Name: Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer twee methoden voor het isoleren van humane monocyten om dendritische cellen te genereren met behulp van imaging flowcytometrie. Deze technieken verbeteren de betrouwbaarheid van immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek wordt ondersteund door het National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, toekenning K99/R00 AA021264. Aanvullende laboratoriumondersteuning als onderdeel van het startpakket is ontvangen van het Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, en FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro werd ondersteund door NIH/NIGMS R25 GM061347. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.

Over het algemeen menselijk bloed studies zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van FIU, IRB protocol goedkeuring # IRB-13-0440 goedgekeurd. Human leukopaks werden gekocht van de gemeenschap bloedbank in Miami, FL. 1. Isolatie van PBMC door Standard Density Gradient Technique <ol><li> Voer een 1: 1 verdunning van bloed met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing in een T75 kolf. </li><li> Pipetteer 15 ml van dichtheidsgradiënt oplossing in 50 ml centrifugebuizen en voorzichtig laag (25 - 30 ml / tube) van het verdunde bloed over dit verloop. </li><li> Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 1200 xg bij versnelling van 1 en vertraging van 0. </li><li> Na centrifugeren, verzamel de grensvlaklaag (witte bloedcellen) in een nieuwe 50 ml centrifugebuis en wassen cellen tweemaal in PBS (3 min bij 1080 x g). Gooi supernatant elke keer. </li><li> Behandel cellen met ammonium-chloride-kalium lyseren (ACK) buffer (om rode bloedcellen te lyseren). Voeg 10 ml buffer encubate gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen tweemaal met PBS, centrifugeer gedurende 3 min bij 1080 x g en verwijder het supernatant elke keer. </li><li> Sla de korrel, die de PBMC&#39;s zal bevatten. </li><li> Doorgaan met monocyt zuiveringswerkwijze van keuze. </li></ol> 2. monocyten Zuivering door Adherence Method <ol><li> Bereid volledige celcultuur medium dat L-glutamine (300 mg / ml) en aangevuld met penicilline (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) en 10% foetaal runderserum. </li><li> Sta PBMC te houden gedurende ongeveer 2 uur door ze te kweken in een T75 kolf bij een concentratie van 5 x 10 7 cellen per 10 ml compleet medium bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator. </li><li> Na incubatie verwijdert niet-hechtende cellen van drijvende kweekfles en voorzichtig te wassen hechtende cellen tweemaal met PBS. </li><li> Incubeer hechtende cellen volledig celkweekmedium aangevuld met 2 pl / ml humaan granulocyt-macrophage-koloniestimulerende factor (GM-CSF) en interleukine 4 (IL-4) opgeslagen bij een voorraad concentratie van 10 ug / ml. </li><li> Verander de helft van het medium en vul cytokines elke 48 uur. </li><li> Laat 5-7 dagen voor de differentiatie van monocyten in MDDCs. </li></ol> 3. monocyten Zuivering door magnetische scheidingswerkwijze <ol><li> Verzamelen PBMC van standaard dichtheidsgradiënt techniek, giet in een 5 ml polystyreen buis en resuspendeer in PBS buffer bij een concentratie van cellen / ml. </li><li> Voeg menselijke monocyt verrijkingscocktail gebruik 50 ul / ml cellen, goed mengen en incuberen bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Na incubatie voeg magnetische deeltjes middels 50 ul / ml cellen, goed mengen en incuberen bij 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Breng celsuspensie tot een totaal volume van 2,5 ml door toevoeging van PBS buffer, meng goed door en neer te pipetteren 2-3 keer. </li><li> Plaats de polystyreen buis zonder kap in het magnetisch apparaat en weggezet bij kamertemperatuur 2.5 minuten. </li><li> Na incubatie en in één vloeiende beweging, halen de magneet en giet de gewenste gezuiverde monocyten fractie