Name: Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Leer de scalpel loading-fluorescent dye transfer techniek om gap junctionele intercellulaire communicatie te meten in WB-F344 rat lever epitheelcellen. Deze methode biedt een snelle beoordeling van toxische effecten op weefselhomeostase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door NIEHS-subsidies #R01 ES013268-01A2, en de inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteur en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de NIEHS, en ondersteund door CETOCOEN UPgrade project Nr. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

Het protocol van deze studie werd goedgekeurd door de Animal Care en Utilization Comité van de National Institutes of Health Sciences van Japan, waar het in vivo experimenten werden uitgevoerd, om te verzekeren dat de ratten humaan en rekening houdend met verlichting van lijden behandeld. 1. SL-DT Bioassay <ol><li> Seed 3 x 10 5 WB-F344 rat lever epitheelcellen op 35 mm diameter cultuur platen met Eagles gemodificeerd medium plus 5% foetaal runderserum, en de cultuur van de cellen in een incubator bij 37 ° C, 100% relatieve vochtigheid (RH), 5% CO 2. </li><li> De cellen te kweken totdat ze 100% confluentie (typisch 2 dagen) en leidt de gewenste experimentele behandeling van de cellen, zoals hieronder beschreven. <ol><li> Gedrag dosis-respons experimenten <ol><li> Voeg 10 ul en 20 ul van een 2 mM voorraadoplossing van fenantreen in 100% acetonitril en 4 pl, 6 ul en 8 pl van een 20 mM voorraadoplossing van phenantype threen in 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium voor elke toegevoegde hoeveelheid voorraadoplossing. </li><li> Voeg 4 pi, pi 6, 8 ul, 10 ul en 20 ul van een 100% &#39;s oplossing van acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium voor elk toegevoegd volume acetonitril-oplossing om te dienen als controle voertuig. </li><li> Incubeer de platen gedurende 15 minuten in een incubator ingesteld op 37 ° C, 100% relatieve vochtigheid en 5% CO2. </li><li> Ga verder met stap 1.3. </li></ol></li><li> Conduct Time Response Experimenten <ol><li> Voeg 7 pl van een 20 mM voorraadoplossing van fenantreen in 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium voor elk tijdstip (dat wil zeggen, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min). </li><li> Voeg 7 pl 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium voor elk tijdstip te dienen als dragercontrole. </li><li> Incubeer de platen voor elke aangewezen tijd pGemengd in een incubator bij 37 ° C, 100% relatieve vochtigheid en 5% CO2. </li><li> Ga verder met stap 1.3. </li></ol></li><li> Gedrag Time Recovery Experimenten <ol><li> Voeg 7 pl van een 20 mM voorraadoplossing van fenantreen in 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium voor 15 min. </li><li> Voeg 7 pl 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium gedurende 15 min om te dienen als controle voertuig. </li><li> Decanteren het medium dat hetzij de fenantreen of acetonitril en spoel 3x met elk 3 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Voeg 2 ml vers kweekmedium aan elke plaat en incubeer de gewenste hersteltijden (bijvoorbeeld 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) in een incubator bij 37 ° C, 100 % RH en 5% CO2. </li><li> Ga verder met stap 1.3. </li></ol></li><li> Conduct Mechanism Experimenten <ol><li> Voeg de signaaltransductie remmer, namelijk </em&gt;, 5 ui van een 20 mM voorraadoplossing van D609 in 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium voor 15 min. </li><li> Voeg 5 ul 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium gedurende 15 min om te dienen als controle voertuig. </li><li> Voeg 7 pl van een 20 mM voorraadoplossing van fenantreen in 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium plus de D609 gedurende nog 15 min. </li><li> Voeg 7 pl 100% acetonitril drie platen van cellen met 2 ml groeimedium plus 100% acetonitril gedurende nog 15 min om te dienen als controle voertuig. </li><li> Ga verder met stap 1.3. </li></ol></li></ol></li><li> Gooi het kweekmedium door een van beide voorzichtig afgieten van het medium of door middel van vacuüm zuigen. Opmerking: Gooi kweekmedium dat gevaarlijk afval op de juiste wijze. </li><li> Spoel de cellen drie keer met elk 3 ml PBS en ofwel decant of aspireren between spoelt. </li><li> Pipetteer 1 ml van 1 mg / ml Lucifer Yellow kleurstof opgelost in PBS (LY) in elke cel plaat. </li><li> Voorspanning de kleurstof in de cellen door glooiende een # 20 chirurgisch lemmet met een afgeronde rand door een populatie van cellen in drie verschillende gebieden van de plaat. <ol><li> Begin met het plaatsen van de scalpel loodrecht (90 °) en 5 mm van de rand van de kweekplaat, en draai de scalpel van deze loodrechte hoek over een hoek van 15 ° (zie figuur 1). Let op: Dit wordt bereikt door het afklemmen van de