Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products
25 december 2016
Dit protocol beschrijft een scalpel loading-fluorescerende kleurstof overdracht techniek die intercellulaire communicatie meet door middel van gap junction kanalen. Spleetovergangen intercellulaire communicatie is een belangrijke cellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt onderhouden en verstoring van deze cell signaling heeft nadelige gevolgen voor de gezondheid.
Het algemene doel is om een eenvoudige test te bieden om gap junctional intercellulaire communicatie te meten door middel van een populatie van zoogdiercellen die kan dienen voor een breed scala aan in vitro farmacologische en toxicologische behoeften. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het toxicologieveld te beantwoorden, zoals of een verbinding de ontwikkeling of het onderhoud van een weefsel beïnvloedt, door het reguleren van gap junctional intercellulaire communicatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en snelle beoordeling van de gap junction-functie biedt in een grote populatie cellen als reactie op toxicanten en toxines.
Ajna Uzuni, een onderzoeksassistent op bachelorniveau uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om het experiment te beginnen, zaai drie keer 10 tot de vijfde WB-F344 rattenlever-epitheelcellen op 35 millimeter diameter kweekplaten die Eagle's gemodificeerd medium plus 5% foetaal runderserum bevatten. Kweek de cellen in een incubator totdat ze 100% confluentie bereiken en ga verder met de experimentele behandeling van de cellen.
Om door te gaan met dosis-responsexperimenten, voeg 10 microliter en 20 microliter toe van een eerder bereide, twee millimolaire stamoplossing van fenantreen in 100% acetonitril, en vier microliter, zes microliter en acht microliter van een 20 millimolair stamoplossing van fenantreen in 100% acetonitril toe aan drie platen cellen die twee milliliter groeimedium bevatten voor elke toegevoegde volume stamoplossing. Voeg vervolgens vier microliter, zes microliter, acht microliter, 10 microliter en 20 microliter van een 100%-oplossing van acetonitril toe aan drie platen cellen die twee milliliter groeimedium bevatten voor elke toegevoegde volume acetonitril-oplossing om als vehikelcontrole te dienen. Na het toevoegen van het acetonitril, incubeer de platen.
Om tijdresponsexperimenten uit te voeren, voeg zeven microliter van een 20 millimolair stamoplossing van fenantreen in 100% acetonitril toe aan drie platen cellen, die twee milliliter groeimedium bevatten voor elk tijdstip. Voeg vervolgens zeven microliter 100% acetonitril toe aan drie platen cellen, die twee milliliter groeimedium bevatten voor elk tijdstip, om als vehikelcontrole te dienen. Incubeer de platen voor elk aangegeven tijdstip.
Gooi het kweekmedium weg door het medium voorzichtig af te gieten. Spoel de cellen af met drie milliliter PBS, en decanteer of aspireer tussen spoelingen door. Pipetteer een milliliter van één milligram per milliliter lucifer geel kleurstof opgelost in PBS in elke celplaat.
Preload de kleurstof in de cellen door de scalpel tussen de wijsvinger en de duim te knijpen. Plaats de scalpel loodrecht op en vijf millimeter van de rand van de kweekplaat en gebruik vervolgens de zwaartekracht om de scalpel zachtjes te laten rollen van deze loodrechte hoek tot een hoek van 15 graden. Rol het mes door een populatie cellen in drie verschillende gebieden van de totale plaat.
Incubeer de cellen vervolgens drie minuten bij kamertemperatuur met de LY-oplossing. Decanteer of aspireer de LY en spoel de cellen af om alle extracellulaire kleurstof te verwijderen en extracellulaire achtergrondfluorescentie te elimineren. Voeg vervolgens 0,5 milliliter van een 4% fosfaat gebufferde formaline-oplossing toe om de cellen te fixeren.
Bekijk de gefixeerde cellen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop bij 200x vergroting. Lijn alle platen uit zodat de inkepingslijn parallel is aan het horizontale gezichtsveld. Een reeks SL-DT-afbeeldingen werd gegenereerd van WB-F344 rattenlever-epitheelcellen die werden behandeld met toenemende doses fenantreen.
De afname in lucifer geel fluorescerende kleurstofmigratie wordt veroorzaakt door toenemende doses fenantreen, wat de toenemende toxicant-geïnduceerde remming van gap junctional intercellulaire communicatie, of GJIC, aantoont. De fractie van de controle, of FOC-waarden, verkregen uit de SL-DT-afbeeldingen, werden gemiddeld, statistisch geanalyseerd en vervolgens geplot. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals western blots van enkele transductie-eiwitten worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden.
Zoals, activeren deze verbindingen mitogene gebeurtenissen van celperforatie?
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een techniek voor het laden van een scalpel met fluorescerende kleurstof voor overdracht, waarmee intercellulaire communicatie via gap-junctionkanalen wordt gemeten. Deze methode biedt een eenvoudige assay om de intercellulaire communicatie via gap-junctions in zoogdiercellen te beoordelen, wat essentieel is voor het begrijpen van weefselhomeostase.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Toxicologie
Achtergrond
- Intercellulaire communicatie via gap junctions is essentieel voor het behoud van de weefselhomeostase.