in een schone 50 ml centrifugebuis. </li><li> Incubeer hechtende cellen volledig celkweekmedium aangevuld met 2 pl / ml humaan granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF) en interleukine 4 (IL-4) opgeslagen bij een voorraad concentratie van 10 ug / ml. </li><li> Elke 48 uur, veranderen de helft van het medium, spin down bij 1.080 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer pellet met nieuwe media (CRPMI) en cytokines. </li><li> Laat 5-7 dagen voor de differentiatie van monocyten in MDDCs. </li></ol> 4. trypanblauwexclusie levensvatbaarheid Assay Opmerking: Gebruik deze techniek om de cel opbrengst en de levensvatbaarheid van PBMCs, monocyten en MDDCs verkrijgen. <ol><li> Oogst cellen met standaard trypsine-EDTA en voer wassen van de kolven en de celpellet middels PBS. Afhankelijk van de grootte van de pellet, reschorsen 5-10 ml PBS om de pellet op te lossen. </li><li> In een micro-centrifugebuis Voer een 1: 1 verdunning van trypan blauw reagens verdund celpellet. </li><li> Vanuit deze mix, aliquot 10 pi in een cel tellen glijbaan en lezen resultaten met behulp van een geautomatiseerde celgetalmeter volgens het protocol van de fabrikant. Als een geautomatiseerde celgetalmeter niet beschikbaar is, een soortgelijke cellen is mogelijk met een hemocytometer of handmatige teller. </li></ol> 5. MTT assay <ol><li> Plaat cellen bij een concentratie van 4 x 10 4/100 gl volledig medium in elk putje in een 96-well plaat. Laat 24 uur voor de cellen aan te passen aan de cultuur. </li><li> Incubeer en uitvoeren aflezingen bij respectievelijk 0 (dag 0), 36 (dag 3) en 84 (dag 7) uur. </li><li> Bij voltooiing van de gewenste incubatie, verwijder de media en te vervangen door 100 ul van PBS alleen. </li><li> Bereid 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolium bromide oplossing (MTT) (5 mg / ml) door toevoeging van 10 ml dimethyl sulfoxide (DMSO) aan 1 g natriumdodecylsulfaat (SDS). </li><li> Voeg 10 ul (5 mg / ml) MTT-oplossing aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 extra uren. </li><li> Na incubatie, verwijder supernatanten die PBS en onbekeerde MTT mengsel (geel-kleur oplossing) bevatten. </li><li> Voeg 100 pl SDS-DMSO oplossing in elk putje en incubeer gedurende een extra uur. </li><li> Lees absorptie bij 540 nm met een microplaat reader. </li></ol> 6. celoppervlak kleuring Analyse door Imaging flowcytometrie <ol><li> Na 7 dagen differentiatie van gezuiverde monocyten, afzien 1x10 6 cellen hoeveelheden van de van monocyten afgeleide dendritische cellen in het juiste aantal 1,5 ml buizen. </li><li> Start celoppervlak kleuring blokkeert cellen middels 50 pl door hitte geïnactiveerd (HI) humaan serum, incuberen bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Na incubatie Centrifugeer cellen bij 720 g gedurende 5 min, gooi supernatant. </li><li> Om pelle celt, voeg respectieve fluorochroom-geconjugeerde antilichamen (bijvoorbeeld anti-CD 11 c of anti-CD14) en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten beschermd tegen licht. In afzonderlijke buizen, bereiden single-fluorochroom gekleurde samples / ml), omdat ze nodig zijn voor compensatie. </li><li> Na incubatie, wassen cellen tweemaal in 1 ml PBS buffer en centrifugeer telkens bij 720 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Het houden van cellen beschermd tegen licht, opnieuw te schorten in PBS buffer bij een concentratie van cellen / 100 pl voor flowcytometrie-analyse. </li><li> Om hek aan levensvatbare cellen, voeg 1 pl DAPI aan elke buis vóór het verwerven van de cellen op de cel imaging flowcytometrie instrument volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 7. Statistische analyse <ol><li> Input alle gegevens in een spreadsheet. </li><li> Vergelijk resultaten middels t-test van de student en / of one-way ANOVA waar nodig. </li><li> Beschouw verschillen statistisch significant als p &lt;0,05 is. </li&gt; </ol>

