Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

Het algemene doel van deze FINA-methode, wat staat voor filtratie-isolatie van nucleïnezuren, is om genomisch DNA voor PCR-amplificatie snel en eenvoudig te isoleren uit complexe monsters zonder het gebruik van laboratoriuminstrumentatie zoals een centrifuge. Deze snelle op papier gebaseerde DNA-extractiemethode voor HIV-proviraal DNA werd ontwikkeld voor integratie in een kwantitatief PCR-diagnostisch apparaat. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de modules voor monstervoorbereiding en de PCR-buisjes vooraf kunnen worden klaargemaakt, waardoor de DNA-extractie minder dan twee minuten duurt.

We hebben deze methode oorspronkelijk ontwikkeld om te worden geïntegreerd in een monstername voor vroege diagnostische tests op HIV-1 bij zuigelingen aan de hand van hielprikbloed. Over het algemeen kunnen personen die nog niet bekend zijn met deze methode problemen ervaren, omdat het verwijderen van de achterzijde van de dubbelzijdige tape waarmee het celvangmembraan aan de zijkant van de PCR-buis is bevestigd, oefening vereist. De procedure zal worden gedemonstreerd door Jen Reed, een senior technicus uit mijn laboratorium.

Begin deze procedure door de materialen voor te bereiden die nodig zijn voor het assembleren van de FINA-module voor monsterpreparatie. Bereid het blotpad voor door een vierkant van 35 bij 35 millimeter te knippen uit een 2,6 millimeter dikke pad van 100% katoen. Bereid plastic paraffinefolie voor met een papieren achterkleefband.

Snijd een stuk paraffinefolie van 25 bij 50 mm af en gebruik vervolgens een hamer om een gat met een diameter van 7,14 mm in het midden van de tape te ponsen. Bereid een gebonden glazen bloedscheidingsmembraan of opvangschijf voor door met een hamer een cirkel met een diameter van 8,35 mm te ponsen. Om de FINA-monstervoorbereidingsmodule te assembleren, gebruikt u een pincet om de opvangschijf in het midden van het blotpad te plaatsen.

Verwijder de beschermlaag van de paraffinefilmtape en plaats deze over de opvangschaif, zodat de gehele paraffinetape het centrum van de opvangschijf onbedekt laat. Zorg voor maximaal contact tussen de schijf en het blotmatje door de paraffinetape lichtjes uit te rekken over het blotmatje en de paraffinetape stevig aan te drukken om deze langs alle randen van de schijf aan het blotmatje te hechten. Een tapedisc van 5,1 mm is vereist om het opvangmembraan aan de zijkant van de qPCR-buis te verankeren om te voorkomen dat het membraan de fluorescentiedetectie van het real-time PCR-instrument blokkeert.

Bereid deze tape-schijf voor door met een hamer een cirkel van dubbel gecoate polyester diagnostische tape uit een vel tape te ponsen. Verwijder met een pincet één zijde van de plakstrip van de tape. Plaats de tape in een PCR-buis van 200 µL, waarbij deze tegen één zijde aan de onderkant van de buis wordt geplakt.

Verwijder de tweede stickerliner. De buis is nu klaar om de voorbereide disc te ontvangen. De detectie van proviraal DNA uit volbloed gespike met 8e5 LAV-cellen zal in deze video worden gedemonstreerd.

Ontdooi de eerder ingevroren pellets van 8e5 LAV-cellen op ijs. Maak een seriële verdunning van de cellen in vriesmedium met concentraties variërend van 1 tot 400 cellen per microliter. Pipetteer 10 microliters cellen uit elke verdunning in een microcentrifugebuisje.

Voeg 100 µL van een vers HIV-1 negatief, met eDTA behandeld volbloedmonster toe aan elke buis om een standaardcurve te maken. Meng door vijf keer voorzichtig tegen de onderkant van de buis te tikken. Om de DNA-extractieprocedure te starten, lyseren de bloedcellen door triton X-100 toe te voegen tot een eindconcentratie van 1%.

Meng door vijf keer zachtjes tegen de onderkant van de buis te tikken. Het bloed moet een doorschijnend rood worden. Pipetteer het volledige bloedmonster op de opvangschijf.

Een waterdichte afsluiting tussen de paraffineband en het opvangmembraan zorgt ervoor dat het bloed door het membraan stroomt. Een goed contact tussen het contactmembraan en de blotting pad-assemblage garandeert een snelle capillaire opname van het monster. Laat het monster door het filter trekken.

Het bloedlysaat is in de opvangschijf getrokken en de schijf ziet er mat uit. Voeg 600 tot 1.000 µL 10 mmol natriumhydroxide druppelgewijs toe aan de opvangschijf. Het filter zal van rood naar wit verkleuren, wat aangeeft dat het hemoglobine is verwijderd.

Scheid vervolgens de schijf van het blotterkussen en breng de schijf aan op de tape in de voorbereide PCR-buis. Nadat het filter in de PCR-buis is geplaatst, dient het monster direct te worden geanalyseerd. Bereid de qPCR-mastermix voor zoals beschreven in de protocoltekst en zorg ervoor dat het filter volledig wordt bedekt met de mastermix en gedurende de gehele reactie tegen de wand van de buis gefixeerd blijft.

Voer de amplificatie uit met behulp van een real-time PCR-apparaat zoals beschreven in de protocoltekst. Indien qPCR niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd, laat het filter dan alternatief overnacht drogen in een doos met calciumsulfaat-droogmiddel. Sluit de PCR-buis de volgende dag af en plaats deze in een foliezak met silicagel-droogmiddel en bewaar deze bij kamertemperatuur tot de analyse kan worden uitgevoerd.

Deze methode maakt een efficiënte amplificatie van HIV-1 provirus mogelijk uit 8e5 LAV-cellen bij verschillende kopie-aantallen. De doorgetrokken lijnen zijn amplificatieplots verkregen uit vier replica's van HIV-1-negatief volbloed, gespike met 4.000, 400, 40 en 10 8e5 LAV-cellen met 500 kopieën per reactie van de interne controle. De stippellijn geeft de drempelwaarde aan.

De volgende grafiek toont standaardcurven van de quantificatiecycluswaarden, berekend op basis van de amplificatieplot versus het loggetal van kopieën van 8e5 LAV-cellen per 100 microliter volbloed. De berekende PCR-efficiëntie was 103%. De replicaten van de HIV-proviraal DNA-standaardcurve vertonen eveneens een zeer reproduceerbare amplificatie.

Bovendien toont de aanwezigheid van een interne controle van 500 kopieën hydroxy-pyruvaatreductase aan dat er geen PCR-inhibitie optreedt als gevolg van het extraheren van bloed met deze methode, onafhankelijk van het aantal kopieën van het HIV-1 provirus dat aanwezig is. De doorgetrokken lijnen stellen de amplificatieplots voor en de stippellijn stelt de drempelwaarde voor. Na het volgen van deze procedure kunnen PCR-targets worden geamplificeerd uit diverse monster-typen om uw gen van interesse te detecteren.

Bijvoorbeeld wangswabs voor farmacogenetische screening of bloed voor snelle genotypering van diermodellen. Vergeet niet dat werken met bloedoverdraagbare pathogenen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd universele voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.