Name: Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Leer HIV-1 Gag-binding visualiseren aan GUV-membranen met YFP-gelabelde eiwitten en elektroformatie. Deze methode biedt directe detectie zonder langdurige nabewerking en verrijkt virologisch onderzoek naar virale assemblage.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Mohammad Saleem, Jing Wu en Krishnan Raghunathan bedanken voor nuttige discussies. We danken ook Priya Begani voor assistentie tijdens het filmen. Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health subsidies R01 AI071727 (AO) en R01 GM110052 (tot SLV).

Dag 1: Expressie van Gag eiwitten met behulp van de Wheat Germ Lysate-gebaseerde in vitro transcriptie-translatie System 1. Bereiding van HIV-1 Gag <ol><li> Verwijder alle reagentia van de commerciële tarwekiemen CECF kit van vriezers (tarwekiemen lysaten worden opgeslagen bij -80 ° C, en andere reagentia bij -20 ºC). Hen ontdooien op ijs en meng de bestanddelen zoals weergegeven in tabel 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Mix-1 (Feeding mix) </td><td></td></tr><tr><td> voedingsoplossing </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> Aminozuren </td><td> 80 ul </td></tr><tr><td> methionine </td><td> 20 gl </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 1000 gl </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Mix-2 (Lysate mix) </strong&gt; </td><td></td></tr><tr><td> tarwekiemen lysaten </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNase vrij water </td><td> 7 pl </td></tr><tr><td> Aminozuren </td><td> 4 gl </td></tr><tr><td> methionine </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> Plasmide DNA in TE-buffer (1 ug / ul) ** </td><td> 4 gl </td></tr><tr><td> reactiebuffer </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 gl </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 50 gl </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Samenstellingen van mengsels vereist tarwekiemen reacties. Opmerking: Als het experiment is ontworpen om het effect van RNA verwijderd door RNase op Gag membraanbindende onderzoeken vervangen ribonuclease inhibitoren met RNase-vrij water. Plasmide DNA moet vrij zijn van verontreinigingen volgens de instructies van de fabrikant. Echter, plasmids bereid met gebruikelijke, maar niet endotoxine-vrij plasmide isolatie kits succes gebruikt. instructies van de fabrikant adviseert ook met behulp van DNA opgelost in nuclease-vrij water. Bij gebruik van DNA gesuspendeerd in TE [10 mM Tris-HCl (pH 7,4) bevattende 1 mM EDTA] Vermijdt lagere concentraties van DNA, omdat EDTA in TE de opbrengst kunnen beïnvloeden. Plasmiden opgelost in TE buffer bij een concentratiebereik van 0,8-1 ug / ul succes gebruikt. <ol start="2"><li> Voeg eerst de Feeding mengsel (Mix-1) in de reactie cassette (transparante kamer). Voeg dan het lysaat mix (Mix-2) naar de andere kamer (rood). Gebruik geen luchtbellen niet invoeren tijdens het toevoegen van het mengsel in hun respectievelijke kamers, aangezien dit kan leiden tot inefficiënte uitwisseling oplossingsonderdelen en derhalve de efficiëntie van de reactie te verminderen. </li><li> Bedek de kamers met de klevende film die bij de kit. </li><li> Plaats de reactie cassette in de cassettehouder en incubate het samenstel voor 24 uur bij 24 ° C met een constante schudsnelheid van 900 rpm in een Eppendorf thermomixer R. </li></ol> Dag 2: Bereid GUVs door Electroformation en Harvest Wheat Germ Lysaten 2. Voorbereiding van GUVs <ol><li> Aliquot lipiden opgelost in anorganische oplosmiddelen zoals chloroform of mengsels van chloroform en methanol in glazen flesjes met schroefdoppen bekleed met Teflon liners en omwikkeld met Parafilm. Behandel lipiden met Hamilton-type glas spuiten, of indien beschikbaar, chloroform-bestendige kunststof tips. Neem glazen flesjes met daarin de lipiden te worden gebruikt voor GUV voorbereiding van de -20 ° C vriezer. <ol><li> Zodra de flesjes worden op kamertemperatuur, ervoor te zorgen dat door middel van visuele inspectie die de lipide schorsingen zijn duidelijk. De kwaliteit van lipiden, met name zure lipiden, zoals palmitoyl-oleoyl fosfatidylserine (POP&#39;s) en PI (4,5) P2, is belangrijk voor een succesvolle experimenten. Niet lipiden die zijn gebruiktin porties langer dan 2 maanden. </li></ol></li><li> Pre-warm een ​​verwarmingsblok op de gewenste temperatuur. Deze temperatuur moet ten minste 5 ° C boven de smelttemperatuur (Tm) van het lipide (en) met de hoogste Tm zijn. </li><li> Bereken de lipide benodigde volumes volgens de gewenste molaire verhoudingen lipide. Voor het bestuderen van HIV-1-Gag bindend hier Gebruik de volgende molverhoudingen zoals weergegeven in tabel 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Lipid mix </td><td> molaire verhouding </td><td> Volume (in pl) </td><td> voorraadconcentratie </td></tr><tr><td> POPC + POPS + Chol </td><td> 46,6 + 23,3 + 30 </td><td> 19.74 + 10.18 + 6.57 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P2 </td><tdrowspan = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Brain-PI (4,5) P2: 1 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Volumes van verschillende lipiden gebruikt GUVs verkrijgen. <ol start="4"><li> Voeg de gewenste volumes van lipiden in een schone-schroef bedekte glazen flacon. </li><li> Gebruik ITO-gecoate glaasjes met afmetingen 25 x 50 x 1,1 mm 3 en weerstand 70-100 Ω (zoals beschreven in de catalogus). Plaats twee ITO-gecoate glaasjes op een schone bank. Elke kamer electroformation vereist twee indium-tin-oxide (ITO) gecoate glaasjes. Controleer of de geleidende zijde van het glaasje naar boven door eerst de weerstand met een multimeter. Het moet een waarde van circa 200 Ω tonen. Zorg ervoor dat het oppervlak van de dia&#39;s zijn schoon door het voorzichtig af te vegen met 70% ethanol met behulp van niet-pluizende doekjes. </li><li> Reinig het buitenoppervlak van een naald van een spuit door rinsing het met chloroform en leg de spuit op de hitte blok. </li><li> Plaats een nieuwe ITO-gecoate glasplaatje