<ol><li>Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+maturation+and+antigen+presenting+function+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Imunol%22%5BJournal%5D)">Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells.</a> Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).</li>
<li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of Dendritic Cells.</a> Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Kaouther, M., Ridha, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Based+Graft+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Based Graft Tolerance.</a> ISRN Pharmacol. , (2011).</li>
<li>Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+are+the+principal+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> J Exp Med. 157, 613-627 (1983).</li>
<li>Nair, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-directed+inhibition+of+DC-SIGN+by+dendritic+cells%3A+Prospects+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy.</a> AAPS J. 7, E572-E578 (2005).</li>
<li>Agudelo, M., et al. Chapter 10. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgudelo%2C+M+%22Dendritic+Cells%3A+Types%2C+Life+Cycles+and+Biological+Functions%22">Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions</a>. , Nova Publishers. 167-177 (2010).</li>
<li>Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+dendritic+cell-tumor+fusion+cells+on+cancer+vaccines+-+past+progress+and+future+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies.</a> Immunotherapy. , (2015).</li>
<li>Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+tissue+specific+tolerance+in+autoimmune+disease+with+tolerogenic+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells.</a> Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).</li>
<li>Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+dendritic+cell+responses+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy.</a> Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).</li>
<li>Zwolak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+dendritic+cells+in+alcoholic+and+autoimmune+liver+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders.</a> Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).</li>
<li>Agudelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+functional+role+of+cannabinoid+genes+in+alcohol+users%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Alcohol+Depend%22%5BJournal%5D)">Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users.</a> Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).</li>
<li>Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+Versus+Cannabinoids%3A+A+Review+of+Their+Opposite+Neuro-Immunomodulatory+Effects+and+Future+Therapeutic+Potentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alcohol+Drug+Depend%22%5BJournal%5D)">Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials.</a> J Alcohol Drug Depend. 3, 184(2015).</li>
<li>Boukli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+ER+Stress%2C+the+Unfolded+Protein+Response%2C+and+Pro-+and+Anti-Apoptotic+Protein+Fingerprints+in+Human+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+Treated+With+Alcohol%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol.</a> Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).</li>
<li>Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+Modulates+DC-SIGN+Expression+by+Mature+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).</li>
<li>Napuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+Enhances+HIV-1+Infectivity+in+Monocyte+Derived+Dendritic+Cells+by+Suppressing+microRNA-155%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155.</a> PLoS ONE. 8, e83682(2013).</li>
<li>Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+methamphetamine+on+expression+of+HIV+coreceptors+and+CC-chemokines+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells.</a> Life Sciences. 88, 987-994 (2011).</li>
<li>Nair, M. P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+Modulates+Dendritic+Cell-Specific+C+Type+Intercellular+Adhesion+Molecule-3-Grabbing+Nonintegrin+Expression+by+Dendritic+Cells+in+HIV-1+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients.</a> J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).</li>
<li>Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+methamphetamine+%28METH%29-induced+differential+protein+expression+by+immature+dendritic+cells+%28IDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC).</a> Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).</li>
<li>Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dendritic+cells.+Enrichment+and+characterization+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood.</a> J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).</li>
<li>Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mac-1+and+p150%2C95+beta+2+integrins+bind+denatured+proteins+to+mediate+leukocyte+cell-substrate+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion.</a> Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).</li>
<li>Delirezh, N., Shojaeefar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+comparison+between+flask+adherent+and+magnetic+activated+cell+sorted+monocytes+derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Iran+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells.</a> Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).</li>
<li>Lehner, M., Holter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin-Free+Purification+of+Monocytes+for+Dendritic+Cell+Generation+via+Discontinuous+Density+Gradient+Centrifugation+Based+on+Diluted+Ficoll-Paque+Plus%3Csup%3E%C2%AE%3C%2Fsup%3E%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®.</a> Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).</li>
<li>Van Brussel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+activated+cell+sorting%3A+An+effective+approach+to+study+dendritic+cell+subsets+in+human+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques.</a> J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).</li>
<li>Mucci, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methodological+approach+for+the+generation+of+humandendritic+cells+from+monocytes+affects+the+maturation+state+of+the+resultant+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells.</a> Biologicals. 37, 288-296 (2009).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuan%2C+N+%22The+American+Association+of+Immunologists+%28AAI%29%22">The American Association of Immunologists (AAI)</a>. , AAI. Miami Beach, FL. (2007).</li>
<li>Romani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+dendritic+cell+progenitors+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Proliferating dendritic cell progenitors in human blood.</a> J Exp Med. 180, 83-93 (1994).</li>
<li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS%C2%AE-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+magnetic+activated+cell+sorted+monocytes+and+monocyte+adherence+techniques+for+in+vitro+generation+of+immature+dendritic+cells%3A+an+Egyptian+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial.</a> Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).</li>
<li>Curry, C. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCurry%2C+CV+%22Differential+Blood+Count%22">Differential Blood Count</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview">http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview</a> (2015).</li>
<li>Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+soluble+antigen+by+cultured+human+dendritic+cells+is+maintained+by+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+plus+interleukin+4+and+downregulated+by+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).</li>
<li>Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cell+Cultures+Is+Caused+by+Progenitor+Cells+Capable+of+Myeloid+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation.</a> Blood. 92, 1598-1607 (1998).</li>
<li>Ardeshna, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+proliferate+and+are+not+susceptible+to+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction.</a> Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).</li>
<li>Chapuis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+dendritic+cells+from+monocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.</a> Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).</li>
<li>Zhou, L. J., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2B+blood+monocytes+can+differentiate+into+functionally+mature+CD83%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B70%2FB7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+dendritic+cells+through+CD40+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking.</a> J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).</li>
<li>Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Linkage+of+Innate+to+Adaptive+Immunity+via+Maturing+Dendritic+Cells+In+Vivo+Requires+CD40+Ligation+in+Addition+to+Antigen+Presentation+and+CD80%2F86+Costimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation.</a> J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).</li>
<li>Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+and+maturation+on+human+monocyte-derived+dendritic+cell+surface+markers%2C+necrosis+and+antigen+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding.</a> Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).</li>
</ol>

