbsp;</td></tr><tr><td>Western blotting luminol reagens</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-interferentie op basis van onderzoek naar de functie van heat shock protein 27 tijdens cornea epitheliale wondheling

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Klein interfererend RNA (siRNA) is een van de meest gebruikte methoden voor RNA-interferentie voor de kortstondige onderdrukking van eiwitcoderende genen. siRNA is een synthetische RNA-duplex die specifiek is gemaakt om een mRNA-transcript aan te vallen om de degradatie ervan te induceren en het is gebruikt om nieuwe paden in verschillende cellulaire processen te identificeren. Er zijn maar weinig rapporten over de rol van gefosforyleerde heat shock-eiwit 27 (HSP27) bij het genezingsproces van het hoornvliesepitheel. Hierbij werden gekweekte menselijke hoornvliesepitheelcellen verdeeld in een groep getransfecteerd met een willekeurige controle-siRNA en een groep getransfecteerd met HSP27-specifieke siRNA. Vervolgens werden scratch-geïnduceerde directionele wondgenezingsassays, western blotting en flowcytometrie uitgevoerd. We concluderen dat HSP27 rollen heeft bij het genezingsproces van het hoornvliesepitheel die mogelijk epitheelcel-apoptose en -migratie omvatten. Hier worden stapsgewijze beschrijvingen van de monstervoorbereiding en het onderzoeksprotocol gegeven.

De expressie van HSP27 gefosforyleerde significant verhoogd 5, 10 en 30 minuten na kras verwonding vergeleken met verwonde HCECs 13. Western blot analyse toonde dat de expressie van HSP27 en gefosforyleerde Akt gefosforyleerd waren beide aanzienlijk verminderd, terwijl de expressie van Bax aanzienlijk HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde HCECs (Figuur 1A-E) verhoogd. De gefosforyleerd HSP27 expressie werd verminderd met 30% en 40% in 10 nm en 50 nm van HSP2...

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van heat shock protein 27 (HSP27)-specifiek klein interfererend RNA om de functie van HSP27 te beoordelen tijdens wondgenezing van het hoornvliesepitheel. RNA-interferentie is de beste methode om effectief genexpressie te onderdrukken om de eiwitfunctie in verschillende celtypen te onderzoeken.

RNA-interferentie op basis van onderzoek naar de functie van heat shock protein 27 tijdens cornea epitheliale wondheling