op het verwarmingsblok met geleidende zijde naar boven en laat de temperatuur ervan op de gewenste temperatuur gewoonlijk ongeveer 2-3 min. Niet opnieuw de ITO-gecoat glas dia&#39;s voor een potentieel risico dat de ITO-coating op het glas dia&#39;s kunnen worden beschadigd tijdens het schoonmaken procedures. </li><li> Gebruik een volume van 40-50 gl van het lipide mengsel per dia uniforme en toch snelle verspreiding van de lipiden op de glasplaatje. Stel het totale volume met een geschikt organisch oplosmiddel zoals chloroform. <ol><li> Plaats de helft van het totale volume van het lipide mengsel op het glaasje en onmiddellijk verspreid het lipide met de gereinigde injectiespuit (stap 2,6) een gelijkmatige lipidefilm reactie (verplaatsen van de naald 2-3 keer in de dia). Spreid de lipide film voorzichtig (maar snel) om schade aan de dunne ITO coating te voorkomen. Non-uniform verspreiden of ruw verspreiden kan leiden tot suboptimaleopbrengsten of computationele heterogeniteit van GUVs. </li><li> Daarom zorgen voor een gelijkmatige spreiding van het inspecteren van de lipide film na te verspreiden voordat wordt overgegaan tot de volgende stap. Indien de opaciteit van de film verschijnt overmatig niet-uniform, opnieuw de procedure met een nieuwe dia. </li></ol></li><li> Plaats de gecoate glijbaan in een petrischaal met de gecoate zijde naar boven. </li><li> Herhaal stap 2,6-2,9 voor de rest van het mengsel een andere ITO-gecoate slide. </li><li> Plaats de petrischaal die zowel de objectglaasjes in een conventionele vacuüm uitdroging kamer gedurende 60-90 min om alle sporen van organische oplosmiddelen te verwijderen. </li><li> Tijdens dit proces zet de incubator tot dezelfde temperatuur als die van het verwarmingsblok (65 ° C in de meeste gevallen) en voorverwarmen 300 mM sucrose oplossing in de incubator. </li><li> Na het drogen, breng de petrischaal naar de bank en zet het glaasje op een schone ondergrond. </li><li> Reinig een PDMS pakking (figuur 1) met behulp van 70% ethanol en droog het completely. </li><li> Plaats het op de lipide gecoat glasplaatje zie figuur 1 en zacht en stevig op, zodat de pakking vormt een waterdichte afdichting. Bevestigen de afwezigheid van spleten tussen de PDMS pakking en de glijbaan. Dit resulteert in de vorming van een ondiepe kamer die de sucrose oplossing bevat. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> Figuur 1:. De lay-out van de ITO-gecoate glasplaatje gebruikt voor electroformation <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="16"><li> Vul de kamer met voorverwarmde sucrose-oplossing zonder bubbels. </li><li> Plaats de andere gecoate slide op de top om een ​​goede afdichting te maken. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen. De eindassemblage moet verschijnen zoals weergegeven in figuur 2. Bevestig de kamer using bindmiddel clips. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> Figuur 2:. Schematische weergave van de electroformation kamer (zijaanzicht) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="18"><li> Verwijder het teveel aan sucrose door aspiratie en het reinigen van de dia&#39;s met behulp van niet-pluizende doekjes. Bevestig de dia&#39;s om de koperen staaf, zodat de geleidende zijkanten zijn in uniform contact met de bar. Gewaarborgd dat slechts één geleidende zijde van het glaasje in contact met een koperen staaf. </li><li> Sluit de koperen bar om de functie generator uitgang met behulp van de alligator clips. Plaats het geheel in de incubator zodat het samenstel de temperatuur ervan op de gewenste temperatuur. </li><li> Breng een sinusgolf frequentie van 10 Hz en een potentiaalverschil van 1 V gedurende 90 min. Ensure of de spanning V 1 een multimeter zie figuur 3. Voortzetten van 90 min. </li></ol><img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> Figuur 3:. De posities waar de elektroden van de multimeter voor het meten van frequentie en stroom zijn geplaatst <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="21"><li> Na 90 min langzaam verminderen de frequentie 2 Hz en verder electroformation nog eens 10 min. Gedurende deze tijd, oogst in vitro translatiereacties (stappen 3.1-3.2). </li><li> Schakel de functiegenerator en laat het geheel afkoelen tot kamertemperatuur langzaam (door het uitschakelen van de incubator en laat de incubator deur iets open). </li><li> Na afkoeling, ontkoppel de kabels aan de generatorde schuifsamenstellen. GUVs kan heel kwetsbaar zijn en daarom moeten zeer voorzichtig worden omgegaan. breng het geheel voorzichtig naar de bank. </li><li> Demonteer de kamer door voorzichtig verwijderen van de bovenste dia behulp van een tang. Oogst de sucrose suspensie die GUVs met behulp van een cut 1000 ul tip en transfer naar een schone buis. Behandel de buis voorzichtig om verstoring van GUVs voorkomen. </li><li> Gebruik de GUVs onmiddellijk. GUVs stabiel gedurende ten minste 90 min na de oogst indien bewaard bij kamertemperatuur. </li></ol> 3. Oogst In Vitro Vertaling Reacties <ol><li> Oogst de in vitro translatie reacties die gewenste eiwitten van de rode kamer met behulp van een micropipet in een buis. </li><li> Geaggregeerde eiwitten te verwijderen, draai de lysaten bij 16.200 xg gedurende 15 minuten op een tafelblad centrifuge en voorzichtig de bovenstaande vloeistof over te dragen naar een andere buis. </li></ol> 4. GUV Binding Assay <ol><li> Met behulp van een cut tip, meng 51, l in vitro translatie reacties die vertaald eiwitten en 5 gl GUVs in een buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2-3 min. </li><li> Bevestig een PDMS plaat met een klein gaatje (3-4 mm diameter) op een schoon dekglas en zorgen voor afdichting door voorzichtig en stevig aan te drukken tegen de dekglaasje. </li><li> Plaats de 10 pi mengsel uit stap 4.1 in het gaatje. </li><li> Beeld van het mengsel onder een geïnverteerde epi of confocale fluorescentiemicroscoop bij kamertemperatuur. Opmerking: Om verdamping te voorkomen, kan de beeldvorming kamer worden gedekt door een dekglaasje. </li></ol>