Alle auteurs geven aan dat er geen concurrerende financiële belangen zijn.

Gebaseerd op de bekende problemen isoleren en het genereren MDDCs uit humaan bloed, deze studie gericht op een uitgebreide vergelijking van twee gevestigde werkwijzen voor het genereren van MDDCs verschaffen. De eerste methode vergeleken is een gevestigde traditionele werkwijze voor het MDDCs door gebruik van het vermogen van monocyten hechten aan glas of kunststof (hechting methode) 21,22,27. De hechting werkwijze is snel en kostenbesparend, en niet het gebruik van ingewikkelde apparatuur. Echter, een aantal...

Dendritische cellen (DCs) zijn essentiële mediatoren van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Zij functioneren primaire immuunreacties induceren en de ontwikkeling van immunologische geheugen vergemakkelijken. Deze cellen zijn primair verantwoordelijk voor antigen capture, migratie en T-cel stimulatie en worden derhalve aangeduid als professionele antigeen presenterende cellen (APC&#39;s) 1 .Manipulation van DCs kan worden gebruikt in een breed scala aan onderzoeksgebieden en de klinische setting voor de behandeling van verschillende ontstekingsziekten zoals HIV 6,7, 8 kanker, auto-immuunziekten 9 en allergische reacties 10. DC&#39;s worden ook gebruikt voor drugsmisbruik onderzoek om onbekende mechanismen en paden, zoals die in verband met afhankelijkheid van alcohol 11-14, drugsverslaving 13,15, en de combinatie van HIV-infectie en drugsmisbruik 16-19 op te lossen. Deze lopende studies en toekomstig onderzoek studies in het gebied van immunologie maken vitro generatie DCs van groot belang voor onderzoek. Er zijn echter een aantal problemen van de isolatie DCs uit menselijk bloed zij slechts 0,1 uitmaken - 1% van de totale mononucleaire cellen 20. Tot op heden enkele gevestigde werkwijzen voor het genereren van DCs in vitro uit kunststof of glas hechting van monocyten 21,22, dichtheid gradiënt centrifugatie 23 specifieke merker gebaseerde scheiding zoals magnetische geactiveerde celsortering 22, fluorescent geactiveerde celsortering 24, positieve selectie van CD14 + monocyten met behulp van dextran beklede magnetische nanodeeltjes 25 en snelle isolatie van sterk gezuiverde monocyten met behulp van volledig geautomatiseerde negatieve celselectie 26. De beste methode van keuze blijft controversieel. Daarom DC generatietechnieken verbeteren, zijn verschillende methoden ontwikkeld waarbijde zuiverheid van deze cellen sterk vergroten door differentiatie van gezuiverde CD34 + progenitor cellen en monocyten geïsoleerd uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) 27. Zoals voorafgaand genoemd, een veel gebruikte en populaire werkwijze voor het genereren van monocyten afgeleide dendritische cellen (MDDCs) is het vermogen van monocyten hechten aan glas of kunststof (hechting methode) 21,22,27 verkennen. De hechting werkwijze is een snelle en eenvoudige methode die het gebruik van complexe apparatuur vereist. Echter enige nadelen van deze werkwijze omvatten lymfocyt besmetting geringe flexibiliteit en monocyt voorbijgaande manipulatie 28. Een alternatieve methode om de hechting methode is de magnetische isolatie van monocyten van totaal PBMC&#39;s, met name het gebruik van een menselijke monocyt verrijking kit, die is ontworpen om monocyten uit PBMC geïsoleerd door negatieve selectie 26. Tijdens deze procedure worden ongewenste cellen gericht te verwijderen met tetrameerantilichaamcomplexen en dextran-beklede magnetische deeltjes. Het voordeel van deze isolatiewerkwijze is dat de ongewenste gemerkte cellen worden gescheiden met een magneet terwijl doelcellen vrij kan worden afgegoten in een nieuwe buis zonder de noodzaak voor kolommen. Tot op heden, door de beschikbaarheid van specifieke monoklonale antilichamen die unieke celpopulaties kunnen etiketteren, de magnetische scheidingstechniek is geworden, niet alleen