scalpel tussen de wijsvinger en duim. Gebruik de zwaartekracht om de scalpel zachtjes gaan van 90 ° tot 15 ° positie (de ronde blad gewoon rolt over de cellen). Deze beweging zal een visueel waarneembaar inspringen lijn te verlaten. </li></ol></li><li> Incubeer de cellen met de LY oplossing gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Decanteren of zuig het LY en spoel drie keer met 3 ml PBS om alle extrace verwijderenllular verven om extracellulaire achtergrondfluorescentie elimineren. </li><li> Voeg 0,5 ml van 10% fosfaat gebufferde formaline oplossing om de cellen te repareren. Opmerking: Na de vaststelling in formaline, de lucht drogen de cellen en op te slaan in het donker voor maximaal twee jaar met een minimale fotobleken van de LY kleurstof. Indien vereist, hydrateren met 10% formaline oplossing voor de fluorescente kleurstof voorkant visualiseren. </li><li> Bekijk de gefixeerde cellen met een epifluorescentie microscoop voorzien van een dichroïsche kubus voor excitatie / emissie pieken van 428/536 nm bij een vergroting van 200X. Lijn alle platen zodat de inkeping evenwijdig aan het horizontale gezichtsveld. Opmerking: Een FITC dichroïsche kubus werkt goed. <ol><li> Leg het beeld met een CCD-camera en ondersteunende software. <ol><li> Open de ondersteunende software voor de CCD-camera en de instellingen voor automatische belichting. Gebruik de &quot;capture&quot; knop om het beeld digitaal te verwerven. Sla de afbeelding als .tif-bestanden met de knop &quot;Opslaan&quot;. </li></ol&gt; </li></ol></li></ol> 2. Aanpassing van de SL-DT Assay aan leverweefsel <ol><li> Verwijder ongeveer een cm slice 2 x 2 van de linker kwab van een lever van een 5 weken oude, mannelijke Fischer 344 rat met behulp van dissectie schaar en plaats het op een plastic weeg plaat bedekt met natte gaas 12. </li><li> Pipetteer 0,5 ml van een PBS oplossing bevattende 1 mg / ml van zowel lucifer geel en rhodamine-dextran (RD) op het oppervlak van het deel lever in de kunststof plaat te wegen. Opmerking: De RD is een kleurstof die niet kan verplaatsen gap junction kanalen en de cellen die waren geplaatst markering. </li><li> Voeg 4:57 insnijdingen ongeveer 1 cm op het oppervlak van de lever segment dat de kleurstofoplossing in de weging plaat met een scherp mes heeft en voeg extra kleurstof voldoende om de insnijdingen vullen. </li><li> Incubeer het weefsel gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur op de kunststof plaat weegt. </li><li> Spoel driemaal met 5 ml PBS. </li><li> Bevestig het weefsel overnight in 30 ml 10% fosfaatgebufferde formaline in een 50 ml conische centrifugebuis in het donker bij kamertemperatuur. </li><li> De volgende dag was de plakjes met water, versiering weefsel rond de incisie met dissectie scharen in 1 x 1 x 0,5 cm 3 opgehaald en standaardtechnieken gebruiken om de segmenten te bedden in paraffine 13. </li><li> Section de plakken loodrecht op de incisie lijn dikte van 5 pm en de monsters op te slaan in het donker totdat klaar om te worden afgebeeld met behulp van standaard technieken snijden met een microtoom 13. </li><li> Gebruik een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD camera te visualiseren en vastleggen van de beelden van de fluorescerende kleurstof fronten volgens paragraaf 7 1,10. </li></ol> 3. kwantificeren GJIC <ol><li> Meet de fluorescerende kleurstof spread met behulp van een morfometrische softwarepakket (bijvoorbeeld ImageJ). <ol><li> Klik op het tabblad &quot;File&quot; en vervolgens op &quot;open&quot; om het te openenopgeslagen beeld. </li><li> Klik op de &quot;Free Hand Tool&quot; in de werkbalk Tab om de omtrek van de kleurstof voorkant traceren. </li><li> Klik op het tabblad &quot;Analyseren&quot; en vervolgens op &quot;Measure&quot;. Opmerking: Dit zal een gebied waarde in een spread sheet, die desgewenst kan worden gekopieerd naar andere spreadsheet programma&#39;s te genereren. </li></ol></li><li> Met behulp van een spreadsheetprogramma, berekenen de fractie van de controle (FOC) van het gebied van de kleurstof verspreid in de experimentele plaat door het oppervlak de kleurstof gereisd in de stuurplaat met de volgende formule te delen: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54281/54281equation1.jpg" /> Een e = oppervlakte van de kleurstof spreiding in cellen blootgesteld aan een experimentele variabele, zoals cellen behandeld met een chemisch op een specifieke dosis of tijd A c = oppervlakte van de kleurstof verspreid in de controle, die cellen die met het voertuiginterieur de chemische ontbinding plaats zijn Opmerking: Om het effect van het voertuig te bepalen,Een e zou het gebied van de kleurstof spreiding in cellen behandeld door het voertuig en A c zou het gebied van de kleurstof spreiding in cellen die niet behandeld door het voertuig. Het effect van het voertuig bij voorkeur minder dan 10% bedragen. </li></ol>