<ol><li>Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+in+support+of+RNA-mediated+inhibition+of+phosphatidylserine-dependent+HIV-1+Gag+membrane+binding+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells.</a> J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).</li>
<li>Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+mechanisms+involving+RNA+and+lipids+regulate+HIV-1+Gag+membrane+binding+through+the+highly+basic+region+of+the+matrix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).</li>
<li>Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+matrix+domain+and+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+is+essential+for+efficient+gag+membrane+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding.</a> J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+membrane-binding+domain+within+the+amino-terminal+region+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+protein+which+interacts+with+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids.</a> J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).</li>
<li>Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+%284%2C5%29+bisphosphate+regulates+HIV-1+Gag+targeting+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).</li>
<li>Saad, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+targeting+HIV-1+Gag+proteins+to+the+plasma+membrane+for+virus+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).</li>
<li>Shkriabai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+HIV-1+Gag+with+assembly+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors.</a> Biochemistry. 45 (13), 4077-4083 (2006).</li>
<li>Vlach, J., Saad, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trio+engagement+via+plasma+membrane+phospholipids+and+the+myristoyl+moiety+governs+HIV-1+matrix+binding+to+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).</li>
<li>Anraku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+analysis+of+the+interaction+between+HIV-1+Gag+and+phosphoinositide+derivatives+based+on+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. 49 (25), 5109-5116 (2010).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Gag+associates+with+specific+uropod-directed+microdomains+in+a+manner+dependent+on+its+MA+highly+basic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region.</a> J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).</li>
<li>Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gag+localization+and+virus-like+particle+release+mediated+by+the+matrix+domain+of+human+T-lymphotropic+virus+type+1+Gag+are+less+dependent+on+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+than+those+mediated+by+the+matrix+domain+of+HIV-1+Gag%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag.</a> J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).</li>
<li>Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+and+subcellular+localization+of+retroviral+Gag+proteins+are+differentially+regulated+by+MA+interactions+with+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA.</a> MBio. 5 (6), e02202(2014).</li>
<li>Valentine, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+micelle+encapsulation+of+membrane-anchored+proteins+for+solution+NMR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies.</a> Structure. 18 (1), 9-16 (2010).</li>
<li>Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Gag+protein+can+sense+the+cholesterol+and+acyl+chain+environment+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).</li>
<li>Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+multimerization+on+membrane+association+of+Rous+sarcoma+virus+and+HIV-1+MA+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins.</a> J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).</li>
<li>Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+matrix+binding+to+membranes+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids.</a> J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).</li>
<li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation%3A+a+comparison+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li>
<li>Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermomechanical+and+transition+properties+of+dimyristoylphosphatidylcholine%2Fcholesterol+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers.</a> Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).</li>
<li>Darszon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassembly+of+protein-lipid+complexes+into+large+bilayer+vesicles%3A+perspectives+for+membrane+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).</li>
<li>Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h, Faucon, F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Progr+Colloid+Polymer+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields.</a> Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).</li>
<li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li>
<li>Yamauchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consensus+motif+for+N-myristoylation+of+plant+proteins+in+a+wheat+germ+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system.</a> FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).</li>
<li>Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-%284%2C5%29-Bisphosphate+Acyl+Chains+Differentiate+Membrane+Binding+of+HIV-1+Gag+from+That+of+the+Phospholipase+Cdelta1+Pleckstrin+Homology+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).</li>
<li>Morales-Penningston, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUV+preparation+and+imaging%3A+minimizing+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li>
<li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).</li>
<li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxides+promote+large+rafts%3A+effects+of+excitation+of+probes+in+fluorescence+microscopy+and+electrochemical+reactions+during+vesicle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation.</a> Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li>
<li>Montes, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+native+membranes+and+organic+lipid+mixtures+for+the+study+of+lipid+domains+under+physiological+ionic-strength+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions.</a> Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).</li>
<li>Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+played+by+acidic+lipids+in+HIV-1+Gag+membrane+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding.</a> Virus Res. 193, 108-115 (2014).</li>
<li>Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimerizable+HIV+Gag+derivative+binds+to+the+liquid-disordered+phase+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).</li>
<li>Carlson, L. A., Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+the+ordered+assembly+of+the+endosomal+sorting+complex+required+for+transport+at+membrane-bound+HIV-1+Gag+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).</li>
<li>Gui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+minimal+in+vitro+system+for+analyzing+HIV-1+Gag-mediated+budding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding.</a> J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).</li>
<li>Prevost, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRSp53+senses+negative+membrane+curvature+and+phase+separates+along+membrane+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules.</a> Nat Commun. 6, 8529(2015).</li>
</ol>