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Het algemene doel van deze RNA-transfectie-assay is om HSP27-specifiek klein interfererend RNA te gebruiken om de potentiële rol van HSP27 bij de wondgenezing van het corneale epitheel te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de functie van Heat Shock Protein 27 tijdens het proces van epitheliale wondgenezing. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat klein interfererend RNA een gevoelig RNA-molecuul is dat is ontworpen om specifiek een boodschapper-RNA-transcript te targeten om de afbraat ervan te induceren.Het is gebruikt om nieuwe doelwitten in diverse cellulaire processen te identificeren. Hoewel deze techniek inzicht kan bieden in de wondgenezing van het corneale epitheel, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals de huid en het slijmvlies. De procedure zal worden gedemonstreerd door Soon-Suk Kang, een laborant uit mijn laboratorium.Om deze procedure te starten, worden menselijke cornea-epitheelcellen in een zes-wellplaat gekweekt in bronchiaal epithelium-groeimedium bij 37 °C en 5% CO2 totdat ze een confluentie van 95% bereiken. Verdun vervolgens 2,5 µL of 7,5 µL van het transfectiereagens met 100 µL serumarm medium voor transfectie. Los daarna HSP27-specifiek siRNA en scrambled control-siRNA op in 100 µL serumarm medium om respectievelijk 10 nM HSP27-specifiek siRNA en 15 nM scrambled control-siRNA te verkrijgen.Meng daarna 100 µL siRNA-oplossing met 100 µL verdund transfectiereagens en incubeer het mengsel 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens de siRNA-lipidcomplexen toe aan de cellen. Na een incubatie van vier uur wordt het medium vervangen door het complete groeimedium voor bronchiale epitheelcellen, waarna de cellen twee dagen bij 37 °C worden geïncubeerd voorafgaand aan de western blot-analyse.Extraheer in deze stap de met HSP27-specifieke en scrambled controle siRNA getransfecteerde HCECs in een biologische veiligheidskabinet met behulp van 100 µL ijskoude lysisbuffer. Incubeer de cellen vervolgens 30 minuten op ijs om cellysis te induceren. Centrifugeer daarna de lysaten 15 minuten bij 10.000 ×g.Breng vervolgens de supernatanten over naar nieuwe buisjes van 1,5 milliliter en bewaar deze bij minus 80 graden Celsius. Bepaal daarna de proteïneconcentraties van de cellysaten met behulp van de Bradford-proteïneanalyse. Laad vervolgens de monsters met gelijke hoeveelheden totaal celproteïnen op een 10 procent of 12 procent acrylamidegel.Onderwerp de gel aan SDS-PAGE en transfer de gescheiden eiwitbanden elektroforetisch naar de nitrocellulosefilters met een stroomsterkte van 200 mA gedurende één uur bij vier graden Celsius. Blok daarna de nitrocellulosefiltermembranen met vijf procent magere melk in TBST gedurende één uur. Voeg vervolgens primaire antilichamen toe en incubeer de membranen overnight bij vier graden Celsius op een shaker.Was de membranen de volgende dag drie keer met TBST, waarbij elke wasbeurt tien minuten duurt. Detecteer vervolgens de immunoreactieve banden met mierikswortelperoxidase-geconjugeerde geiten-anti-konijn antilichamen in vijf procent BSA. Incubeer de membranen daarna gedurende één minuut bij kamertemperatuur in de luminol-reagentia voor western blotting.Verwijder het membraan uit de reagensoplossing. Verwijder vervolgens overtollige vloeistof met een absorberende handdoek en plaats deze in een plastic insteekhoes. Plaats daarna het afgedekte membraan in een filmcassette met de eiwitzijde naar boven gericht.Plaats een röntgenfilm bovenop de membranen en belicht deze gedurende één minuut. Maak in een biologische veiligheidskast een wond door met een steriele pipetpunt over de confluente culturen van HCEC's te trekken die getransfecteerd zijn met HSP27-specifiek of scrambled controle siRNA. Was de cellen onmiddellijk na het maken van de wond twee keer met 1XPBS en houd ze gedurende 24 uur in groeimedium voor bronchiaal epitheel bij 37 °C en vijf procent koolstofdioxide.Maak 24 uur na het beschadigen een afbeelding van de HCECs met een rechtopstaande microscoop bij 100x en voer achtergrondnivellering uit met het filtercommando in de beeldanalyse-software. Definieer met het commando voor het selecteren van metingen het interessegebied met een polygone vorm van dezelfde grootte die de initiële wond loodrecht van uiteinde tot uiteinde kan beslaan. Bepaal vervolgens drie verschillende interessegebieden in het beschadigde gebied van elk monster.Tel automatisch het aantal cellen in elk veld met behulp van de menuoptie 'count size measure'. De hier getoonde Western blot-analyse onthulde dat de expressie van gefosforyleerd HSP27 en gefosforyleerd Akt beide significant waren afgenomen. Terwijl de expressie van backs significant was toegenomen in HCECs die waren getransfecteerd met HSP27-specifiek siRNA.De expressie van gefosforyleerd HSP27 was met respectievelijk 30 procent en 40 procent verminderd in cellen getransfecteerd met 10 nanomolar en 15 nanomolar HSP27-specifiek siRNA, vergeleken met cellen getransfecteerd met controle-siRNA. Bovendien was de expressie van niet-gefosforyleerd HSP27 met respectievelijk 20 procent en 30 procent verminderd in cellen getransfecteerd met 10 nanomolar en 15 nanomolar HSP27-specifiek siRNA. De scratch-geïnduceerde directionele wondassay toonde aan dat cellen getransfecteerd met 10 en 15 nanomolar HSP27-specifiek siRNA 24 uur na de verwonding een verminderde migratie vertoonden.Daarnaast vertoonden met HSP27-specifiek siRNA getransfecteerde HCEC's meer apoptotische en necrotische celdood vergeleken met de met scrambled controle-siRNA getransfecteerde cellen, zoals aangetoond via flowcytometrie. Zodra de techniek onder de knie is, kan de RNA-transfectie binnen 24 uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Door deze procedures te volgen, kan een situatie zoals lock mouth worden gecreëerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de initiële functie van Heat Shock Protein 27 bij de wondgenezing van het hoornvliesepitheel.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u specifiek klein interfererend RNA voor Heat Shock Protein 27 kunt gebruiken om de potentiële rol van Heat Shock Protein 27 bij de wondgenezing van het hoornvliesepitheel te beoordelen. Vergeet niet dat het werken met klein interfererend RNA en reagentia gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmiddelen, zoals een biologische veiligheidskast en een beschermend masker, altijd gebruikt moeten worden bij het uitvoeren van deze procedures.

rna-interference-based-investigation-function-heat-shock-protein-27

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Een voorbeeld van adenovirale gentherapie in humane diabetische orgaan-gecultiveerde hoornvliezen wordt gepresenteerd met als doel de normalisatie van vertraagde wondgenezing en een duidelijk verminderde expressie van epitheliale stamcelmarkers in deze hoornvliezen. Het beschrijft ook de optimalisering van dit proces in stamcel-verrijkte limbale epitheelculturen.

