Name: Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Leer de FINA-methode voor snelle DNA-isolatie uit bloed zonder centrifuge. Deze papiergebaseerde techniek bereidt HIV-provirale DNA voor op kwantitatieve PCR in minder dan twee minuten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze protocolontwikkeling werd ondersteund door de Bill en Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagentia en advies werden verstrekt door Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cellen werden verstrekt door het Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negatief bloed werd verstrekt door Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Dank aan Mark Fisher voor fotografie hulp.

Ethiek statement: De gehele bloedmonsters die in deze studie worden niet beschouwd als onderzoek waarbij menselijke proefpersonen zijn. De monsters werden verkregen voor klinische diagnostische doeleinden, die zijn voldaan en het resterende gedeelte van deze monsters werd bepaald de FINA onderzoekstest. De monsters werden zodanig dat de onderzoekers waren niet in staat om de identiteit van personen gemakkelijk vaststellen gecodeerd. 1. Voorbereiding van de FINA Monstervoorbereiding Module <ol><li> Bereid vloeipapier pad door het snijden van een 35 x 35 mm 2 van een 2,6 mm dik 100% katoen pad. Snijd één pad per exemplaar. </li><li> Bereid plastic paraffine folie met een papieren beschermlaag door een snij stuk paraffine film (25 mm (h) van 50 mm (w)) en vervolgens ponsen een gat 7,14 mm diameter in het midden van de band met een hamer aangedreven perforator. Bereid een tape per exemplaar. </li><li> Bereid een gebonden glas bloed separator membraan (capture membraan) disk door ponsen een cirkel met een diameter van 8,35 mmmet een hamer gedreven perforator. Punch één schijf per exemplaar. De schijf heeft een partikelretentie vermogen van 2,3 urn. </li><li> Monteer de FINA monstervoorbereiding module door het plaatsen van de vangst schijf in het midden van de blotting pad met behulp van een tang. Plaats de paraffine film tape over de vangst schijf, zodat het gat van de paraffine band verlaat het centrum van de vangst schijf blootgesteld. </li><li> Zorgen voor maximaal contact tussen de schijf en de blotting pad door het uitrekken van de paraffine tape iets naar blotting pad te dekken en stevig indrukken van de paraffine tape te houden aan de blotting pad om alle randen van de schijf. </li><li> Maak zoveel modules, dat bij experiment of voorraad voor toekomstig gebruik. </li></ol> 2. Voorbereiding van de qPCR Tube <ol><li> Bereid een 5,1 mm schijf tape dat de cel vangen membraan verankeren aan de zijkant van de buis te voorkomen qPCR het membraan blokkeert de fluorescentiedetectie door ponsen een cirkel dubbel beklede polyester de diagnostische tape met een hamer gedreven punch uit een plaat van de band. Bereid een tape schijf per exemplaar. </li><li> Verwijder de ene kant van de sticker liner van de tape. Plaats de tape in een 200 ui PCR tube, plakken het op één zijde en naar de bodem van de buis. Verwijder de tweede sticker liner. De buis is nu klaar om voorbereid schijf te ontvangen. </li><li> Produceren vele buizen, dat bij experiment of voorraad voor toekomstig gebruik. </li></ol> 3. Contrive Blood Specimen Let op: Als een echt monster wordt voorbereid, ga dan naar stap 4. <ol><li> Dooi 