RNA-interferentie op basis van onderzoek naar de functie van heat shock protein 27 tijdens cornea epitheliale wondheling

Het algemene doel van deze RNA-transfectietest is om HSP27-specifiek klein interfererend RNA te gebruiken om de mogelijke rol van HSP27 bij wondgenezing van het hoornvliesepitheel te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de functie van Heat Shock Protein 27 tijdens het wondgenezingsproces van het epitheel. Het grote voordeel van deze techniek is dat klein interfererend RNA gevoelig RNA-suiker is gemaakt om specifiek een boodschapper-RNA-transcript te targeten om de afbraak ervan te induceren.

Het is gebruikt om nieuwe pestruimten te identificeren voor verschillende cellulaire processen. Hoewel deze techniek inzicht kan geven in de wondgenezing van het hoornvliesepitheel, kan het ook worden toegepast op een ander systeem zoals huid en mucosa. Het demonstreren van de procedure zal Soon-Suk Kang zijn, een technicus uit mijn laboratorium.

Om met deze procedure te beginnen, kweek menselijke hoornvliesepitheelcellen in een zes-wellplaat met bronchiaal epitheelgroeimedium bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide tot ze 95 procent confluent zijn. Verdun vervolgens 2,5 microliter, of 7,5 microliter van het transfectiemiddel met 100 microliter gereduceerd serummedium voor transfectie. Los vervolgens HSP27-specifiek siRNA en willekeurig gecontroleerd siRNA op in 100 microliter of gereduceerd serummedium om respectievelijk 10 nanomolair HSP27-specifiek siRNA en 15 nanomolair willekeurig gecontroleerd siRNA te creëren.

Meng daarna 100 microliter siRNA-oplossing met 100 microliter verdund transfectiemiddel en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens siRNA-lipidecomplexen toe aan de cellen. Na een incubatie van vier uur, ververs het medium naar het volledige bronchiaal epitheelgroeimedium, en incubeer de cellen twee dagen bij 37 graden Celsius voordat de western blot-analyse wordt uitgevoerd.

In deze stap, extraheert u HSP27-specifiek en willekeurig gecontroleerd siRNA getransfecteerde HCEC's in een biologisch veiligheidskabinet met behulp van 100 microliter ijskoud lysebuffer. Bewaar vervolgens de cellen gedurende 30 minuten op ijs om cellyse te induceren. Centrifugeer vervolgens de lysaten gedurende 15 minuten bij 10.000 keer G.

Breng vervolgens de supernatanten over naar verse 1,5 milliliterbuizen en bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Bepaal vervolgens de eiwitconcentraties van de cellysaten met behulp van de Bradford-eiwitanalyse. Laad vervolgens de monsters met gelijke hoeveelheden totale cel-eiwitten op een 10 procent of 12 procent acrylamidegel.

Onderwerp de gel aan SDS-pagina en breng de gescheiden eiwitbanden elektroforetisch over naar de nitrocellulosefilters met 200 milliampère stroom gedurende een uur en vier graden Celsius. Blokkeer vervolgens de nitrocellulosefiltermembranen met vijf procent magere melk in TBST gedurende een uur. Voeg vervolgens primaire antilichamen toe en incubeer de membranen een nacht lang bij vier graden Celsius op een shaker.

De volgende dag, was de membranen drie keer met TBST en laat tien minuten tussen elke wassing. Detecteer vervolgens de immunoreactieve banden met behulp van paardenradishperoxidase geconjugeerd geitenanti-konijnantilichamen in vijf procent BSA. Breng vervolgens de membranen gedurende één minuut in de western blotting luminol-reagentia bij kamertemperatuur.

Verwijder het membraan uit de reagensoplossing. Verwijder vervolgens overtollig vocht met een absorberend handdoekje en plaats ze in een plastic foliebeschermer. Plaats vervolgens het beschermde membraan in een filmcassette met de eiwitzijde naar boven.

Plaats een röntgenfilm bovenop de membranen en belicht deze gedurende één minuut. Maak in een biologisch veiligheidskabinet een wond door een steriele pipettip over de confluente culturen van HSP27-specifiek of willekeurig gecontroleerd siRNA getransfecteerde HCEC's te trekken. Direct na het wonden, was de cellen tweemaal met 1XPBS en houd ze in bronchiaal epitheelgroeimedium bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide gedurende 24 uur.

24 uur na het wonden, neemt u de HCEC's op met behulp van een rechtopstaande microscoop bij 100x en voert u achtergrondvlakmaking uit met behulp van de filteropdracht in beeldanalysesoftware. Gebruik de opdracht selecteer metingen om het gebied van belang te definiëren met dezelfde grootte van een veelhoekige vorm die het oorspronkelijke wond loodrecht van begin tot eind kan bedekken. Bepaal vervolgens drie verschillende gebieden van belang in het gewonde gebied van elk monster.

Tel automatisch het aantal cellen in elk veld met behulp van de menuoptie meting van grootte tellen. De western blot-analyse toont hier dat de expressie van gefosforyleerd HSP27 en gefosforyleerd Akt beide significant verminderd waren. Terwijl de expressie van backs significant toenam in HSP27-specifiek siRNA getransfecteerde HCEC's.

De expressie van gefosforyleerd HSP27 werd met 30 procent en 40 procent verminderd in respectievelijk 10 nanomolair en 15 nanomolair HSP27-specifiek siRNA getransfecteerde cellen, vergeleken met controle siRNA getransfecteerde cellen. Bovendien werd de niet-gefosforyleerde HSP27-expressie met 20 procent en 30 procent verminderd in respectievelijk tien nanomolair en 15 nanomolair HSP27-specifiek siRNA getransfecteerde cellen. De door krassen geïnduceerde directionele wondtest wees erop dat 24 uur na het wonden HSP27-specifiek siRNA getransfecteerde cellen bij 10 en 15 nanomolair een verminderde migratie vertoonden.

Bovendien ondergingen HSP27-specifiek siRNA getransfecteerde HCEC's meer apoptotische en necrotische celdood vergeleken met de willekeurig gecontroleerd siRNA getransfecteerde cellen, zoals aangetoond door middel van flowcytometrie. Eens de RNA-transfectietechniek beheerst is, kan deze in 24 uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Na het volgen van deze procedures kan een aflevering zoals een slotmond worden gegenereerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de oorspronkelijke functie van Heat Shock Protein 27 bij wondgenezing van het hoornvliesepitheel.

Na het bekijken van deze video,