We verklaren dat we geen tegenstrijdige belangen hebben.

De GUV bindingstest zoals hierboven beschreven is, een goed alternatief scenario waar andere eiwit-lipide interacties assays hebben hun beperkingen. Deze test laat ons toe om interacties tussen gemyristoyleerde full-length Gag en zure lipiden met native-length acylketens in de lipide bilaag context te onderzoeken en doen dat zonder langdurige beursgang centrifugeren door middel van high-density sucrose gradiënten of andere post-bindende verwerking van Gag-lipide complexen. Een ander voordeel is dat het gedrag van Gag in...

Humaan immunodeficiëntievirus type 1 (HIV-1) is een omhuld virus dat assembleert op en knoppen van de plasmamembraan (PM) in de meeste celtypen. Het samenstel van HIV-1 virusdeeltjes wordt aangedreven door de 55 kDa viruskern eiwit Pr55 Gag (Gag). Gag wordt gesynthetiseerd als een precursor polyeiwit uit vier belangrijke structurele domeinen, namelijk matrix, capside, nucleocapside, en p6, evenals twee afstandhouder peptiden SP1 en SP2. Bij de montage, de matrix (MA) domein is verantwoordelijk voor het richten van Gag aan de plaats, het capside (CA) domein bemiddelt Gag-Gag interacties, het nucleocapside (NC) domein werft viraal genoom RNA en p6 rekruten gastheer factoren die steun virusdeeltje splitsing van het plasmamembraan. Gag ondergaat een co-translationele modificatie door de toevoeging van een 14-koolstof vetzuur of myristaat deel aan zijn N-terminus. Membraanbinding van Gag is een essentiële voorwaarde voor de virale assemblage, aangezien mutants dat defect is in membraan binding zijn niet aan virusdeeltjes te produceren. Wij en anderen hebben aangetoond dat membraanbinding van Gag wordt gemedieerd door tweedelige signalen in de MA domein: het N-terminale myristaat groep die hydrofobe wisselwerkingen medieert de lipide bilaag en een cluster van basische resten in de MA domein aangeduid als zeer basisgebied ( HBR) die interageert met zure lipiden op de PM 1-4. Studies van Gag-membraaninteracties behulp ectopische expressie van polyphosphoinositide 5-fosfatase IV (5ptaseIV), een enzym dat de hydrolyse van PM-specifieke zure fosfolipiden phosphatidylinositol- katalyseert (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] aan fosfatidylinositol-4-fosfaat, in cellen suggereerde dat Gag-PM lokalisatie wordt gemedieerd door PI (4,5) P2 3,5. In vitro studies uitvoeren om meer inzicht mechanistische informatie van Gag-PI (4,5) P2 interacties bewezen uitdagend om een aantal redenen. VoorZo is zuivering van volledige lengte gemyristoyleerde HIV-1 Gag biochemische experimenten technisch moeilijk ten minste gedeeltelijk als gevolg van de neiging van Gag te aggregeren tijdens de zuivering. Derhalve afgeknotte vormen van HIV-1 Gag, zoals Myr-MA of Myr-MA-CA, of niet-gemyristoyleerde vorm zijn veelvuldig bij studies die Gag zuivering vereisen (bijvoorbeeld kernmagnetische resonantie, eiwitten footprinting en oppervlak plasmon resonance 6-9). Als alternatief gekoppelde in vitro transcriptie-translatie reacties zijn gebruikt om full-length gemyristoyleerde HIV-1 Gag in andere biochemische studies 1,2 produceren. Typisch in dit systeem wordt een Gag-coderende plasmide getranscribeerd en getranslateerd met eukaryote cellysaten (bijvoorbeeld konijn reticulocyten-lysaten) die zonder enige celmembranen en messenger RNAs zijn maar bevatten de machines voor transcriptie en translatie. Na de reactie worden cellysaten bevattende Gag gemengd met membranes voor de analyse van de Prop van de interacties met lipiden. Naast het gemak van het bereiden van volledige lengte gemyristoyleerde Gag, methoden waarbij de in vitro transcriptie translatiesysteem een voordeel dat Gag synthese en daaropvolgende membraan bindingsreacties plaatsvinden in een &#39;eukaryote cytosol-achtige &quot;milieu die beter kunnen vormen fysiologische omstandigheden. Deze eigenschap heeft bijgedragen aan de studies waaruit bleek dat RNA-moleculen gebonden aan de MA-domein te reguleren Gag binding aan zure lipiden in een