Gecombineerde nabij-infrarood Fluorescent Imaging en Micro-computertomografie voor het direct visualiseren Cerebral Thromboemboli

Het algemene doel van deze directe trombusbeeldgebungstechniek is om fluorescentielabelled cerebrale trombo-embolieën in vivo en ex vivo kwantitatief te visualiseren met behulp van goudnanodeeltjes, computertomografie en nabij-infrarood fluorescentiebeeldvorming. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van hemostase en trombose, zoals de tijd- of dosisafhankelijke en ernstige orthopedische respons van cerebrale trombo-embolieën op weefselplasminogeenactivator of nieuwe trombolytische middelen die momenteel worden onderzocht. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat micro-CT met een hoge resolutie, na intraveneuze injectie van goudnanodeeltjes, in staat is om de dynamische evolutie van cerebrale trombo-embolieën vast te leggen door hun locaties en belasting kwantitatief in vivo te visualiseren, wat vervolgens wordt bevestigd door ex vivo nabij-infrarood fluorescentiebeeldvorming van de trombus.

De procedure wordt gedemonstreerd door Jeong-Yeon Kim, een postdoc uit mijn laboratorium. Nadat er 300 tot 1 000 µL arterieel bloed is verzameld via hartpunctie, voegt u 70 µL van de sample toe aan 30 µL van de passende geactiveerde stollingsfactor, een fluorescerende probe die gevoelig is voor fibrinocrosslinking-activiteit gemedieerd door factor XIII, en vult u een spuit van 3 mL, voorzien van een naald van gauge 23, met het resulterende mengsel. Injecteer vervolgens het gelabelde bloed in een polyethyleenbuis van 20 cm lang en laat het bloed stollen bij kamertemperatuur.

Na twee uur wordt de buis gedurende 22 uur op vier graden Celsius bewaard, waarna de buis in stukken van 1,5 centimeter wordt gesneden. Gebruik een spuit van drie milliliter gevuld met PBS om de trombus uit elk stuk buis in individuele wells van een six-well plaat met PBS te spoelen. Was de trombi drie keer met PBS, steek vervolgens een met saline gevulde spuit van één milliliter, voorzien van een naald van 30 gauge, in één uiteinde van een PE10-buis van 15 centimeter en trek voorzichtig een enkele gewassen trombus naar het andere uiteinde van de buis.

Verbind vervolgens de met trombus geladen PE10-buis met een PE50-buis van drie centimeter lang met een taps toelopend uiteinde van 200 micron diameter. Nadat de anesthesie is bevestigd door een gebrek aan reactie op een knijpreflex in de teen, wordt het operatiegebied gedesinfecteerd met Betadine en 70% alcohol en wordt er met een scalpel een verticale incisie van één centimeter gemaakt tussen het linkeroor en het oog. Plak het distale uiteinde van de optische vezel van een laser-Doppler flowmeter op het blootgelegde oppervlak van het linker slaapbeen, één millimeter links en vier millimeter onder het bregma, en start de Doppler-monitoring.

Maak vervolgens een verticale midline-incisie van drie centimeter door de perivasculaire zachte weefsels om het gebied van de linker carotisbulbus bloot te leggen. Ligueer met een steriele 6-0 zwarte zijden hechtdraad de linker proximale arteria carotis communis, gevolgd door de ligatie van de linker arteria carotis interna en de linker arteria pterygopalatina met steriele 7-0 zwarte zijden hechtdraden. Cauteriseer met een monopolaire elektrische cauterisator de linker arteria thyroidea superior en gebruik vervolgens steriele 7-0 zwarte zijden hechtdraden om de linker proximale arteria carotis externa losjes te ligeren en het distale uiteinde van het vat strak te ligeren.

Gebruik microscharen om een gat van 0,2 tot 0,25 micron te maken tussen de ligatieplaatsen van de arteria carotis externa en voer de trombusbevattende katheter in het gat in terwijl de proximale ligatie van de arteria carotis externa wordt versoepeld. Voer de katheter verder door naar de arteria carotis communis om de katheter op zijn plaats te fixeren en trek de proximale ligatie van de arteria carotis externa opnieuw aan. Snijd het distale uiteinde van de arteria carotis externa door met cauterisatie en roteer het vrije proximale uiteinde van de arteria carotis externa met de klok mee om het vat uit te lijnen met de arteria carotis interna terwijl de katheter wordt teruggetrokken.

Maak vervolgens de ligatuur van de arteria carotis interna los en schuif de katheter onmiddellijk ongeveer negen millimeter door naar de bifurcatie van de arteria cerebri media en de arteria cerebri anterior. Trek de hechting van de arteria carotis interna nu opnieuw strak rond de katheter en druk voorzichtig op de spuit om de trombus in het bifurcatiegebied te injecteren. Indien op de Doppler een bloedstroom wordt waargenomen die gelijk is aan of meer dan 30% lager is dan de baseline, verwijder dan de katheter en ligeer onmiddellijk het proximale uiteinde van de arteria carotis externa.

Om de trombus op het juiste experimentele tijdstip in beeld te brengen met micro-computertomografie, verdun de op fibrine gerichte goudnanodeeltjes tot een concentratie van 10 milligram per milliliter in 10 millimolair PBS en soniceren het beeldvormingsmiddel voor de trombus gedurende 30 minuten om een homogene suspensie van de nanodeeltjes te waarborgen. Injecteer vervolgens 300 microliter van de op fibrine gerichte deeltjes in de penisader van het proefdier. Plaats het dier op de tafel van de micro-CT-scanner en gebruik een touwtje bevestigd aan een pin om voorzichtig aan de bovenste voortanden te trekken om de nek te strekken.

