Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products
25 december 2016
Dit protocol beschrijft een scalpel loading-fluorescerende kleurstof overdracht techniek die intercellulaire communicatie meet door middel van gap junction kanalen. Spleetovergangen intercellulaire communicatie is een belangrijke cellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt onderhouden en verstoring van deze cell signaling heeft nadelige gevolgen voor de gezondheid.
Het algemene doel is om een eenvoudige test te bieden om gap junctional intercellulaire communicatie te meten door middel van een populatie van zoogdiercellen die kan dienen voor een breed scala aan in vitro farmacologische en toxicologische behoeften. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het toxicologieveld te beantwoorden, zoals of een verbinding de ontwikkeling of het onderhoud van een weefsel beïnvloedt, door het reguleren van gap junctional intercellulaire communicatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en snelle beoordeling van de gap junction-functie biedt in een grote populatie cellen als reactie op toxicanten en toxines.
Ajna Uzuni, een onderzoeksassistent op bachelorniveau uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om het experiment te beginnen, zaai drie keer 10 tot de vijfde WB-F344 rattenlever-epitheelcellen op 35 millimeter diameter kweekplaten die Eagle's gemodificeerd medium plus 5% foetaal runderserum bevatten. Kweek de cellen in een incubator totdat ze 100% confluentie bereiken en ga verder met de experimentele behandeling van de cellen.
Om door te gaan met dosis-responsexperimenten, voeg 10 microliter en 20 microliter toe van een eerder bereide, twee millimolaire stamoplossing van fenantreen in 100% acetonitril, en vier microliter, zes microliter en acht microliter van een 20 millimolair stamoplossing van fenantreen in 100% acetonitril toe aan drie platen cellen die twee milliliter groeimedium bevatten voor elke toegevoegde volume stamoplossing. Voeg vervolgens vier microliter, zes microliter, acht microliter, 10 microliter en 20 microliter van een 100%-oplossing van acetonitril toe aan drie platen cellen die twee milliliter groeimedium bevatten voor elke toegevoegde volume acetonitril-oplossing om als vehikelcontrole te dienen. Na het toevoegen van het acetonitril, incubeer de platen.
Om tijdresponsexperimenten uit te voeren, voeg zeven microliter van een 20 millimolair stamoplossing van fenantreen in 100% acetonitril toe aan drie platen cellen, die twee milliliter groeimedium bevatten voor elk tijdstip. Voeg vervolgens zeven microliter 100% acetonitril toe aan drie platen cellen, die twee milliliter groeimedium bevatten voor elk tijdstip, om als vehikelcontrole te dienen. Incubeer de platen voor elk aangegeven tijdstip.
Gooi het kweekmedium weg door het medium voorzichtig af te gieten. Spoel de cellen af met drie milliliter PBS, en decanteer of aspireer tussen spoelingen door. Pipetteer een milliliter van één milligram per milliliter lucifer geel kleurstof opgelost in PBS in elke celplaat.
Preload de kleurstof in de cellen door de scalpel tussen de wijsvinger en de duim te knijpen. Plaats de scalpel loodrecht op en vijf millimeter van de rand van de kweekplaat en gebruik vervolgens de zwaartekracht om de scalpel zachtjes te laten rollen van deze loodrechte hoek tot een hoek van 15 graden. Rol het mes door een populatie cellen in drie verschillende gebieden van de totale plaat.
Incubeer de cellen vervolgens drie minuten bij kamertemperatuur met de LY-oplossing. Decanteer of aspireer de LY en spoel de cellen af om alle extracellulaire kleurstof te verwijderen en extracellulaire achtergrondfluorescentie te elimineren. Voeg vervolgens 0,5 milliliter van een 4% fosfaat gebufferde formaline-oplossing toe om de cellen te fixeren.
Bekijk de gefixeerde cellen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop bij 200x vergroting. Lijn alle platen uit zodat de inkepingslijn parallel is aan het horizontale gezichtsveld. Een reeks SL-DT-afbeeldingen werd gegenereerd van WB-F344 rattenlever-epitheelcellen die werden behandeld met toenemende doses fenantreen.