- Verstoring van deze communicatie kan leiden tot nadelige gezondheidseffecten.
- Deze techniek maakt een snelle beoordeling van de gap junction-functie mogelijk.
- Het kan worden toegepast in diverse farmacologische en toxicologische studies.
Doel van de studie
- Om de effecten van verbindingen op de intercellulaire communicatie via gap junctions te meten.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het beoordelen van weefselontwikkeling en -onderhoud.
- Om onderzoek in de toxicologie te faciliteren met betrekking tot de impact van toxinen op cellulaire communicatie.
Gebruikte methoden
- Zaai epitheelcellen uit de lever van WB-F344 ratten uit op kweekplaten.
- Kweek de cellen tot een confluentie van 100% is bereikt.
- Pas de experimentele behandelingen toe op de cellen.
- Maak gebruik van fluorescente kleurstofoverdracht om de intercellulaire communicatie te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt het mogelijk om de functie van gap junctions in grote celpopulaties te beoordelen.
- Het biedt inzicht in hoe toxicanten de intercellulaire communicatie beïnvloeden.
- Aangetoonde effectiviteit in diverse in vitro studies.
- Een snel en eenvoudig protocol verhoogt de efficiëntie van het onderzoek.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol instrument voor toxicologisch onderzoek.
- Het helpt bij het begrijpen van de rol van gap junctions in de weefselgezondheid.
- Toekomstige studies kunnen de toepassingen ervan in de farmacologie verder uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Gap junctionele intercellulaire communicatie (GJIC) dient als een functionele biomarker voor het beoordelen van verstoringen in de weefselhomeostase door toxicanten en het evalueren van de beschermende effecten van natuurproducten. De scalpel loading-fluorescentiekleurstofoverdrachttechniek (SL-DT) maakt een snelle beoordeling op populatieniveau van GJIC-inhibitie mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Deze assay biedt voorspellende zekerheid bij het prioriteren van verbindingen op basis van hun impact op cellulaire communicatiepaden die essentieel zijn voor de orgaanfunctie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door blootstelling aan verbindingen te koppelen aan de verstoring van GJIC als mechanisme van toxiciteit.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via directe meting van de intercellulaire kanaalactiviteit in levende celpopulaties.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het identificeren van vroege biomarkers voor nadelige effecten op weefselonderhoud en homeostase.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door de baseline GJIC-competentie vast te stellen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve dye transfer-uitlezingen die geschikt zijn voor automatisering en high-throughput imaging.
- Schaalbaarheid: Aangepast voor in vivo weefselcoupes en geschikt voor geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie voor een verhoogde sample-throughput.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt ontdekkingsbevindingen met preklinische validatie via geconserveerde GJIC-mechanismen over verschillende soorten heen.
- Mechanische risicovermindering: Verduidelijkt of waargenomen fenotypen voortkomen uit verstoorde intercellulaire communicatie in plaats van off-target effecten.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert de criteria voor verdere ontwikkeling door structuur-activiteitsrelaties in GJIC-modulatie te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De SL-DT assay fungeert als een instrument in de ontdekkingsfase voor mechanisch inzicht, gepositioneerd vóór de lead-optimalisatie om verbindingen met een hoog risico op weefselverstoring te filteren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door te kwantificeren hoe toxicanten of natuurproducten intercellulaire signaleringsnetwerken beïnvloeden.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via reproduceerbare, populatiegebaseerde functionele read-outs die communicatie op weefselniveau weerspiegelen.
- Analytics: Genereert fraction of control (FOC)-waarden die statistische vergelijking over verschillende doses en tijdspunten mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij biomarkerstrategieën door GJIC-functie te koppelen aan resultaten van weefselintegriteit in preklinische modellen.
- Enterprise Reuse: Dient als een herbruikbaar platform voor toxicologie-, farmacologie- en nutraceutical-ontwikkelingsprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door een directe functionele uitlezing van de gap-junctionkanaalactiviteit te bieden.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via eenvoudige belading met een scalpel en imaging met een vast eindpunt.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege verstoring van de GJIC te koppelen aan downstream negatieve weefseleffecten.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door verbindingen te identificeren die de homeostase van de intercellulaire communicatie behouden.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, het hanteren van fluorescente kleurstoffen en epifluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van een gestandaardiseerde scalpeltechniek en consistente incubatietijden voor een betrouwbare overdracht van de kleurstof.
- Vereist overeenstemming tussen teams over drempelwaarden voor beeldanalyse en morfometrische parameters.
- Aanpasbaar voor verschillende zoogdierceltypen en weefselsneden door optimalisatie van de laad- en fixatieparameters.
- Beperkt tot het beoordelen van functionele kanaalactiviteit; maakt geen onderscheid tussen connexine-expressie, fosforylering of gating-toestanden.