Adenovirale Gentherapie voor Diabetische keratopathie: Effecten op wondgenezing en Stem Cell Marker Expressie in Human Organ-gekweekte Corneas en Limbale epitheelcellen

Hoge-doorvoer kleine remmende RNA screening is een belangrijk instrument die helpen kan sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. Hierin presenteren wij de ontwikkeling en validatie van blootstelling modellen en methoden mbt de hoge doorvoer screening van waterstoffluoride en chloorpikrine-geïnduceerde hoornvlies epitheliale letsel.

High Throughput SiRNA Screening voor chloorpikrine en waterstoffluoride-geïnduceerde hoornvlies epitheliale cel letsel

Dit protocol beschrijft een methode om een slijtage aan de oculaire oppervlakte van de muis toebrengen, en volgen de wond genezingsproces daarna. Het protocol maakt gebruik van een oogbeschadigingen en/of burr gedeeltelijk verwijderen van de oppervlakte-epitheel van het oog bij verdoofde muizen.

Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing

Een protocol voor een ex vivo hoornvlies orgel cultuur model nuttig voor wond genezing studies wordt beschreven. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van de drug toxiciteit in een georganiseerde 3D meercellige omgeving of agenten om regeneratieve genezing te bevorderen.

Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies

Hier wordt een protocol beschreven voor het maken van een centrale hoornvliesepitheelslijtagewond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing in de context van ziekten te evalueren.

Een epitheel schuurmodel voor het bestuderen van corneawondgenezing

Hier worden diermodellen op basis van muis en konijn ontwikkeld voor mechanisch en chemisch letsel van hoornvliesepitheel om nieuwe therapieën en het onderliggende mechanisme te screenen.

Ex vivo en in vivo diermodellen voor mechanische en chemische verwondingen van cornea-epitheel

Het huidige protocol demonstreert de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. De regenererende of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure.

Onderzoek naar littekenloze weefselregeneratie bij embryonale gewonde kikkererwtenhoorns

Dit protocol richt zich op het beschadigen van het oculaire oppervlak van zebravissen door middel van slijtage om de daaropvolgende wondsluiting op cellulair niveau te beoordelen. Deze benadering maakt gebruik van een oculaire braam om het hoornvliesepitheel gedeeltelijk te verwijderen en maakt gebruik van scanning elektronenmicroscopie om veranderingen in de celmorfologie tijdens wondsluiting te volgen.

Zebrafish Corneal Wound Healing: van abrasie tot wond closure imaging analyse

Het huidige werk beschrijft een nieuw experimenteel protocol dat een 3D-geprinte houder gebruikt om live cell imaging met hoge resolutie van enucleated globes mogelijk te maken. Via dit protocol kan de cellulaire calciumsignaleringsactiviteit in gewond hoornvliesepitheel van ex vivo globes in realtime worden waargenomen.

Live-cell beeldvorming van intacte Ex Vivo Globes met behulp van een nieuwe 3D-geprinte houder

We ontwikkelden een rattenmodel van ernstige hoornvliesontsteking door middel van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen. De studie evalueerde ontstekingspatronen van het hoornvlies, epitheliale proliferatie en veranderingen in limbale stamcellen onder ontstekingsomstandigheden.

Het opzetten van een model voor ernstige hoornvliesontsteking bij ratten op basis van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen

Ex vivo orgaancultuur van het hoornvlies van varkens en epitheliale wondgenezing bieden een economisch, ethisch, reproduceerbaar en kwantitatief middel voor het testen van de oculaire toxiciteit van chemicaliën. Ze helpen ook bij het ophelderen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van epithelisatie en weefselherstel, en bij het evalueren van therapieën voor de behandeling van diabetische keratopathie en vertraagde wondgenezing.

Evaluatie van therapeutische en chemische toxiciteit met behulp van orgaangekweekte varkenshoornvliezen en epitheliale wondgenezing

Leer RNA-interferentie om de functie van HSP27 te onderzoeken tijdens cornea epitheliale wondheling. Deze methode maakt gerichte knockdown van genexpressie mogelijk voor inzicht in eiwitfunctie.

RNA-interferentie op basis van onderzoek naar de functie van heat shock protein 27 tijdens cornea epitheliale wondheling

Meer video's verkennen