een extra methode, maar een noodzaak voor het isoleren van zeldzame cellen op het gebied van immunologie. Bijvoorbeeld technieken zoals magnetische celsortering met een commercieel verkrijgbare paramagnetische MACS-nanodeeltjes hebben de ontwikkeling mogelijk van nieuwe benaderingen voor onderzoek en klinische toepassingen 22,29. Bovendien hebben recente studies vergelijken DC generatie van monocyten hechting en MACS technologie methoden een hogere DC zuiverheid en levensvatbaarheid aangetoond met behulp van MACS gescheiden monocyten 22,30. De huidige studie presenteerteen vergelijking tussen twee werkwijzen voor het genereren van humane DCs van monocyten geïsoleerd uit PBMC: 1) isolatie van monocyt aanhechting en 2) monocyt isolatie door negatieve selectie met behulp van een commerciële kit menselijke monocyt verrijking. Deze studie geeft aanwijzingen dat de negatieve selectie magnetische scheidingswerkwijze om monocyten te isoleren genereert de hoogste opbrengst van monocyten geen significant verschil in de levensvatbaarheid van monocyten in vergelijking met monocyten geïsoleerd door hechting methode. Op zijn beurt, na zeven dagen, de monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding onderverdeeld in MDDCs duidelijk hogere prolifereren en grotere hoeveelheid cellen die dubbel positief (CD11c + / CD14 +) fenotype zonder dat MDDC levensvatbaarheid. Kortom, de huidige studie verschilt van de vorige studies bovengenoemde aangezien toont het vermogen van beide technieken gelijktijdig genereren monocyten die kunnen prolifereren en differentiëren tot zijn CD11c +MDDCs (&gt; 70%) na zeven dagen in de cultuur, zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid. Daarnaast is de huidige benadering voorziet voor het eerst karakterisatie van verschillende CD11c / CD14 MDDCs populaties door beeldvorming flowcytometrie. Kortom, omdat DCs een brandpunt rol ten aanzien van onderzoek op het gebied van de immunologie spelen, verschillende parameters moet rekening worden gehouden bij het overwegen van hoe ze worden afgeleid en welke methoden worden gebruikt voor het isoleren en kweken ze in vitro. Daarom is deze studie heeft tot doel inzicht te verschaffen over twee verschillende methoden van monocyten isolatie en hoe deze methoden differentieel invloed monocyten levensvatbaarheid en de opbrengst uiteindelijk van invloed zijn dendritische levensvatbaarheid van de cellen, proliferatie en fenotype. Deze bevindingen sterk zal bijdragen aan het gebied van immunologie en zal een gedetailleerd protocol van DC isolatie, zuivering en karakterisatie verschaffen.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>Moet bij RT worden gebruikt</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep buffer</td><td>StemCell</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human monocyte enrichment kit</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0101</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain (0.4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 multi-mode reader</td><td>Biotek</td><td>7131000</td><td></td></tr><tr><td>XTT Sodium salt bioreagent (XTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X4626-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>m5655-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Phenazine Methosulfate (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9626-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inactivated (HI) Human Serum</td><td>Chemicon</td><td>S1-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Flow Cytometer</td><td>BD Accuri</td><td>653119</td><td></td></tr><tr><td>FlowSight Amnis Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>100300</td><td></td></tr></tbody></table>

karakterisering van human-monocyten afgeleide dendritische cellen door imaging flowcytometrie: een vergelijking tussen twee monocyten isolation protocollen