<ol><li>Rotroff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+endocrine+testing+in+the+21st+century+using+in+vitro+assays+of+estrogen+receptor+signaling+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Sci.Technol%22%5BJournal%5D)">Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses.</a> Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).</li>
<li>Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+the+complexity+of+communication%3A+regulation+of+gap+junctions+by+post-translational+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification.</a> Front Pharmacol. 4, 130(2013).</li>
<li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Compr.Physiol%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Sovadinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+specific+PLC-induced+dysregulation+of+gap+junctions%2C+a+robust+cellular+response+to+environmental+toxicants%2C+and+prevention+by+resveratrol+in+a+rat+liver+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model.</a> PLoS.One. 10 (5), e0124454(2015).</li>
<li>Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrosko%2C+JE+%22Biologically+Based+Methods+for+Cancer+Risk+Assessment%22">Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment</a>. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).</li>
<li>Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrosko%2C+JE+%22Biomarkers+and+occupational+health%3A+progess+and+perspectives%22">Biomarkers and occupational health: progess and perspectives</a>. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).</li>
<li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+integrative+signaling+through+gap+junctions+in+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Protoc.Toxicol%22%5BJournal%5D)">Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology.</a> Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).</li>
<li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins+and+their+channels+in+cell+growth+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Signal%22%5BJournal%5D)">Connexins and their channels in cell growth and cell death.</a> Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).</li>
<li>Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-follicle+cell+gap+junctions+in+Xenopus+laevis+and+the+effects+of+gonadotropin+on+their+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability.</a> Science. 203 (4376), 182-183 (1979).</li>
<li>El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-loading+and+dye+transfer.+A+rapid+and+simple+technique+to+study+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication.</a> Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).</li>
<li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+photobleaching+assay+of+gap+junction-mediated+communication+between+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells.</a> Science. 232 (4749), 525-528 (1986).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).</li>
<li>Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , <a target="_blank" href="http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue">http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue</a> (2012).</li>
<li>Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+biological+%26%2334%3BRosetta+stone%26%2334%3B+in+understanding%2C+in+a+systems+biological+manner%2C+stem+cell+behavior%2C+mechanisms+of+epigenetic+toxicology%2C+chemoprevention+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gap junctional intercellular communication as a biological &#34;Rosetta stone&#34; in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy.</a> J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).</li>
<li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulated+gap+junctional+intercellular+communication+as+a+biomarker+of+PAH+epigenetic+toxicity%3A+structure-function+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship.</a> Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+promoting+properties+of+a+cigarette+smoke+prevalent+polycyclic+aromatic+hydrocarbon+as+indicated+by+the+inhibition+of+gap+junctional+intercellular+communication+via+phosphatidylcholine-specific+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase.</a> C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).</li>
<li>Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+the+down-regulation+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+green+tea+in+the+liver+of+mice+fed+pentachlorophenol%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol.</a> Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).</li>
<li>Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+is+dependent+on+the+chain+length+of+the+fluorinated+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail.</a> Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).</li>
<li>Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrosko%2C+JE+%22Contrib+Microbiol%22">Contrib Microbiol</a>. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).</li>
<li>Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cells+as+targets+for+the+aging+and+diseases+of+aging+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes.</a> Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).</li>
<li>JE, T. rosko <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJE%2C+Trosko+%22Stem+Cells+and+Cancer%22">Stem Cells and Cancer</a>. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).</li>
<li>Osgood, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycyclic+aromatic+hydrocarbon-induced+signaling+events+relevant+to+inflammation+and+tumorigenesis+in+lung+cells+are+dependent+on+molecular+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure.</a> PLoS. One. 8 (6), e65150(2014).</li>
<li>Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bay+or+baylike+regions+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+were+potent+inhibitors+of+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication.</a> Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).</li>
<li>Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+metabolic+cooperation+in+Chinese+hamster+cells+by+a+tumor+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter.</a> Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+caged+coumarin+fluorophores+with+extraordinary+uncaging+cross+sections+suitable+for+biological+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).</li>
<li>Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pre-loading+method+of+evaluating+gap+junctional+communication+by+fluorescent+dye+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer.</a> Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).</li>
<li>Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+stretch+enhances+gap+junctional+communication+between+osteoblastic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells.</a> J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De SL-DT-test is een eenvoudige en veelzijdige techniek in het meten van GJIC, maar er zijn een aantal kritische problemen die moeten worden verwerkt in het ontwerp van de juiste experimentele protocollen. Voor robuuste meting van GJIC de SL-DT-test moet een goede spreiding van de kleurstof LY doorgangsgat verbindingspunten van de cellen. Minimaal moet een voldoende tijd worden gekozen om te verzekeren dat de kleurstof verspreidt via acht of meer rijen cellen van de scalpel beladen cellen in beide richtingen. Ook voor h...