De afname in lucifer geel fluorescerende kleurstofmigratie wordt veroorzaakt door toenemende doses fenantreen, wat de toenemende toxicant-geïnduceerde remming van gap junctional intercellulaire communicatie, of GJIC, aantoont. De fractie van de controle, of FOC-waarden, verkregen uit de SL-DT-afbeeldingen, werden gemiddeld, statistisch geanalyseerd en vervolgens geplot. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals western blots van enkele transductie-eiwitten worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden.
Zoals, activeren deze verbindingen mitogene gebeurtenissen van celperforatie?
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een scalpel-belastings-fluorescente kleurstofoverdrachtstechniek die intercellulaire communicatie door gap junction kanalen meet. Deze methode biedt een eenvoudige test om gap junctionele intercellulaire communicatie in zoogdiercellen te beoordelen, wat cruciaal is voor het begrijpen van weefselhomeostase.
Belangrijkste Onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Toxicologie
Achtergrond
- Gap junctionele intercellulaire communicatie is essentieel voor het handhaven van weefselhomeostase.
- Verstoring van deze communicatie kan leiden tot nadelige gezondheidseffecten.
- Deze techniek maakt een snelle beoordeling van gap junction functie mogelijk.
- Het kan worden toegepast in verschillende farmacologische en toxicologische studies.
Doel van het Onderzoek
- Om de effecten van verbindingen op gap junctionele intercellulaire communicatie te meten.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het beoordelen van weefselontwikkeling en onderhoud.
- Om onderzoek in toxicologie te vergemakkelijken met betrekking tot de impact van toxines op cellulaire communicatie.
Gebruikte Methoden
- Zaai WB-F344 rat lever epitheelcellen op kweekplaten.
- Kweek cellen tot 100% confluentie wordt bereikt.
- Pas experimentele behandelingen toe op de cellen.
- Gebruik fluorescente kleurstofoverdracht om intercellulaire communicatie te beoordelen.
Belangrijkste Resultaten
- De techniek maakt beoordeling van gap junction functie in grote celpopulaties mogelijk.
- Het biedt inzichten in hoe toxicanten intercellulaire communicatie beïnvloeden.
- Aangetoonde effectiviteit in verschillende in vitro studies.
- Snel en eenvoudig protocol verbetert de onderzoeksefficiëntie.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol hulpmiddel voor toxicologisch onderzoek.
- Het helpt bij het begrijpen van de rol van gap junctions in weefselgezondheid.
- Toekomstige studies kunnen de toepassingen ervan in de farmacologie uitbreiden.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Gap junctional intercellular communication (GJIC) serves as a functional biomarker for assessing tissue homeostasis disruption by toxicants and evaluating protective effects of natural products. The scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique enables rapid, population-level assessment of GJIC inhibition, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This assay provides predictive confidence for prioritizing compounds based on their impact on cellular communication pathways critical to organ function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking compound exposure to GJIC disruption as a mechanism of toxicity.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of intercellular channel activity in live cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying early biomarkers of adverse effects on tissue maintenance and homeostasis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline GJIC competence.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative dye transfer readouts amenable to automation and high-throughput imaging.
- Scalability: Adapted for in vivo tissue slices and amenable to automated fluorescence microscopy for increased sample throughput.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through conserved GJIC mechanisms across species.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from disrupted intercellular communication rather than off-target effects.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying structure-activity relationships in GJIC modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The SL-DT assay functions as a discovery-stage tool for mechanistic insight, positioned before lead optimization to filter compounds with high tissue disruption risk.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how toxicants or natural products alter intercellular signaling networks.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, population-based functional readouts that reflect tissue-level communication.
- Analytics: Generates fraction of control (FOC) values enabling statistical comparison across doses and time points.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by linking GJIC function to tissue integrity outcomes in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform across toxicology, pharmacology, and nutraceutical development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct functional readout of gap junction channel activity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via simple scalpel loading and fixed-endpoint imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking early GJIC disruption to downstream adverse tissue effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by identifying compounds that preserve intercellular communication homeostasis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescent dye handling, and epifluorescence microscopy.
- Depends on standardized scalpel technique and consistent incubation times for reliable dye transfer.
- Necessitates cross-team agreement on image analysis thresholds and morphometric parameters.
- Adaptable across mammalian cell types and tissue slices with optimization of loading and fixation parameters.
- Limited to assessing functional channel activity; does not distinguish between connexin expression, phosphorylation, or gating states.