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritische cellen (DC's) zijn antigeende presenteercellen van het immuunsysteem die een cruciale rol spelen bij lymfocytresponsen, afweermechanismen van de gastheer en de pathogenese van ontstekingen. Isoleren en bestuderen van DC's is belangrijk geweest in biologisch onderzoek vanwege hun onderscheidende kenmerken. Hoewel ze essentiële sleutelfiguren in het immuunsysteem zijn, zijn DC's zeer zeldzaam in het bloed en maken ze ongeveer 0,1 - 1% uit van het totaal aantal mononucleaire bloedcellen. Daarom zijn alternatieven voor isolatiemethoden afhankelijk van de differentiatie van DC's uit monocyten geïsoleerd uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's). Het gebruik van geschikte isolatietechnieken die eenvoud, betaalbaarheid, hoge zuiverheid en hoge opbrengst aan cellen combineren, is van essentieel belang. In het huidige onderzoek zullen twee verschillende methoden voor de generatie van DC's worden vergeleken. Monocyten werden geselecteerd door aanhechting of negatief verrijkt met behulp van magnetische scheidingsprocedure, gevolgd door differentiatie in DC's met IL-4 en GM-CSF. Monocyten en MDDC-levensvatbaarheid, proliferatie en fenotypeer werden beoordeeld met behulp van levensvatbaarheidskleurstoffen, MTT-test en CD11c/CD14-oppervlaktemarkeringsanalyse door beeldstromende cytometrie. Hoewel de magnetische scheidingsmethode een significant hoger percentage monocyten opleverde met een hogere proliferatiecapaciteit in vergelijking met de adhesiemethode, hebben de bevindingen de mogelijkheid van beide technieken aangetoond om gelijktijdig monocyten te genereren die na zeven dagen in cultuur in staat zijn te prolifereren en te differentiëren in levensvatbare CD11c+ MDDC's. Beide methoden leverden > 70% CD11c+ MDDC's op. Daarom bieden onze resultaten inzichten die bijdragen aan de ontwikkeling van betrouwbare methoden voor isolatie en karakterisering van humane DC's.

<html> Monocyten Yield door magnetische scheiding is hoger in vergelijking met monocyten Yield door Adherence Method Gegevens in Figuur 1 tonen PBMC en monocyten celtellingen door de trypan blauw exclusie werkwijze op de dag van isolatie van PBMC en scheiding van monocyten. Gemiddeld monocyten geïsoleerd door hechting werkwijze voor ongeveer 6,2 procent van de totale PBMCs terwijl monocyten geï...

Deze studie vergelijkt twee verschillende methoden voor het isoleren van humane monocyten voor het verkrijgen van in vitro dendritische cellen (DC's). Monocyten worden geselecteerd door adhesie of negatief verrijkt door magnetische scheiding. De monocytenopbrengst en levensvatbaarheid, samen met de levensvatbaarheid van MDDC, proliferatie en CD11c/CD14-oppervlaktemarkeringsuitdrukking, zullen worden vergeleken tussen beide methoden.