Het algemene doel van deze werkwijze is een eenvoudig uitgebreid en relatief goedkope techniek om de potentiële toxiciteit van verbindingen te beoordelen. Dit is een in vitro benadering die kan worden gebruikt op diverse cellijnen. Standard celbiologie labs uitgerust met epifluorescentie microscopen kunnen onderzoeken met behulp van deze test. Onze basiskennis van celfuncties is sterk afhankelijk van de in vitro bioassays geweest, en is een essentieel onderdeel in de toxicologische beoordeling van geneesmiddelen, milieuverontreinigende stoffen, en voedsel geboren verontreinigingen worden. Helaas is er geen enkele in vitro bioassay systeem dat volledig kan voldoen aan de eisen voor alle toxicologische evaluaties. Veel in vitro assays zijn ontworpen voor optimale en evaluatie uitgevoerd van een specifieke biochemische of moleculaire eindpunt. Deze worden vaak gecombineerd in een high throughput opgezet om een ​​verstoring van een weerspiegelingbepaalde signaaltransductieroute, zoals oestrogeen-receptor signalering 1. Deze strategie is zeer succesvol geweest, maar het grote aantal signaaltransductie routes betrokken bij genexpressie maakt de taak van het kiezen van een specifieke signaleringsroute vrij complex te beoordelen. Hoge doorzet protocollen worden momenteel ontwikkeld en gebruikt voor het gelijktijdig meten tal signaalwegen, welke benadering aantal beperkingen van enkele assays overwinnen is. Echter, niet alle signaalwegen zijn met succes geïntegreerd in meer omvattende aanpak, plus nieuwe signaalwegen worden voortdurend ontdekt dat verder compliceert dit evaluatieproces. Met behulp van uitgebreide aantallen in vitro benaderingen, met name high-throughput systemen, voor een uitgebreide toxicologische evaluaties zijn ook erg duur en zijn niet bevorderlijk voor de meeste alleenstaande onderzoeker leidde onderzoeksprojecten. GJIC is een proces tigHTLV gecontroleerd door veranderingen in spanning, calciumconcentratie, pH, redox balans, gereguleerd door de grote intracellulaire signaaltransductie en interacties met membraan en cytoskelet eiwitten 2,3. Aldus kan remming van GJIC tijdens verschillende soorten cellulaire stress, verstoring van verschillende cellulaire functies of verstoringen verschillende signaaltransductiewegen. Een andere benadering voor het gebruik van beperkte signaaltransductie bioassays overwinnen is om te profiteren van de biologische verschijnselen dat vele, zo niet de meeste, signaaltransductiewegen worden verder door coöperatieve intercellulaire signaleringssystemen gemoduleerde doorgangsgat junction kanalen 4-8. Hoewel intercellulaire signalering systemen zijn ook talrijk en onder meervoudige traject controle, de intercellulaire signalering doorgangsgat junction kanalen is uiteindelijk afhankelijk van de kanalen worden geopend, gedeeltelijk gesloten of volledig gesloten. Dit verschaft een eindpunt dat gemakkelijk kan worden gemeten met verschillendein vitro bioassay systemen 7. Gezien het feit dat de homeostatic setpunt van een weefsel vereist open kanalen, het bepalen van het effect van verbindingen op spleetovergangen intercellulaire communicatie (GJIC) is een meer integrale aanpak bij het vaststellen van mogelijke toxische effecten van verbindingen 4,8. In wezen is dit kritieke biologische verschijnsel dat coördineert de verschillende signaaltransductie gebeurtenissen genexpressie controleren speelt maakt een brede beoordeling van toxische effecten. Zo bioassays dat GJIC beoordelen zijn een uitstekend uitgangspunt om de toxische potentieel van verbindingen te evalueren. De meest uitgebreide technieken om GJIC beoordelen op basis voorladen cellen met een fluorescerende probe en bewaken van de migratie van de kleurstof uit de geladen cel of cellen aan aangrenzende cellen. Technieken om de kleurstof voorspanning betrokken microinjectie 9, schrapen laden 10 en methylesters van de sondes 11 </sup&gt;. Scalpel loading fluorescerende kleurstofoverdracht (SL-DT) methode is een modificatie van het schrapen belasting - kleurstofoverdrachtinhibiterende assay ontwikkeld door El Fouly 10. Plaats van de meer invasieve schrapen, het scalpel laadmethode van dit rapport omvat een zachte rol van een scalpel met een rond mes door een monolaag van cellen die invasieve schade te beperken (Figuur 1). De voordelen van deze techniek zijn de toxicologische beoordeling van een populatie van cellen in plaats van enkele cellen van de micro-injectie assay. Bovendien is de eenvoud van deze test zorgt voor een snelle detectie van meerdere platen in een korte tijd dat de methodes behulp van micro-injectie technieken en technieken die methylesters van fluorescerende probes zijn aanzienlijk tijdrovend en vereisen veel hoger niveau. Hoewel er geen enkele methode om aan alle behoeften van het bestuderen van GJIC te voldoen; de SL-DT test is een eenvoudige, relatief goedkoop en veelzijdig test die kanvoldoen aan veel van de behoeften aan initiële beoordeling van de toxiciteit van verschillende verbindingen. Belangrijkste voordelen zijn: eenvoud, geen bijzondere noodzaak voor apparatuur of vaardigheden die vereist zijn voor andere werkwijzen zoals microinjectie, fluorescent herstel na fotobleken (FRAP) test en lokale activering van moleculaire fluorescente probe assays, snelle en simultane evaluatie van GJIC in een grote aantal cellen, bevorderlijk voor een hoge doorvoer opstelling met geautomatiseerde fluorescentie microscopie beeldvorming en analyse, en de aanpasbaarheid voor in vivo studies.