8E5-LAV cellen 15 herbergen een enkele kopie van het HIV-1 provirus verkregen uit de Virologie Quality Assurance Laboratory (VQA; Rush Presbyterian / St Luke&#39;s Medical Center, Chicago, IL.). Opmerking: Deze worden opgeslagen als bevroren celpellets in een concentratie van 4000 cellen / ul. Celgetal werd geverifieerd zoals eerder 9 beschreven. </li><li> Bereid serial verdunning in invriesmedium (90% foetaal runderserum, 10% dimethylsulfoxide) concentraties variërend 1-400 cellen / ul. </li><li> Pipet 10 pi cellen uit elk van de seriële verdunningen in een microcentrifugebuis. Voeg 100 ul van verse HIV-1 negatieve EDTA behandeld volbloed monster aan elke buis om een ​​standaard curve van 8E5-LAV kopie nummers 10-4,000 creëren. Meng door voorzichtig flicking de bodem van de buis 5 maal. </li></ol> 4. Voer FINA Extraction <ol><li> Lyse bloedcellen door het toevoegen van Triton-X100) tot een uiteindelijke concentratie van 1% (11 ui 10% Triton-X100 bij 110 gl volbloed en cellen uit stap 3.3). </li><li> Meng door voorzichtig flicking de bodem van de buis 5 maal. Het bloed moet doorzichtig rood. </li><li> Pipet al het bloedmonster op de vangst schijf. Opmerking: Een waterdichte afdichting tussen de paraffine tape en de vangst membraan zorgt ervoor dat het bloed stroomt door het membraan, en een goed contact tussen de vangst membrane en deppen pad montage zorgt voor een snelle steekproef wicking. </li><li> Laat het monster om te genieten door het filter. Opmerking: Het bloed lysaat wieken in het blotting pad door capillaire werking, het vastleggen van het genomische DNA op het oppervlak van de schijf opname. Het lysaat is gedrenkt in de disk als het mat verschijnt. </li><li> Voeg 600-1000 pi 10 mM NaOH druppelsgewijs op de vangst schijf. Opmerking: De wasbuffer kan ook worden toegevoegd als een bulk toevoeging van 600 pi. De buffer zal een druppel op de hydrofobe paraffine band vormen en lont door het gat om de schijf ongeveer 20 sec. Het filter zal veranderen van rood naar wit te geven klaring van hemoglobine. </li><li> Scheid de schijf uit het pad blotting met een pincet en de schijf gelden voor de band in de bereide PCR buis. Als er een rode kleur op het filter voeg 50-100 ul wasbuffer het filter te verwijderen alvorens deze in het buisje. Let op: Zelden overdruk toegepast tijdens de bereiding vande FINA modules resulteert in een verdeling van het membraan lagen tijdens scheiding van de blotting pad. Gooi deze schijven en voor te bereiden een vers monster. </li><li> Nadat het filter is geplaatst in de PCR-buis, analyseert de monsters meteen. Als alternatief, droge overnachting in een doos met calciumsulfaat droogmiddel, dan de dop en plaats in een folie zakje met silica droogmiddel en op te slaan totdat klaar voor analyse. </li></ol> 5. qPCR Reaction <ol><li> Bereid 100 pi qPCR master mix per reactie met behulp van HIV specifieke primers en sondes zoals eerder beschreven 9,11. Een in- amplificatiecontrole te controleren op de aanwezigheid van remmers en amplificatie te verifiëren dat een negatief monster een echte negatieve. Wees er zeker van dat filter volledig bedekt is met master mix en dat het filter blijft bevestigd naar de andere kant van de buis tijdens de gehele reactie. </li><li> Amplificatie uit te voeren met een real-time PCR inrichting zoals hierboven beschreven 9. </li></ol>