competitieve manier 1,2,10-12. Aangezien de totale hoeveelheid eiwitten verkregen Gag deze cellysaten zijn niet hoog, metabolisch merken van eiwitten met radioactief gemerkte aminozuren nodig voor de signalering. Afhankelijk van de methode Gag-lipide interacties te meten, hebben diverse membraan preparaten gebruikt. Elk van deze methoden heeft zijn sterke en zwakke punten. De meeste NMR-gebaseerde testen vereisen het gebruik van lipiden met korte acylgroepketens die in water oplosbare (bijvoorbeeld C4 en C8-PI (4,5) P2) 6,8 zijn. Terwijl NMR methoden voor binding van Gag testen om de lipiden die lange acylketens in cellen ontwikkeld hebben, zijn zij gebruikt alleen of gemyristoyleerde nonmyristoylated MA dusver 8,13. Als alternatief hebben liposomen bereid van lipiden die inheemse lengte acylketens zijn gebruikt in biochemische methoden, zoals liposoom beursgang of fluorescerende liposoom bead bindingstesten 2,3,10,14-16. Echter, liposomen gebruikt in deze testen hebben kleine diameters, en zo hun membranen steile positieve krommingen. Daarentegen, tijdens de vroege fase van deeltjes samenstel in HIV-1-geïnfecteerde cellen, Gag bindt aan de PM, die nagenoeg planair is op de schaal van Gag en vervolgens induceert negatieve kromming tijdens dop. Daarom zou liposoom membranen met steile en positieve kromming niet ideaal lipidendubbellagen aan Gag-lipide interacties te bestuderen. Zoals voor liposoom flotatie testen andere potentiële nadeel is dat blootstelling van Gag-lipidecomplexen hypertone sucrosegradiënt centrifugatie kan tijdens de experimentele resultaat beïnvloeden. Om deze beperkingen te verlichten en een aanvullend experimenteel systeem, zijn assays voor Gag binding aan grote unilamellaire vesicles (GUVs) zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren. GUVs zijn enkele lipide dubbellaag vesicles waarvan de diameters vergroten tot enkele tientallen micrometers. Dus de kromming van deze membranen lijkt de PM op de schaal van Gag. Bovendien, vanwege de grote omvang, die visuele inspectie mogelijk maakt onder Optische microscopen, membraan binding van fluorescent gelabeld of gemerkt Gag proteïnen deze blaasjes na mengen kan gemakkelijk worden bepaald zonder verdere behandeling van Gag-lipidecomplexen. We beschrijven hier een protocol bij HIV-1 Gag membraan binding met behulp van GUVs verkregen uit een electroformation methode te bestuderen. Verschillende methoden zoals zachte hydratatie-gel bijgestaan ​​hydratatie, microfluidic jetting en electroformation 17-22 zijn gebruikt om GUVs verkrijgen. Voor de hier beschreven protocol, wordt de electroformation methode vooral vanwege zijn efficiëntie bij het vormen GUVs met zure lipiden en het relatieve gemak van gebruik zonder de noodzaak van dure opstellingen. Aangezien visualisatie van Gag vereist een fluorescerende reporter wordt geel fluorescerend eiwit (YFP) genetisch toegevoegd aan de C-terminus van Gag (Gag-YFP). Gag-YFP eiwitten verkregen door in vitro transcriptie en translatie reacties tarwekiemen lysaten basis van de voortdurende uitwisseling continue stroom (CECF) technologie. In deze techniek, zowel verwijderen van remmende bijproducten van de reacties en de levering van de reactie substraten en energiecomponenten worden bereikt in een dialyse-gebaseerde mechanisme. Voor deze reacties, wordt een plasmide coderend Gag-YFP onder de controle van een T7 promoter gebruikt. Van de nota, zoals eerder aangegeven, tarwekiemen lysaten ondersteunen myristoylatie zonder extra componenten 23,24. Deze methode is het mogelijk om voldoende hoeveelheden full-length gemyristoyleerde Gag-YFP voor visualisatie van Gag op GUV membranen 24 te verkrijgen. Hier beschrijven we het protocol waarmee HIV-1 Gag binding aan PI (4,5) P2 bevattende GUV membranen kan worden onderzocht zonder langdurige verdere verwerking volgende bindende reacties en voor te stellen dat deze methode een aanvulling op reeds bestaande Gag-membraan binding assays en kan uitgebreid tot verder te begrijpen HIV-1-Gag-membraan bindend.

