High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits
20 september 2016
Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.
Het algemene doel van deze chromogene assay is om verschillende enzymen in een high-throughput formaat te screenen tegen een selectie van verschillende chromogene substraten. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het enzymontdekkingsveld te beantwoorden, zoals het vinden van nieuwe enzymactiviteiten voor de afbraak van bio massa. Het grote voordeel van deze techniek is dat de chromogene substraten beschikbaar zijn in vier verschillende kleuren, waardoor deze techniek high-throughput, uiterst betrouwbaar en kosteneffectief is.
Om te beginnen, activeer de 96-well filter assay kit plaat door 200 microliters activeringsoplossing toe te voegen aan elke well. Incubeer bij kamertemperatuur zonder agitatie gedurende 10 minuten. Gebruik een centrifuge en een standaard 96-well plaat voor het verzamelen.
Om de bestaande activeringsoplossing naar beneden te centrifugeren, voeg 100 microliters steriel water toe aan de chromogene polymeer hydrogel of CPH substraten en pas een vacuüm toe of centrifugeer om de stabilisator te verwijderen. Herhaal het wassen nog twee keer. Om de enzymreactie voor te bereiden, voeg 150 microliters van 100 mM natriumacetaatbuffer, pH 4,5 en 5 microliters van endo-cellulase oplossing met drie verschillende concentraties toe aan elke well van de assay kit plaat.
Plaats de productplaat onder de assay kit plaat om eventuele potentiële lekkage van de reactieplaat tijdens het schudden op te vangen. Incubeer vervolgens de assay kit plaat bij kamertemperatuur in een horizontale shaker bij 100 rpm gedurende 30 minuten. Om betrouwbare gegevens te verkrijgen, is het noodzakelijk om het reactiemengsel tijdens de incubatie te agiteren.
Plaats de assay kit plaat met de productplaat eronder in de centrifuge en centrifugeer naar beneden bij 2.700 x g gedurende 10 min. Om het reactieproduct in de wells van de productplaat over te brengen. Na het centrifugeren, inspecteer de productplaat visueel om te controleren of het volume vloeistof in elke well ongeveer hetzelfde is.
Gebruik een plate reader om de absorptie van de verzamelplaat bij 630 nm te meten voor de verschillende groene CPH substraten. Analyseer en plot de gegevens volgens het tekstprotocol. Om de chromogene assay uit te voeren met rood onoplosbaar chromogeen bio mass of ICB-tarwestro begint u met het toevoegen van 200 microliters activeringsoplossing in elke well van de assayplaat.
Vervolgens incubeert u de plaat bij kamertemperatuur zonder agitatie gedurende 10 minuten. Verwijder de stabilisator door 100 microliters steriel water te gebruiken om de wells drie keer te wassen. Voeg vervolgens 150 microliters van 100 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5 en 5 microliters van 10 eenheden per milliliter van verschillende endo-xylanase oplossing toe.
Plaats de productplaat onder de substraatplaat om eventuele potentiële lekkage van de substraatplaat tijdens het schudden op te vangen. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur bij 100 rpm gedurende twee uur. Na de incubatie plaatst u de assay kit plaat met de productplaat eronder in de centrifuge en centrifugeert u naar beneden bij 2.700 x g gedurende 10 min om het reactieproduct in de wells van de productplaat over te brengen.
Controleer of het volume vloeistof in elke well ongeveer hetzelfde is. Lees vervolgens met behulp van een plate reader de absorptie van de verzamelplaat bij 517 nm voor rood ICB-tarwestro. Voer gegevensanalyse uit volgens het tekstprotocol.
Hier wordt een voorbeeld van een dosisrespons van CPH-arabinoxylan naar xylanase bij verschillende concentraties van het enzym getoond, waarbij de afnemende enzymconcentratie visueel kan worden waargenomen. Een meer gedetailleerde spectrofotometrische kwantificering wordt gebruikt om de absorptie tegen de enzymconcentratie te plotten. Met de signaalintensiteit komt de enzymactiviteit overeen.
In dit voorbeeld van de assay die wordt gebruikt voor enzymscreening werd een endo-cellulase getest bij drie concentraties tegen verschillende CPH substraten. Zoals hier te zien is, werd aanvullende activiteit ten opzichte van cellulase getoond voor CPH-glucan, CPH-xylan, CPH-xyloglucan en lage activiteit werd gezien tegen CPH-galactomannan. Dezelfde CPH substraten werden gedigest met commercieel verkrijgbare enzymen die als positieve controles werden gebruikt onder dezelfde omstandigheden.