Begin vijf minuten na het injecteren van de goudnanodeeltjes met de beeldvorming. Om de trombus te visualiseren via ex vivo nabij-infrarood beeldvorming, plaatst u het uitgesneden hersenweefsel in de imager met de basis naar boven gericht. Maak beelden van de fluorescentielabelled thrombo-embolieën in de arteriën van de cirkel van Willis.

Positioneer vervolgens het weefsel met de vertex naar boven en beeld de corticale trombo-embolieën af. Hydrateer het weefsel met een paar druppels zoutoplossing en maak vervolgens, met behulp van een brain matrix-apparaat volgens de instructies van de fabrikant, snel zes coronale hersensecties van twee millimeter dik. Houd de secties gehydrateerd met zoutoplossing en maak aanvullende nabij-infraroodbeelden van zowel de voor- als achterzijde van de secties.

Om het trombusoppervlak na micro-CT-beeldvorming te kwantificeren, opent u de bestanden van de beeldreeks en selecteert u Image, vervolgens Type en daarna 8-bit om de beelden om te zetten naar 8-bit grijswaarden. Wanneer één pixel van de CT-beeldbestanden overeenkomt met 0,053 millimeter, gebruikt u Analyze Set Scale om één, 0,053 en millimeter in te voeren voor respectievelijk Distance in pixels, Known distance en Unit of length. Kies vervolgens onder Edit voor Selection en daarna Specify om een region of interest te plaatsen op een gebied van het hersenparenchym zonder trombus of botgerelateerde hyperdense regio.

Omdat het opgegeven interessegebied van toepassing is op elke doorsnede van de stapel, moet worden bevestigd dat het gebied in geen enkele doorsnede overlapt met een hyperdense regio. Selecteer vervolgens onder Plugin de optie Region of Interest and Background Subtraction vanuit Region of Interest en voer twee in bij Number of standard deviations from the mean. Zoek thromboembolie-gerelateerde hyperdense laesies en zoom in op het laesiegebied.

Kies nu Image, gevolgd door Adjust en Threshold, en voer een Lower Threshold Level van 22 en een Upper Threshold Level van 255 in. Selecteer Over/Under om de pixels onder de onderste drempelwaarde in blauw, de gedrempelde pixels in grijstinten en de pixels boven de bovenste drempelwaarde in groen weer te geven. Gebruik vervolgens de Freehand-selectietool om regio's van belang te tekenen rond de hyperdense laesies gerelateerd aan trombo-embolieën, zonder botstructuren mee te nemen.

Gebruik Analyze, Set Measurements om Area, Mean gray value en Integrated density area times mean te selecteren. Vink de volgende opties aan: Limit to threshold en Display label. Gebruik Analyze Measure om de gekwantificeerde gegevens te verkrijgen en sla vervolgens de resultaten op.

Deze baseline micro-CT-beelden werden in vivo verkregen vijf minuten na de injectie van fibrin-getargete goudnanodeeltjes, één uur na een embolische beroerte bij muizen. De cerebrale trombus is duidelijk zichtbaar in het gebied van de bifurcatie van de arteria cerebri media en anterior van de distale arteria carotis interna. De follow-up micro-CT-beelden tonen geen veranderingen in de trombus van de cirkel van Willis bij de met saline behandelde dieren; echter vertonen de met weefselplasminogenactivator behandelde dieren een geleidelijke oplossing van de trombus van de cirkel van Willis in de loop van de tijd, aangegeven door de blauwe pijlpuntjes.

Er is een sterke correlatie tussen de in vivo CT-densiteit en de ex vivo nabij-infrarode beeldvorming voor residuele trombo-embolieën na 24 uur. In deze afbeeldingen komen bijvoorbeeld de hyperdense micro-CT-gebieden, gevisualiseerd door fibrin-targetende gouddeeltjes, direct overeen met de nabij-infrarode signaalgebieden geïdentificeerd door de fluorescerende probe die gevoelig is voor de fibrin-crosslinkingactiviteit gemedieerd door coagulatiefactor 13A en die aan de trombus bindt tijdens het rijpingsproces van de vooraf gevormde stolsel. Verder, zoals gevisualiseerd in deze afbeeldingen, kan TTC-kleuring worden gebruikt om de effecten van trombolyse op ischemische hersenschade te beoordelen in controle-zoutoplossing vergeleken met dieren behandeld met weefselplasminogeenactivator.

Zodra deze techniek voor in vivo micro-CT-beeldvorming en ex vivo nabij-infrarood fluorescentie-beeldvorming van trombi onder de knie is, kan deze in ongeveer één uur worden uitgevoerd, mits correct uitgevoerd en wanneer de beeldvormingsprobes beschikbaar zijn. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om niet-geaggregeerde en fibrin-gerichte goudnanodeeltjes te gebruiken voor directe cerebrale trombusbeeldvorming op basis van micro-CT. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals elektronenmicroscopie of ICPMS (inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie), worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de weefseldistributie en bloedkinetiek van de goudnanodeeltjes.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van beroertes of cardiovasculair onderzoek om trombo-embolieën te bestuderen in diermodellen die vatbaar waren voor coronaire trombose of embolische cerebrale infarcten. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u fluorescent gelabelde stolsels kunt maken voor trombo-embolische beroertes bij muizen en hoe u seriële beeldvorming en kwantificering van cerebrale trombo-embolieën in vivo en vervolgens ex vivo kunt uitvoeren, om zo de evolutie van de trombus te monitoren.