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Het algemene doel van deze studie is om twee verschillende methoden voor de isolatie van menselijke monocyten voor de in vitro generatie van dendritische cellen te vergelijken en om de CT11c- en CT14-celoppervlakexpressie van de resulterende monocyten-afgeleide populaties te karakteriseren middels imaging flowcytometrie. Deze protocollen voor monocytenisolatie kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van betrouwbare methoden voor de zuivering van menselijke dendritische cellen voor onderzoek en klinische toepassingen. Het belangrijkste voordeel van deze protocollen is dat ze de isolatie van menselijke monocyten en hun differentiatie tot levensvatbare en functionele monocyten-afgeleide cellen faciliteren.Bovendien is dit de eerste studie die de specifieke populatie van monocyt-afgeleide dendritische cellen kenmerkt middels single-cell imaging flowcytometrie. Deze methode kan ook worden toegepast als alternatief voor de isolatie van andere zeldzame cellen met een adequate opbrengst voor verdere onderzoeksapplicaties. Een visuele demonstratie van deze methoden is essentieel, aangezien het veilig hanteren van bloedmonsters uitdagend kan zijn zonder de juiste instructies en ervaring.Begin met het verdunnen van de bloedstalen in een verhouding van één op één met PBS in een T75-kolf. Voeg vervolgens 15 milliliter dichtheidsgradiëntoplossing toe aan een centrifugebuis van 50 milliliter en breng voorzichtig 25 tot 30 milliliter van het verdunde bloed aan als laag over de gradiënt. Om een goede scheiding van de perifere mononucleaire bloedcellen te bereiken, moet het bloed snel, maar voorzichtig en zonder de lagen te mengen, op de dichtheidsgradiëntoplossing worden geladen.Scheid de cellen door middel van centrifugatie, gevolgd door de overdracht van de interface-laag met witte bloedcellen naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Was de cellen tweemaal in PBS en resuspendeer het uiteindelijke pellet in 10 milliliters ammoniumchloride-kalium lyseringsbuffer gedurende 15 minuten bij 4 degrees celsius. Was de cellen vervolgens nog twee keer in PBS.Om monocyten via de adherentie-methode te isoleren, kweekt u vijf keer 10^7 cellen van het resulterende PBMC-pellet per 10 milliliters compleet medium in een nieuwe T75-fles gedurende twee uur bij 37 degrees celsius en vijf percent carbon dioxide in een bevochtigde incubator. Verwijder aan het einde van de incubatie de niet-adherente zwevende cellen en was de adherente cellen voorzichtig twee keer met PBS. Voeg vervolgens compleet celkweekmedium toe aan de adherente cellen, aangevuld met humaan GMCSF en IL4, en plaats de kweek gedurende vijf tot zeven dagen terug in de incubator.Om de monocyten via magnetische scheiding te isoleren, wordt de laag met witte bloedcellen na het verzamelen van de PBMC via dichtheidsgradiëntscheiding overgebracht naar een polystyreenbuis van vijf milliliter en worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in PBS bij een concentratie van 5 × 10⁷ cellen per milliliter. Voeg vervolgens 50 µL van een human monocyte enrichment cocktail per milliliter cellen toe onder menging en incubeer de cellen met de cocktail gedurende 10 minuten bij 4 °C. Voeg daarna 50 µL magnetische deeltjes per milliliter cellen toe onder voorzichtige menging en incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij 4 °C.Voeg aan het einde van de tweede incubatie PBS toe aan de cellen om het totale volume aan te vullen tot 2,5 milliliter en meng door twee tot drie keer te pipetteren. Plaats de polystyreenbuis vervolgens in een geschikt magnetisch apparaat bij kamertemperatuur. Giet na twee en een halve minuut, terwijl de buis nog in de magneet staat, de gezuiverde monocytenfractie af in een nieuwe conische buis van 15 milliliter.Kweek vervolgens de gezuiverde monocyten in volledig celkweekmedium aangevuld met GMCSF en IL4 gedurende vijf tot zeven dagen, zoals zojuist gedemonstreerd. Verdeel na zeven dagen differentiatie aliquots van 1×10⁶ monocyt-afgeleide dendritische cellen over het juiste aantal buisjes van 1,5 ml en voeg 50 µL hittegeïnactiveerd humaan serum toe aan elk monster om aspecifieke binding te blokkeren. Centrifugeer de cellen na 10 minuten en resuspendeer de pellets in de geschikte fluorescentie-geconjugeerde primaire antilichamen gedurende 20 minuten bij 4 °C, beschermd tegen licht.Was de cellen vervolgens twee keer in één milliliter PBS en resuspendeer de pellets in 100 µL PBS per 1 × 10⁶ cellen. Voeg vlak voor de analyse één microliter DAPI toe aan elke buis. Lees de monsters vervolgens uit op een single-cell imaging flowcytometer volgens de instructies van de fabrikant.Gemiddeld maken monocyten die via de adhesiemethode zijn geïsoleerd ongeveer 6,2 procent van de totale populatie mononucleaire cellen uit perifeer bloed (peripheral blood mononuclear cells, of PBMC), terwijl monocyten geïsoleerd via magnetische scheiding tot 25 procent van de totale PBMC uitmaken. Monocyten geïsoleerd met beide methoden zijn even levensvatbaar. MDDC's gedifferentieerd uit monocyten die met beide methoden zijn gezuiverd, werden eerst gesegmenteerd op basis van DAPI-negatieve of levensvatbare cellen uit het totaal aantal enkelcellen, gevolgd door het segmenteren van elke celpopulatie.Beide isolatiemethoden resulteerden in een lage enkele CD14-positieve populatie en beide methoden leverden een hoge totale CD11c-positieve populatie op. Verdere fenotypische analyse werd uitgevoerd op alle CD11c-positieve cellen en hoewel magnetische isolatie een hoger percentage dubbel positieve CD11c-positieve CD14-positieve cellen geeft, was dit effect niet significant in vergelijking met de adherentie-methode. Deze dubbel positieve CD11c-positieve, CD14-positieve cellen zijn mogelijk vroegstadium gedifferentieerde MDDC's die de monocytaire marker CD14 nog niet hebben verloren.Bij het analyseren van de enkelvoudige CD11c-positieve cellen levert de adhesiemethode de hoogste opbrengst op van CD11c-positieve, CD14-negatieve cellen. Deze enkelvoudige positieve cellen kunnen laat-gedifferentieerde MDDC's zijn. Zodra de technieken onder de knie zijn, kunnen de adhesie- en magnetische isolatietechnieken in respectievelijk drie tot vier en één tot twee uur worden voltooid, mits ze correct worden uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met het feit dat elke 48 uur verse cytokinen voor dendritische cel-differentiatie aanwezig moeten zijn wanneer het medium wordt aangevuld. Werken met biologisch gevaarlijke vloeistoffen, zoals bloed, kan uiterst schadelijk zijn; bij het uitvoeren van deze procedures moet daarom altijd gebruik worden gemaakt van passende persoonlijke beschermingsmiddelen en correcte afvoermethoden. Deze studie plaveit de weg voor onderzoekers in het veld van de immunologie om het gebruik van menselijke monocyten en dendritische cellen voor therapeutische behandeling te verkennen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de isolatie van menselijke monocyten kunt optimaliseren voor het genereren van verschillende populaties monocytafgeleide cellen in vitro.