<ol><li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li>
<li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Paper+Machine%22+for+Molecular+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li>
<li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world%3B+an+example+of+microfluidic+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li>
<li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+molecular+diagnostic+for%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li>
<li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-Based+RNA+Extraction%2C+in+Situ+Isothermal+Amplification%2C+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost%2C+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+%28H1N1%29+from+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li>
<li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+%28STIs%29%3A+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).</li>
<li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+the+developing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li>
<li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li>
<li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li>
<li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).</li>
<li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li>
<li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li>
<li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-PCR+processing%3A+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
<li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).</li>
<li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization%22">World Health Organization</a>. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).</li>
<li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afr+Med+J%22%5BJournal%5D)">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

EID gekoppeld aan een snelle behandeling toegang is aangetoond kindersterfte verminderen door HIV infectie 16. Vanwege de aanhoudende maternale antilichamen in het bloed van een kind, zijn snelle HIV antilichamentests beperkt nut bij het bepalen van de status van HIV-blootgestelde zuigelingen. De WHO beveelt aan dat alle baby&#39;s van HIV-1-positieve moeders moeten worden getest bij 4-6 weken oud, met een virologisch onderzoek 17. We hebben gemeld de ontwikkeling van een test voor de detectie en k...

Verschillende rapporten hebben de ontwikkeling van papier- of een membraan extractiemethoden voor gebruik behandeld in point-of-care (POC) inrichtingen 1-5 met als doel de uitstekende gevoeligheid en specificiteit van moleculaire diagnostiek voor alle. De World Health Organization (WHO) Seksueel Overdraagbare Aandoeningen Diagnostics initiatief bedacht de term VERZEKERD (Betaalbaar, gevoelig, specifiek, Gebruiksvriendelijk, Snel en Robuust, Apparatuur-vrij en geleverd aan degenen die het nodig hebben) om te beschrijven de ideale kenmerken van een POC -test 6. Van deze richtlijnen, de apparatuur-vrije eigenschap is bijzonder moeilijk te bereiken voor moleculaire diagnostiek. Toch zal elke innovatie op het gebied van de doelstelling van het bereiken van die in de meeste behoefte te bevorderen, en er is hoop voor verbeteringen op korte termijn in testprestaties door aanpassing van bestaande technologie 7. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het extraheren van DNA uit vol bloeddat betekent complexe chemie of laboratorium instrumentatie niet nodig. De FINA (filtratie isolatie van nucleïnezuren) monstervoorbereiding methode werd oorspronkelijk ontwikkeld om leukocyt DNA uit volbloed extraheren om de HIV-1 provirus detecteren van een monster te beantwoorden point-of-care (POC) kwantitatieve PCR (qPCR) vroeg zuigeling diagnostische (EID) platform voor gebruik in beperkte resource-instellingen 8-11. FINA extractie verschilt van conventionele zuiveringsmethoden die silicamembranen of met siliciumdioxide beklede paramagnetische deeltjes om reversibel binden van DNA in de aanwezigheid van chaotrope middelen 12. In plaats daarvan gebruikt FINA verticale filtratie via een scheidingsmembraan om cellulaire DNA uit volbloed direct extraheren. Het membraan dat de ingevangen DNA kan direct in een PCR-buis en ofwel direct gebruikt in een PCR-reactie of lucht gedroogd latere amplificatie 9. Nr chaotrope middelen, fenol, of alcoholen gebruikt in de monstername, EliminaTing het uitgebreid wassen stappen die nodig zijn om krachtige qPCR remmers afgeleid van het extractieproces 13,14 verwijderen. De FINA membraan kan zowel cellen 9 of genomisch DNA vrijgemaakt door cellysis 11 voordat het monster wordt toegevoegd aan het membraan vast te leggen. Voor de cel opname, wordt bloed direct toegevoegd aan het membraan. De cellen worden vervolgens in het membraan gelyseerd door toevoeging van 10 mM NaOH. Het voordeel van deze methode is dat het gaat slechts 3 stappen: 1) toevoegen van het monster; 2) cellysis / was en 3) filter disk plaatsing in qPCR buis. Het nadeel van deze methode is dat het membraan slechts een bepaald aantal cellen direct evenredig met de diameter van de membraanschijf kan bevatten. De detectielimiet vereist voor EID bereikt, wordt 100 gl volbloed vereist voor monster ingang die een filter die te groot in een qPCR buis geplaatst meebrengt. Lyseren van de bloedcellen met detergent voor het toevoegen van het monster aan de collectiemembraan ligt een verwerkingsstap, maar maakt het gebruik van een kleinere filter voor dezelfde steekproef. We konden hoge reproduceerbaarheid, enkel exemplaar detectie en kwantificering van slechts 10 kopieën van HIV-1 provirale DNA van 100 pl bloed af met de testconfiguratie 11 tonen. In dit rapport beschrijven we de FINA protocol zoals oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik in het laboratorium. Het membraan / filter sandwich zogenaamde FINA monstervoorbereiding module kunnen worden bereid in grote partijen en opgeslagen voor later gebruik. Wanneer specimens worden geëxtraheerd dit duurt 2 min en kunnen worden uitgevoerd in verschillende grootte batches. De qPCR kan onmiddellijk worden uitgevoerd of de filters die de ingebedde DNA kan worden opgeslagen totdat het handig om qPCR voeren. Deze methode is erg handig voor routine-analyse van monsters in zowel lage als hoge resource-instellingen.

