Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

Het algemene doel van deze FINA-methode, wat staat voor filtratie-isolatie van nucleïnezuren, is om genomisch DNA voor PCR-amplificatie van complexe monsters snel en eenvoudig te isoleren zonder het gebruik van laboratoriumapparatuur zoals een centrifuge. Deze snelle op papier gebaseerde DNA-extractiemethode voor HIV-provirale DNA werd ontwikkeld voor opname in een kwantitatief PCR-diagnostisch apparaat. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de monstervoorbereidingsmodules en PCR-buisjes van tevoren kunnen worden voorbereid, zodat de DNA-extractie minder dan twee minuten duurt.

We ontwikkelden deze methode eerst om te worden opgenomen in een monster om vroegtijdige diagnostische tests voor HIV-1 uit bloed uit de hiel van baby's uit te voeren. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het verwijderen van de achterkant van het dubbelzijdige plakband dat de celvangstmembraan aan de zijkant van het PCR-buisje bevestigt, oefening vereist. De procedure zal worden gedemonstreerd door Jen Reed, een senior technicus uit mijn lab.

Begin deze procedure door de materialen voor te bereiden die nodig zijn voor het samenstellen van de FINA-monstervoorbereidingsmodule. Bereid het blottingpad voor door een vierkant van 35 bij 35 millimeter van een 2,6 millimeter dik 100% katoenen pad te snijden. Bereid een plastic paraffinefolie voor met een papieren achterkanttape.

Snij een stuk paraffinefolie van 25 bij 50 mm en gebruik vervolgens een hamer om een gat met een diameter van 7,14 mm in het midden van het plakband te maken. Bereid een gebonden glazen bloedscheidingsmembraan of vangschijf voor door een hamer te gebruiken om een cirkel met een diameter van 8,35 mm te maken. Om de FINA-monstervoorbereidingsmodule te assembleren, gebruikt u een pincet om de vangschijf in het midden van het blottingpad te plaatsen.

Verwijder de achterkant van het paraffinefolieplakband en plaats het over de vangschijf zodat de gehele paraffinefolie het midden van de vangschijf laat blootliggen. Zorg voor maximaal contact tussen de schijf en het blottingpad door de paraffinefolie lichtjes te strekken om het blottingpad te bedekken en de paraffinefolie stevig aan te drukken om het aan het blottingpad te hechten rond alle randen van de schijf. Een tapedisc van 5,1 mm is vereist om de vangschijf aan de zijkant van het qPCR-buisje te verankeren om te voorkomen dat de membraan de fluorescentiedetectie van het real-time PCR-instrument blokkeert.

Bereid deze tapedisc voor door een hamer te gebruiken om een cirkel van dubbel gecoat polyester diagnostisch plakband uit een vel van het plakband te maken. Gebruik een pincet om een kant van de plakbandsticker te verwijderen. Plaats het plakband in een PCR-buis van 200 microliter, het plakband op een kant en naar de onderkant van het buisje.

Verwijder de tweede stickerliner. Het buisje is nu klaar om de voorbereide schijf te ontvangen. De detectie van provirale DNA uit volbloed dat is verrijkt met 8e5 LAV-cellen zal in deze video worden gedemonstreerd.

Ontdooi de eerder bevroren 8e5 LAV-celpellets op ijs. Bereid een seriële verdunning van de cellen in bevriezingsmedium met concentraties variërend van 1 tot 400 cellen per microliter. Pipetteer 10 microliter cellen uit elk van de verdunningen in een microcentrifugebuisje.

Voeg 100 microliter vers HIV-1 negatief eDTA-behandeld volbloedmonster toe aan elk buisje om een standaardcurve te creëren. Meng door zachtjes vijf keer op de bodem van het buisje te tikken. Om de DNA-extractieprocedure te beginnen, lyseert u de bloedcellen door triton X-100 toe te voegen tot een eindconcentratie van één procent.

Meng door zachtjes vijf keer op de bodem van het buisje te tikken. Het bloed zou een doorschijnend rood moeten worden. Pipetteer het gehele bloedmonster op de vangschijf.

Een waterdichte afdichting tussen het paraffinefolie en de vangschijf zorgt ervoor dat het bloed door de membraan stroomt. En goed contact tussen de vangschijf en de blottingpadconstructie zorgt voor snelle monsteropname. Laat het monster door het filter trekken.

Het bloedlysaat is in de vangschijf geweekt en de schijf ziet er mat uit. Voeg 600 tot 1.000 microliter 10 mmol natriumhydroxide druppelsgewijs toe aan de vangschijf. Het filter zal van rood naar wit veranderen, wat duidt op het verdwijnen van hemoglobine.

Separeer vervolgens de schijf van het blottingpad en breng de schijf aan op het plakband in het voorbereide PCR-buisje. Nadat het filter in het PCR-buisje is geplaatst, analyseer het monster meteen. Bereid de qPCR-mastermix voor zoals beschreven in de protocoltekst en zorg ervoor dat het filter volledig bedekt is met de mastermix en vastblijft aan de zijkant van het buisje gedurende de reactie.

Voer de amplificatie uit met behulp van een real-time PCR-apparaat zoals beschreven in de protocoltekst. Als qPCR niet meteen kan worden uitgevoerd, droog het filter dan 's nachts in een doos met calciumsulfaat-desiccant. Plaats de dag daarna het PCR-buisje in een foliezak met silica-desiccant en bewaar het bij kamertemperatuur totdat het klaar is voor analyse.

Deze methode maakt efficiënte amplificatie van HIV-1-provirus mogelijk uit 8e5 LAV-cellen bij verschillende kopienummers. De doorlopende lijnen zijn amplificatieplots verkregen uit vier replica's van HIV-1 negatief volbloed dat is verrijkt met 4.000, 400, 40 en 10 8e5 LAV-cellen met 500 kopieën per reactie van de interne controle. De stippellijn geeft de drempelwaarde aan.

Deze volgende grafiek toont standaardcurves van kwantitatieve cycluswaarden berekend uit de amplificatieplot versus log kopienummer van 8e5 LAV-cellen per 100 microliter volbloed. De berekende PCR-efficiëntie was 103%. De HIV-provirale DNA-standaardcurve replica's hebben ook een zeer reproduceerbare amplificatie.

Bovendien toont de aanwezigheid van een interne controle van 5