De resultaten hier tonen aan dat alle substraten werden afgebroken op niveaus die toenamen met toenemende enzymconcentraties. In dit experiment werden vijf ICB substraten samen met 19 CPH substraten opgenomen om de gesecreteerde enzymen van Phanerochaete chrysosporium onder drie verschillende pH-condities te analyseren. P.chrysosporium enzymen degradeerden verschillende glucanen, zetmelen en xylanen.
Lagere signalen konden worden gedetecteerd voor de hemicelluloses arabinan en pectisch galactan evenals voor RGI. De geproduceerde enzymen waren actiever in zure omstandigheden dan in neutrale of licht basische omstandigheden. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in minder dan een uur worden uitgevoerd, als het goed wordt uitgevoerd.
Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden het reactiemengsel tijdens de incubatie te mengen. Na de ontwikkeling, opent deze techniek de weg voor onderzoekers op het gebied van high-throughput screening om nieuwe enzymactiviteiten voor biotechnologie te ontdekken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de screening kit moet gebruiken.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een high-throughput chromogene assay voor enzymscreening met behulp van gemultiplexte substraten. De assaykit bevat substraten van chromogene polymere hydrogel (CPH) en onoplosbare chromogene biomassa (ICB) voor het testen van polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Enzymscreening
- Biotechnologie
- High-throughput assays
Achtergrond
- De ontdekking van enzymen is van cruciaal belang voor diverse toepassingen, waaronder de afbraak van biomassa.
- Chromogene substraten maken visuele monitoring van enzymactiviteit mogelijk.
- De assay is ontworpen om betrouwbaar en kosteneffectief te zijn.
- Verschillende substraten zorgen voor een reeks kleuren voor een verbeterde analyse.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het screenen van enzymen tegen diverse substraten.
- Het identificeren van nieuwe enzymatische activiteiten voor de afbraak van biomassa.
- Het faciliteren van high-throughput screening binnen het enzymonderzoek.
Gebruikte methoden
- Activering van een 96-wells filter-assaykitplaat met een activeringsoplossing.
- Incubatie van enzymreacties onder gecontroleerde omstandigheden.
- Gebruik van een centrifuge voor het verzamelen van het product.
- Meting van de absorptie bij specifieke golflengten voor data-analyse.
Belangrijkste resultaten
- Enzymatische activiteiten werden waargenomen voor diverse CPH- en ICB-substraten.
- Hogere enzymconcentraties leidden tot een verhoogde afbraak van het substraat.
- Verschillende substraten vertoonden variërende niveaus van enzymactiviteit.
- Zure omstandigheden versterkten de enzymactiviteit in vergelijking met neutrale of basische omstandigheden.
Conclusies
- Deze assay biedt een robuust platform voor enzymscreening.
- Het stelt onderzoekers in staat om efficiënt nieuwe enzymactiviteiten te verkennen.
- Beheersing van de techniek maakt een snelle uitvoering in minder dan één uur mogelijk.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
High-throughput enzymscreening kampt met knelpunten wat betreft de beschikbaarheid van substraten en de schaalbaarheid van assays, wat de snelle functionele karakterisering van koolhydraat-actieve enzymen (CAZymes) beperkt, die essentieel zijn voor industriële toepassingen in biobrandstoffen, textiel en voeding. Deze chromogene assay overbrugt dit technologische gat door gemultiplexte, kleurgecodeerde substraattesten in een 96-wells formaat mogelijk te maken, waardoor het voorspellend vertrouwen bij vroege enzymontdekking wordt vergroot en go/no-go-beslissingen in pipelines voor enzymengineering worden ondersteund. De methode verbetert de translationele continuïteit van targetidentificatie naar preklinische validatie door kwantitatieve, reproduceerbare activiteitsmetingen te leveren over diverse polysaccharide-substraten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele ondervraging van vermeende CAZymes mogelijk door genetische kandidaten te koppelen aan biochemische activiteit op gedefinieerde polysacharidesubstraten.