characterization-human-monocyte-derived-dendritic-cells-imaging-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Hier demonstreren we hoe monocyten worden geïsoleerd door magnetische kralenscheiding van mononucleaire cellen uit het perifere bloed na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van humaan geanticoaguleerd bloed. Na incubatie gedurende 5 dagen, worden menselijke monocyten gedifferentieerd in onrijpe dendritische cellen en zijn ze klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Dit protocol geeft een analyse van de macrofage subpopulaties in het centraal zenuwstelsel van het volwassen muis door middel van flowcytometrie en is nuttig voor het bestuderen van meerdere markers die door deze cellen worden uitgedrukt.

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Hier presenteren we een protocol voor het karakteriseren van monocyt deelverzamelingen door volbloed stroom cytometry. Het gaat hierbij om overzichten hoe gate de subsets kunt weergeven en beoordelen van hun uitdrukking van oppervlakte markers en geven een voorbeeld van de beoordeling van de uitdrukking van de M1 (inflammatoire) en M2 markers (ontstekingsremmer).

Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

Hier presenteren we een geïntegreerde protocol die maatregelen monocyt subpopulatie mensenhandel onder stroom in vitro door gebruik van specifieke oppervlakte markers en confocal fluorescentie microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt om te verkennen sequentiële werving stappen ook over andere subtypen van de leukocyten met behulp van andere specifieke oppervlakte markers profile.

Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro

Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

Er wordt een uniek, uitgebreid protocol gepresenteerd voor het genereren van gedesialyleerde humane monocyt-afgeleide dendritische cellen (mo-DC's) uit geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met behulp van een sialidasebehandeling. Verder worden methoden beschreven om de fenotypische en functionele karakterisering van mo-DC's te beoordelen en te evalueren hoe behandeling met sialidase het rijpingsniveau van mo-DC's verbetert.

Generatie van monocyt-afgeleide dendritische cellen met verschillende gesialyleerde fenotypes

Monocyten en macrofagen zijn zeer plastische en herprogrammeerbare immuuncellen die cruciaal zijn voor gezondheid en ziekte. Ze detecteren en reageren op een breed scala aan stimuli door specifieke differentiatieprogramma's en fenotypes aan te nemen. We hebben een in-vitro model gestandaardiseerd om macrofagen polarisatie en herprogrammering te bestuderen, wat een waardevol hulpmiddel voor onderzoek biedt.

Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

We beschrijven een procedure om het vermogen van farmacologische middelen te beoordelen om tolerogene dendritische cellen te genereren uit naïeve van monocyten afgeleide dendritische cellen in vitro en om hun potentie te valideren door autologe regulerende T-celgeneratie te genereren.

Een eenvoudige en efficiënte methode voor het testen van immunomodulerende middelen voor het genereren van tolerogene dendritische cellen uit menselijke CD14+ -monocyten

Leer twee methoden voor het isoleren van humane monocyten om dendritische cellen te genereren met behulp van imaging flowcytometrie. Deze technieken verbeteren de betrouwbaarheid van immunologisch onderzoek.

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen (Video) | JoVE Journal

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Meer video's verkennen