<table><tbody><tr><td>Digital Multimeter</td><td>Meterman</td><td>30XR</td><td>Een generiek multimeter dat weerstand en volt kan meten, zal volstaan.</td></tr><tr><td>Function Generator</td><td>Instek</td><td>GFG-8216A</td><td>Een generieke functiegenerator die in staat is om een sinusgolf te genereren bij 10 Hz en 1 V, is voldoende.</td></tr><tr><td>ITO coated glass slides</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO</td><td>CG-90IN</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hoefer</td><td></td><td>Elke incubator die de temperatuur nauwkeurig kan handhaven, zal voldoende zijn</td></tr><tr><td>Vacuum chamber</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td>Gauge 22S, Spuitnummer 702</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning</td><td>Sylgard, 184</td><td></td></tr><tr><td>RTS 100 Wheat Germ CECF Kit</td><td>BiotechRabbit, Berlijn, Duitsland</td><td>BR1401001</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA&nbsp;</td><td>D7757</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL&nbsp;</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700041P</td><td></td></tr><tr><td>Brain-PI(4,5)P2&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van hiv-1 gag binding aan giant unilamellaire bolletjes (guv) membranen

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

De structurele eiwitten van HIV-1, Pr55 Gag (of Gag), bindt aan het plasmamembraan van cellen tijdens de virus assemblageproces. Membraanbinding van Gag is een essentiële stap voor de vorming virusdeeltje, omdat een defect in Gag membraan binding resulteert in een ernstige vermindering van virale deeltjes productie. Mechanistisch data van Gag-lipide membraaninteracties krijgen, in vitro methoden op basis van NMR, eiwit voetafdruk, oppervlakte plasmon resonantie, liposoom flotatie centrifugatie of fluorescentie lipide bead binding tot dusver ontwikkeld. Echter, elk van deze in vitro werkwijzen zijn beperkingen. Sommige van deze beperkingen te overwinnen en zorgen als aanvulling op de eerder vastgestelde methoden, ontwikkelden we een in vitro assay waarbij interacties tussen HIV-1 Gag en lipidemembranen plaatsvinden in een &quot;cel-achtige&quot; omgeving. In deze test, Gag binding aan lipide membranen visueel geanalyseerd met YFP-Tagged Gag gesynthetiseerd in een tarwekiemen-gebaseerde in vitro translatie-systeem en GUVs voorbereid door een electroformation techniek. Hier beschrijven we de achtergrond en de protocollen gemyristoyleerde full-length Gag eiwitten en GUV membranen die nodig zijn voor de test te verkrijgen en om binding door microscopie detecteren Gag-GUV.

<html> Onder toepassing van bovenstaande protocol bereidden wij GUVs samengesteld uit POPC + + pops Chol (molverhouding: 4,66: 2,33: 3). Deze samenstelling werd gekozen benadering de PS en cholesterol concentraties van de PM. Robuuste en efficiënte binding van Gag werd alleen waargenomen wanneer brain-PI (4,5) P2 werd opgenomen in de POPC + POPS + Chol mengsel (POPC + POPS + Chol + brain-PI (4,5) P2 [molverhouding : 4: 2: 3: 1] in dit voorbeeld) (Figuur 4,</s...

We illustreren hier een in vitro membraanbindingstest waarin interacties tussen HIV-1 Gag en lipidemembraan visueel worden geanalyseerd met behulp van YFP-gelabelde Gag gesynthetiseerd in een tarwekiem-gebaseerd in vitro translatiesysteem en GUV's bereid door middel van een elektrovormingstechniek.

Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van de binding van HIV-1 Gag aan membranen van gigantische unilamellaire vesicles. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de bio-assemblage, zoals de rollen van lipiden met verschillende staartketens bij membraanbinding of virostructurele eiwitten, zoals in vitro virale Gag-eiwitten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de membraanbinding van Gag visueel kan worden gedetecteerd op membranen van gigantische unilamellaire vesicles, direct na het mengen, waardoor potentieel schadelijke en langdurige stappen na het mengen worden vermeden. De preparatie van HIV-1 Gag wordt beschreven in het tekstprotocol en moet één dag voorafgaand aan de preparatie van de GUV's worden uitgevoerd.Haal de lipidevoorraden uit de vriezer en laat ze op kamertemperatuur komen. Stel ondertussen de temperatuur van het warmteblok in op ten minste vijf graden celsius boven de hoogste smelttemperatuur van de gebruikte lipiden. In deze demonstratie is de temperatuur ingesteld op 65 graden celsius, de hoogste temperatuur die wij hebben gebruikt.De lipiden moeten worden opgelost in anorganische oplosmiddelen, worden bewaard in glazen vials met Teflon-gevoerde schroefdoppen en worden omwikkeld met Parafilm. Zorg er na het ontdooien voor dat de suspensies helder zijn. Bereken de benodigde lipidvolumes op basis van de gewenste molaire/lipid-verhoudingen. Verdeel vervolgens de berekende volumes in een schoon, glazen flesje met schroefdop met behulp van een chloroformbestendig hulpmiddel, zoals een glazen spuit van het type Hamilton. Vul het totale volume aan met een geschikt organisch oplosmiddel, zoals chloroform. Bereid vervolgens twee nieuwe ITO-gecoate dia's voor voor elke elektroformatiekamer.Verifieer of de geleidende zijde van het objectglas naar boven is gericht door de weerstand te controleren met een multimeter, welke ongeveer 200 ohm moet zijn. Reinig vervolgens voorzichtig de oppervlakken met 70% ethanol en pluisvrije doekjes. Reinig daarna het buitenste oppervlak van de injectienaald door deze te spoelen met chloroform en plaats de spuit op het warmteblok.Plaats daarnaast de gereinigde ITO-gecoate objectglaasjes op het warmteblok, met de geleidende zijde naar boven. Binnen enkele minuten bereiken de objectglaasjes de gewenste temperatuur. Voeg vervolgens 40 tot 50 µL van het lipidemengsel toe aan een van de objectglaasjes.Het lipide moet snel, maar zo uniform mogelijk worden verspreid. Voeg vervolgens nogmaals een half volume van het lipidemengsel toe aan een ander glasplaatje en verspreid dit onmiddellijk om een uniforme lipidefilm te vormen. Werk snel en voorzichtig om beschadiging van de dunne ITO-coating te voorkomen.Als de opaciteit van de film overmatig niet-uniform lijkt, herhaal de procedure dan met een nieuwe objectglas. Maak vervolgens een tweede paar objectglazen voor een ander lipidenmengsel zoals bij het eerste. Een uniforme laag lipiden is noodzakelijk voor optimale GUV-opbrengsten en compositionele uniformiteit van de GUV's.Bewaar de objectglazen gedurende 60 tot 90 minuten in een vacuüm-dessicatorkamer om sporen van organisch oplosmiddel te verwijderen. Stel voor de volgende stap een incubator in op de temperatuur van het warmteblok dat in de vorige stappen is gebruikt, en verwarm een voorraad 300 millimolair sucrose-oplossing tot die temperatuur. Bereid daarnaast een PDMS-pakking voor door deze voorzichtig af te vegen met 70% ethanol en volledig te laten drogen.Zodra de objectglazen zijn opgedroogd, plaatst u deze op een schoon oppervlak en drukt u de pakking voorzichtig maar stevig op één objectglas, zodat de pakking een waterdichte afsluiting vormt. Controleer of er geen luchtbellen zitten tussen de PDMS-pakking en het objectglas. Vul vervolgens de pakking volledig met de voorverwarmde sucrose-oplossing.Zorg dat er geen luchtbellen achterblijven. Plaats vervolgens het andere gecoate objectglas op de pakking, uitgelijnd met het eerste objectglas. Controleer of er geen luchtbellen aanwezig zijn en bevestig de kamer met klemmen.Verwijder vervolgens de overtollige sucrose-oplossing door aspiratie en maak de objectglazen schoon met pluisvrije doekjes. Bevestig daarna de assemblage van objectglazen aan een koperen staaf, zodanig dat de geleidende zijde van elk objectglas uniform contact maakt met de staaf. Sluit vervolgens de koperen staaf aan op de uitgang van de funktiegenerator en plaats de assemblage in de incubator, terwijl de funktiegenerator buiten blijft staan.Zodra de temperatuur is bereikt, wordt de functiegenerator geprogrammeerd om gedurende 90 minuten een sinusgolf van 10 Hz en een potentiaalverschil van één volt toe te passen. Controleer met een multimeter of de spanning één volt bedraagt. Verlaag na 90 minuten langzaam de frequentie naar twee Hz en zet de elektroformatie voort voor nog eens 10 minuten.Oogst tijdens deze tijd het HIV-1 Gag uit de in vitro translatiereactie die de vorige dag is opgezet. Verwijder ongewenste aggregaten door de lysaten te centrifugeren en breng het supernatant zorgvuldig over naar een andere buis. Schakel na 10 minuten bij twee Hz de functiegenerator uit, zet de incubator uit en laat de deur van de incubator openstaan totdat het assemblage is afgekoeld tot kamertemperatuur.Zodra het is afgekoeld, brengt u de objectglasassemblage voorzichtig naar de werkbank en demonteert u de kamer voorzichtig door het bovenste objectglas met een pincet te verwijderen. Draag de GUV's met een afgeknipt 1000 µL pipetpunt over naar een nieuwe buis. Behandel deze buis voorzichtig en gebruik de GUV's binnen 90 minuten.Bereid vervolgens een beeldkamer voor. Bevestig een PDMS-vel met een klein gat op een schoon dekglas. Druk dit voorzichtig en stevig aan voor een goede afdichting.Meng vervolgens vijf microliter van de in vitro translatiereactie met vijf microliter GUV's. Na enkele minuten wordt het mengsel overgebracht naar de beeldkamer en kan men overgaan tot beeldvorming. Om verdamping te voorkomen, kan de beeldkamer worden afgedekt met een dekglas.Met behulp van het beschreven protocol werden GUV's bereid bestaande uit POPC, POPS en cholesterol in een molaire verhouding van 4,7 tot 2,3 tot 3. Fluorescentiemetingen van Gag YFP-signalen op een GUV laten zien dat deze boven de achtergrond op het GUV-oppervlak niet detecteerbaar zijn. Echter bond het Gag-YFP-eiwit efficiënt aan de GUV's wanneer brain-PIP2 aan het lipidenmengsel werd toegevoegd.Gag-binding is zichtbaar door de toename van de fluorescentie-intensiteit op het membraanoppervlak, wat bij het scannen verschijnt als een scherpe piek. Zodra de methode onder de knie is, kan deze techniek in vier tot vijf uur worden uitgevoerd, mits het eiwit in een fluorescent gelabelde vorm beschikbaar is. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig om te gaan met de GUV's en, indien mogelijk, altijd verse lipiden te gebruiken.Deze techniek heeft onderzoekers op het gebied van retrovirusassemblage in staat gesteld om membraaninteracties van retrovirale Gag-eiwitten in vitro te onderzoeken zonder langdurige procedures na menging, die de latente staat van de interacties kunnen veranderen.