- Operationele waarde: Ondersteunt snelle hypothese-testen via kleur-gemultiplexte CPH-substraten, waardoor de screeningsdoorvoer wordt verhoogd zonder de betrouwbaarheid van de gegevens in gevaar te brengen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert mechanische risicoreductie door dosisafhankelijke enzymactiviteit te kwantificeren, wat helpt bij de prioritering van targets voor industriële enzymontwikkeling.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde, onoplosbare chromogene substraten (CPH en ICB) die complexe biomassa nabootsen, waardoor fysiologisch relevante activiteitsbeoordelingen mogelijk worden.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid van de assay door gestandaardiseerde activerings-, was- en centrifugatiestappen, waardoor de variabiliteit in high-throughput workflows wordt verminderd.
- Schaalbaarheidswaarde: Compatibel met standaard 96-wells plaatlezers en vloeistofbehandelingssystemen, wat integratie in bestaande screeningsplatforms voor de evaluatie van enzymcocktails of bouillon mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt systeemmodellering die relevant is voor ziekten door enzymactiviteit te testen onder variërende pH-omstandigheden, wat representatief is voor industriële procesomgevingen.
- Operationele waarde: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door enzymconcentratie te correleren met substraatdegradatie over meerdere biomassetypes (bijv. tarwestro, glucanen, xylanen).
- Voorspellende waarde: Verbetert de afstemming van translationele biomarkers door pH-afhankelijke activiteitspatronen te identificeren die cruciaal zijn voor de stabiliteit van formuleringen in detergent- of biobrandstoftoepassingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot lead-identificatie en ondersteunt hypothesetesten, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie voor koolhydraat-afbrekende enzymen voordat er wordt geïnvesteerd in eiwitengineering of opschaling van de fermentatie.
- Discovery Biology: Maakt verduidelijking van pathways mogelijk door enzymactiviteit te screenen tegen specifieke polysacharidesubstraten (bijv. CPH-glucaan, CPH-xylan) om substraatspecificiteit en functionele rol af te leiden.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en kwantitatieve resultaten via absorbentiemetingen bij 630 nm (CPH) and 517 nm (ICB), wat een betrouwbare vergelijking van enzymvarianten of condities mogelijk maakt.
- Analytics: Levert dosis-responsgegevens die statistische analyse en hit-selectie ondersteunen, waardoor teams enzymkandidaten kunnen rangschikken op basis van activiteit en specificiteit.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt discovery met preklinische continuïteit door de enzymprestaties te evalueren onder industrieel relevante condities (bijv. zure pH, complexe biomassesubstraten).
- Enterprise Hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar platform voor het screenen van enzymbibliotheken, bouillon of cocktails over meerdere projecten in bio-gebaseerde industrieën.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door fout-positieven te verminderen via directe activiteitsmeting op onoplosbare, natuurgetrouwe substraten.
- Operationele waarde: Levert standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde reagensvolumes, incubatietijden en centrifugatieparameters, waardoor gebruikersafhankelijke variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door snelle screening van honderden enzymkandidaten mogelijk te maken, wat de tijd en kosten die gepaard gaan met biochemische assays met een lage doorvoersnelheid vermindert.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door kwantitatieve activiteitsgegevens te genereren die de go/no-go-beslissingen in enzymtechnische campagnes informeren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in enzymkinetiek en optimalisatie van chromogene assays om nauwkeurige substraatpreparatie en reactiemonitoring te waarborgen.
- Is afhankelijk van toegang tot een platenlezer die in staat is tot absorbantiemetingen bij 630 nm en 517 nm, en een centrifuge die compatibel is met 96-wells platen voor productoverdracht.
- Vereist cross-team standaardisatie van buffercondities (bijv. natriumacetaat pH 4.5) en incubatieparameters (bijv. 100 rpm schudden) om reproduceerbaarheid tussen locaties te garanderen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het testen van niet-polysacharide substraten, aangezien de assay is geoptimaliseerd voor koolhydraat-actieve enzymen en buffer- of substraatmodificaties kan vereisen voor andere enzymklassen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak om agitatie tijdens de activatie- en stabilisatiestappen te vermijden, en om visueel een gelijk productvolume na centrifugatie te bevestigen voor een betrouwbare interpretatie van de gegevens.
Veelgestelde vragen over Biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Chromogenic Assay with CPH Substrates, Detection, and Quantification
2:41
Chromogenic Assay with Insoluble Chromogenic Biomass Substrates, Detection, and Quantification
4:15
Results: Enzymatic Degradation of Chromogenic Polymer Hydrogel Substrates
6:02
Conclusion