<table><tbody><tr><td>WB-F344 rat lever epitheelcellen</td><td>Van Drs. J. W. Grisham en M. S. Tsao van de University of North Carolina (Chapel Hill, NC)</td><td>geen</td><td>Verstrekt door Drs. J. W. Grisham en M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC</td></tr><tr><td>35 mm kweekplaten</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 kweekkolven</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kweekkolven</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>D-medium, een Eagles gemodificeerd medium&nbsp;</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>Formule Nr. 78-5470EF</td><td></td></tr><tr><td>foetaal bovien serum</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>15050</td><td></td></tr><tr><td>fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>zelfgemaakt</td><td>zie hieronder voor ingredient cat#'s</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3819--01</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, lithiumzout</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>rodamine-dextran</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>1-methylantraceen</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fenantreen</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>P11409</td><td></td></tr><tr><td>resveratrol</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>R5010</td><td></td></tr><tr><td>D609</td><td>Tocris Bioscience&nbsp;</td><td>1437</td><td></td></tr><tr><td>acetonitril</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde oplossing</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>#20 chirurgische kling</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10317-14</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische steriele buisjes</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Nikon epifluorescentiemicroscoop&nbsp;</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>Nikon FITC dichroic kubus</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>96107</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Nikon Cool Snap EZ CCD</td><td></td></tr><tr><td>beeldvormingssysteem</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Nikon NIS-Elements F2.2 beeldvormingssysteem.</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