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit gevisualiseerd experiment is een gids voor het gebruik van een fluorescerende moleculaire kloon van HIV voor live confocale imaging experimenten.

Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

Het protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het bepalen van de structuren van membraaneiwitten met behulp van cryo-electron tomografie-en 3D-beeldverwerking. Het omvat de details van prepareren, data verzamelen, data verwerken en interpreteren, en afgesloten met het vervaardigen van een vertegenwoordiger doelstelling voor de aanpak, de HIV-1 Envelop glycoproteïne. Deze computationele procedures zijn ontworpen op een manier die onderzoekers en studenten in staat stelt om op...

Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

Dit artikel beschrijft een methode om de vorming van een HIV-1 envelop geïnduceerde virologische synaps op glas ondersteund vlakke dubbellagen door totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie visualiseren. De werkwijze kan ook worden gecombineerd met immunofluorescentiekleuring tot activering en herverdeling van signaalmoleculen die tijdens HIV-1-geïnduceerde envelop virologische synapsvorming detecteren.

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode - electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

Dit protocol maakt gebruik van agarose zwelling als een krachtige en generaliseerbare techniek voor het opnemen van integrale membraaneiwitten (GMP's) in gigantische unilamellaire lipide blaasjes (GUVs), zoals hier beschreven voor de reconstructie van het menselijke 1A serotoninereceptoreiwit (5-HT1AR), een van de klassen van farmacologisch belangrijke G-eiwit-gekoppelde receptoren.

Constructie van modellipidenmembranen met G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)

Dit artikel introduceert een eenvoudige methode voor snelle productie van gigantische unilamellaire blaasjes met ingekapselde cytoskeletale eiwitten. De methode blijkt nuttig te zijn voor bottom-up reconstitutie van cytoskeletstructuren in opsluiting en cytoskelet-membraaninteracties.

Snelle inkapseling van gereconstitueerd cytoskelet in gigantische unilamellaire blaasjes

De diversiteit van membraanlipiden in structuur en samenstelling levert een belangrijke bijdrage aan cellulaire processen en kan een marker van ziekte zijn. Moleculaire dynamica-simulaties stellen ons in staat om membranen en hun interacties met biomoleculen met atomistische resolutie te bestuderen. Hier bieden we een protocol voor het bouwen, uitvoeren en analyseren van complexe membraansystemen.

Realistische membraanmodellering met behulp van complexe lipidenmengsels in simulatiestudies

Dit artikel presenteert een methode voor het bereiden van samengestelde Giant Unilamellaire blaasjes (cGUV's) met een blaasje-in-blaasjesstructuur, met aangepaste elektrische geleidbaarheid in binnenste, ringvormige en buitenste gebieden. Elektroformatie synthetiseert eenvoudige GUV's, die via osmotische shock worden omgezet in stomatocyten en cGUV's, wat een waardevol model biedt voor het bestuderen van de biofysica van cellen met kern.

Synthese van samengestelde reusachtige unilamellaire blaasjes: een biomimetisch model van nucleaatcellen

Leer HIV-1 Gag-binding visualiseren aan GUV-membranen met YFP-gelabelde eiwitten en elektroformatie. Deze methode biedt directe detectie zonder langdurige nabewerking en verrijkt virologisch onderzoek naar virale assemblage.

Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen

Meer video's verkennen