<table><tbody><tr><td>Fusion 5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>8151-9915</td><td></td></tr><tr><td>707 blotting pad</td><td>VWR International</td><td>28298-014</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M</td><td>VWR International</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&nbsp;</td><td>3M Medical Specialties</td><td>9965</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;l qPCR strip tubes</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>optical strip caps</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005p qPCR System</td><td>Agilent</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>A.C.S. Reagent</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>for molecular biology</td></tr><tr><td>fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A16</td><td></td></tr><tr><td>Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A19</td><td></td></tr><tr><td>Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A23</td><td></td></tr></tbody></table>

filtratie isolatie van nucleïnezuren: een eenvoudige en snelle dna extraction method

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtratie isolatie van nucleïnezuren, is een nieuwe extractie methode die gebruik maakt van verticale filtering via een scheidingsmembraan en absorberend kussen cellulaire DNA uit volbloed extract in minder dan 2 minuten. Het bloedmonster wordt behandeld met detergens, kort gemengd en pipet aangebracht op het scheidingsmembraan. Het lysaat transporteert in de blotting pad door capillaire werking, het vastleggen van het genomische DNA op het oppervlak van het scheidingsmembraan. Het geëxtraheerde DNA wordt vastgehouden op het membraan tijdens een eenvoudige wasstap waarin PCR-remmers zijn goddelozen in het absorberende blotting pad. Het membraan dat de ingevangen DNA wordt vervolgens toegevoegd aan de PCR-reactie zonder verdere zuivering. Deze eenvoudige methode vereist geen laboratorium uitrusting en kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd met goedkope laboratorium benodigdheden. Hier beschrijven we een protocol voor zeer gevoelige detectie en kwantificering van HIV-1 provirale DNA van 100 gl volbloed als model voor beginFant diagnose van HIV die gemakkelijk kan worden aangepast aan andere genetische doelwitten.

De workflow voor het extraheren van proviraal DNA uit vol bloed waaraan 8E5-LAV-cellen wordt getoond in Figuur 1. Figuur 2 toont de FINA monster module en bereid qPCR buis. Deze werkwijze maakt efficiënte amplificatie van HIV-1 provirus van 8E5-LAV cellen bij verschillende kopie-aantallen, zoals in de standaardcurve van gezochte monsters (figuur 3). PCR had een rendement van 103%, zoals berekend uit effect = -1 + 10 (-1 / helling).<...

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle papieren DNA extractiewerkwijze HIV provirale DNA uit vol bloed gedetecteerd met kwantitatieve PCR. Dit protocol kan worden verlengd voor gebruik bij het detecteren andere genetische merkers of alternatieve amplificatiewerkwijzen.

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Het algemene doel van deze FINA-methode, wat staat voor filtratie-isolatie van nucleïnezuren, is om genomisch DNA voor PCR-amplificatie snel en eenvoudig te isoleren uit complexe monsters zonder het gebruik van laboratoriuminstrumentatie zoals een centrifuge. Deze snelle op papier gebaseerde DNA-extractiemethode voor HIV-proviraal DNA werd ontwikkeld voor integratie in een kwantitatief PCR-diagnostisch apparaat. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de modules voor monstervoorbereiding en de PCR-buisjes vooraf kunnen worden klaargemaakt, waardoor de DNA-extractie minder dan twee minuten duurt.We hebben deze methode oorspronkelijk ontwikkeld om te worden geïntegreerd in een monstername voor vroege diagnostische tests op HIV-1 bij zuigelingen aan de hand van hielprikbloed. Over het algemeen kunnen personen die nog niet bekend zijn met deze methode problemen ervaren, omdat het verwijderen van de achterzijde van de dubbelzijdige tape waarmee het celvangmembraan aan de zijkant van de PCR-buis is bevestigd, oefening vereist. De procedure zal worden gedemonstreerd door Jen Reed, een senior technicus uit mijn laboratorium.Begin deze procedure door de materialen voor te bereid

filtration-isolation-nucleic-acids-simple-rapid-dna-extraction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een instrument en chemicaliën beschreven sequentieel isoleren nucleïnezuren gevolgd door eiwitten van een monster zonder electriciteit. De tool bestaat uit een sorptiemiddel gehouden binnen een transferpipet, terwijl de isolatie chemie zijn gebaseerd op de vaste-fase-extractie principes. De geïsoleerde macromoleculen kan geanalyseerd worden door immuno-gebaseerde en PCR-gebaseerde assays.