gap junctionele intercellulaire communicatie: een functionele biomarker om de negatieve gevolgen van de giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van natural products

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Dit protocol beschrijft een scalpel loading fluorescerende kleurstofoverdracht (SL-DT) techniek die intercellulaire communicatie via gap junction kanalen, die een belangrijke intracellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt gehandhaafd meet. Onderbreking van spleetovergangen intercellulaire communicatie (GJIC) van gifstoffen, toxines, geneesmiddelen, enz. Is gekoppeld aan talrijke nadelige gezondheidseffecten. Veel genetisch bepaalde menselijke ziekten zijn verbonden met mutaties in gap junction genen. De SL-DT techniek is een eenvoudige functionele test voor de gelijktijdige beoordeling van GJIC in een grote populatie van cellen. De bepaling omvat voorspaninrichting cellen met een fluorescente kleurstof door kort verstoren de celmembraan met een scalpel door een populatie cellen. De fluorescerende kleurstof wordt vervolgens door mogen steken gap junction kanalen naar naburige cellen gedurende een bepaalde tijd. De assay wordt vervolgens beëindigd door de toevoeging van formaline aan de cellen. De verspreiding van de fluorescent kleurstof door middel van een populatie van cellen wordt beoordeeld met een epifluorescentiemicroscoop en de beelden worden geanalyseerd met een aantal morfometrische software pakketten die beschikbaar zijn, zoals gratis software pakketten te vinden op het publieke domein. Deze test is ook aangepast voor in vivo studies met weefselcoupes van verschillende organen van de behandelde dieren. Globaal kan de SL-DT assay een groot aantal in vitro farmacologische en toxicologische behoeften te dienen, en kan eventueel aangepast worden voor high throughput opzet systemen met geautomatiseerde fluorescentie microscopie beeldvorming en analyse om meer monsters te ontrafelen in een kortere tijd.

Onderbreking van GJIC wordt veelvuldig gebruikt als een biomarker voor het identificeren van giftige stoffen in de niet genotoxische, epigenetische niveau van gen-controle die nadelige gevolgen 14 gezondheid veroorzaakt. Bijvoorbeeld polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK&#39;s) zijn alom verontreinigingen van het milieu, maar variëren in hun epigenetische toxiciteit als functie van hun moleculaire structuren 15. Het lagere moleculair gewicht PAK&#39;s zijn...