Elektriciteit-Free, Sequential nucleïnezuur en eiwit isolatie

Bron: Dembowski, J. A., et al. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017).Deze video demonstreert de isolatie van eiwit-viraal DNA-complexen uit celkernen met behulp van click-chemie en purificatie met magnetische beads. Het protocol omvat het labelen van virale genomen met alkyn-gemodificeerde nucleotiden, biotinylering via een click-reactie en binding aan streptavidine-gecoate magnetische beads. Na het wassen en hitte-elutie...

Isolatie van eiwitten uit viraal DNA-eiwitcomplexen

We schetsen een methodologie voor de verwerking van volbloed om een verscheidenheid aan componenten te verkrijgen voor verdere analyse. We hebben een gestroomlijnd protocol geoptimaliseerd dat snelle, hoogwaardige, gelijktijdige verwerking van volbloedmonsters in een niet-klinische omgeving mogelijk maakt.

Snelle Fractionering en isolatie van volbloed componenten in monsters verkregen van een communautair gevestigde instelling

Hier presenteren we een protocol voor de snelle virus nucleïnezuur extractie van de volbloed virus-geïnactiveerd. De winning gebeurt rechtstreeks in het bloed collectie buizen en vereist geen apparatuur of elektriciteit. De methode is niet afhankelijk van laboratoriumfaciliteiten en kan overal worden gebruikt (bijvoorbeeld, in veldhospitalen).

Snelle, veilige en eenvoudige handleiding bed nucleïnezuur extractie voor de opsporing van Virus in monsters van volbloed

Enkele kernisolatie is afhankelijk van dissociatie en detergent-gebaseerde permeabilisatie van het celmembraan, stappen die optimalisatie nodig hebben en gevoelig zijn voor de invoering van technische artefacten. We demonstreren een wasmiddel- en enzymvrij protocol voor snelle isolatie van intacte kernen rechtstreeks uit hele weefsel, wat kernen oplevert die geschikt zijn voor single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) of ATAC-seq.

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

De studie beschrijft een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol om kernen van hoge kwaliteit te isoleren uit bevroren zoogdierweefsels voor stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern.

Een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol voor de isolatie van afzonderlijke kernen uit ingevroren zoogdierweefsels voor sequencing van één kern

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve methode om de extractie van plasmide-DNA te versnellen. Door gebruik te maken van op maat gemaakte 3D-geprinte rekken die compatibel zijn met standaard schandelbakplaatrotoren, kunnen onderzoekers tot 48 spinkolommen met doppen of tot 116 spinkolommen zonder doppen tegelijk verwerken, wat de verwerkingstijd aanzienlijk vermindert vergeleken met handmatige microcentrifugemethoden.

Medium-throughput kolom DNA-extractie met behulp van 24-well racks

Het gebruik van NanoDrop microvolume systemen als praktische en efficiënte alternatieven voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode wordt beschreven door de demonstratie van twee microvolume nucleïnezuur kwantificatie protocollen.

NanoDrop microvolume Kwantificering van nucleïnezuren

Deze mededeling bevat gegevens over de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid van de BioSpec-nano UV-VIS spectrofotometer voor dsDNA en eiwit kwantificatie. Zelfs met ultra-kleine volumes (1 tot 2 L), reproduceerbaarheid is uitstekend, terwijl de automatische vegen functie verbetert de doorvoer en resulteert in een minimale overdracht voor betere resultaten.

Concentratie Bepaling van nucleïnezuren en eiwitten Met behulp van de Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Deze video toont het protocol voor DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde materiaal. Dit is een multi-dagen procedure waarbij weefsel secties worden ontdaan met xyleen, gerehydrateerd met ethanol en behandeld met proteinase K te zuiveren en DNA te isoleren voor latere gen-specifieke of genome-wide analyse.

DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses

Leer de FINA-methode voor snelle DNA-isolatie uit bloed zonder centrifuge. Deze papiergebaseerde techniek bereidt HIV-provirale DNA voor op kwantitatieve PCR in minder dan twee minuten.

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

Meer video's verkennen