Dit protocol beschrijft een scalpel loading-fluorescerende kleurstof overdracht techniek die intercellulaire communicatie meet door middel van gap junction kanalen. Spleetovergangen intercellulaire communicatie is een belangrijke cellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt onderhouden en verstoring van deze cell signaling heeft nadelige gevolgen voor de gezondheid.

Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Het algemene doel is om een eenvoudige test te bieden om gap junctional intercellulaire communicatie te meten door middel van een populatie van zoogdiercellen die kan dienen voor een breed scala aan in vitro farmacologische en toxicologische behoeften. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het toxicologieveld te beantwoorden, zoals of een verbinding de ontwikkeling of het onderhoud van een weefsel beïnvloedt, door het reguleren van gap junctional intercellulaire communicatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en snelle beoordeling van de gap junction-functie biedt in een grote populatie cellen als reactie op toxicanten en toxines.Ajna Uzuni, een onderzoeksassistent op bachelorniveau uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om het experiment te beginnen, zaai drie keer 10 tot de vijfde WB-F344 rattenlever-epitheelcellen op 35 millimeter diameter kweekplaten die Eagle's gemodificeerd medium plus 5% foetaal runderserum bevatten. Kweek de cellen in een incubator totdat ze 100% confluentie bereiken en ga verder met de experimentele behandeling van de cellen.Om door te gaan met dosis-responsexperimenten, voeg 10 microliter en 20 microliter toe van een eerder bereide, twee millimolaire stamoplossing van fenantreen in 100% acetonitril, en vier microliter, zes microliter en acht microliter van een 20 millimolair stamoplossing van fenantreen in 100% acetonitril toe aan drie platen cellen die twee milliliter groeimedium bevatten voor elke toegevoegde volume stamoplossing. Voeg vervolgens vier microliter, zes microliter, acht microliter, 10 microliter en 20 microliter van een 100%-oplossing van acetonitril toe aan drie platen cellen die twee milliliter groeimedium bevatten voor elke toegevoegde volume acetonitril-oplossing om als vehikelcontrole te dienen. Na het toevoegen van het acetonitril, incubeer de platen.Om tijdresponsexperimenten uit te voeren, voeg zeven microliter van een 20 millimolair stamoplossing van fenantreen in 100% acetonitril toe aan drie platen cellen, die twee milliliter groeimedium bevatten voor elk tijdstip. Voeg vervolgens zeven microliter 100% acetonitril toe aan drie platen cellen, die twee milliliter groeimedium bevatten voor elk tijdstip, om als vehikelcontrole te dienen. Incubeer de platen voor elk aangegeven tijdstip.Gooi het kweekmedium weg door het medium voorzichtig af te gieten. Spoel de cellen af met drie milliliter PBS, en decanteer of aspireer tussen spoelingen door. Pipetteer een milliliter van één milligram per milliliter lucifer geel kleurstof opgelost in PBS in elke celplaat.Preload de kleurstof in de cellen door de scalpel tussen de wijsvinger en de duim te knijpen. Plaats de scalpel loodrecht op en vijf millimeter van de rand van de kweekplaat en gebruik vervolgens de zwaartekracht om de scalpel zachtjes te laten rollen van deze loodrechte hoek tot een hoek van 15 graden. Rol het mes door een populatie cellen in drie verschillende gebieden van de totale plaat.Incubeer de cellen vervolgens drie minuten bij kamertemperatuur met de LY-oplossing. Decanteer of aspireer de LY en spoel de cellen af om alle extracellulaire kleurstof te verwijderen en extracellulaire achtergrondfluorescentie te elimineren. Voeg vervolgens 0,5 milliliter van een 4% fosfaat gebufferde formaline-oplossing toe om de cellen te fixeren.Bekijk de gefixeerde cellen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop bij 200x vergroting. Lijn alle platen uit zodat de inkepingslijn parallel is aan het horizontale gezichtsveld. Een reeks SL-DT-afbeeldingen werd gegenereerd van WB-F344 rattenlever-epitheelcellen die werden behandeld met toenemende doses fenantreen.De afname in lucifer geel fluorescerende kleurstofmigratie wordt veroorzaakt door toenemende doses fenantreen, wat de toenemende toxicant-geïnduceerde remming van gap junctional intercellulaire communicatie, of GJIC, aantoont. De fractie van de controle, of FOC-waarden, verkregen uit de SL-DT-afbeeldingen, werden gemiddeld, statistisch geanalyseerd en vervolgens geplot. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals western blots van enkele transductie-eiwitten worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden.Zoals, activeren deze verbindingen mitogene gebeurtenissen van celperforatie?

gap-junctional-intercellular-communication-functional-biomarker-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

We beschrijven hier hoe je een eencellige micro-injectie van Lucifer Yellow uit te voeren om cellulaire communicatie via gap-junctions te visualiseren in levende cellen, en een aantal nuttige tips. We verwachten dat dit artikel iedereen zal helpen om de mate van cellulaire koppeling te evalueren door functionele gap junctions. Alles hier beschreven kan zijn, in principe, aangepast aan andere fluorescente kleurstoffen met een molecuulgewicht onder 1000 Dalton.

Eencellige micro-injectie voor mobiele Communicatie Analyse

Deze presentatie demonstreert een methode waarbij elektroporatie van adherante, gekweekte cellen wordt gebruikt voor het bestuderen van intercellulaire, junctionele communicatie, terwijl de cellen groeien op een plaatje dat bedekt is met geleidend en transparant indium-tinoxide.

Een functionele test voor Gap Junctionele Onderzoek; Elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide

Verbeterde in vitro neurotoxiciteitstesten zouden helpen bij het identificeren van nieuwe neuroprotectieve verbindingen. De bruikbaarheid van een real-time impedantie-gebaseerde celanalysator om cytotoxiciteit en cytoprotectie in neuronale cellijnen te bepalen en om de betrokkenheid van tweede boodschapperroutes te bepalen, waardoor inzicht wordt verkregen in het mechanisme van neuroprotectie, wordt gepresenteerd.

Real-Time Impedantie-gebaseerde Cell Analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en Neuroprotectie in een neuronale cellijn,

De protocollen beschrijven twee in vitro ontwikkelingstoxiciteit testsystemen (UKK en UKN1) op basis van menselijke embryonale stamcellen en transcriptoom studies. De testsystemen voorspellen mens ontwikkelingsstoornissen giftigheidsgevaar, en kunnen bijdragen aan dierproeven, de kosten en de tijd die nodig is voor de chemische veiligheid testen te verminderen.

Pluripotente menselijke stamcellen Gebaseerd Ontwikkelingstoxiciteit Testen voor Chemical Safety Screening and Systems Biology gegevens Generation

Onderzoek naar vroege migratie van endotheelcellen (EEC) is belangrijk om de pathofysiologie van bepaalde ziekten te begrijpen en om mogelijk nieuwe strategieën voor therapeutische interventie te identificeren. Het volgende protocol beschrijft technieken om celmigratie te beoordelen die zijn aangepast voor het onderzoek van EEC.

Beoordeling van endotheelcelmigratie na blootstelling aan giftige chemische stoffen

Hier presenteren we een protocol voor een roman gap junction intercellulaire communicatie assay ontworpen voor de high-throughput screening van gap junction-modulerende chemicaliën voor drugontdekking en toxicologische beoordeling.

Een jodide-geel fluorescerende eiwit-Gap Junction-intercellulaire communicatie Assay

Hier presenteren we een op mechanica gebaseerd protocol om de gap junction connexin 43 te verstoren en de daaropvolgende impact te meten die dit heeft op endotheliale biomechanica via observatie van tracties en intercellulaire spanningen.

Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring

Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.

High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

Een dissectie techniek voor het verwijderen van de dentate gyrus van volwassen muis onder een stereomicroscoop werd aangetoond in deze video opgenomen protocol.

Dissectie van de hippocampus dentate gyrus van de volwassen muis

Leer de scalpel loading-fluorescent dye transfer techniek om gap junctionele intercellulaire communicatie te meten in WB-F344 rat lever epitheelcellen. Deze methode biedt een snelle beoordeling van toxische effecten op weefselhomeostase.

Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products (Video) | JoVE Journal

Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products

Meer video's verkennen