Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Het algemene doel van deze studie is om twee verschillende methoden voor humane monocyte-isolatie te vergelijken voor de generatie van dendritische cellen in vitro en om de CT11c, CT14-celoppervlakte-expressie van de resulterende monocyte-afgeleide populaties te karakteriseren door middel van imaging flow cytometry. Deze monocyte-isolatieprotocollen kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van betrouwbare methoden voor de zuivering van humane dendritische cellen voor onderzoek en klinische toepassingen. Het belangrijkste voordeel van deze protocollen is dat ze de isolatie van humane monocyten en hun differentiatie in levensvatbare en functionele monocyte-afgeleide cellen vergemakkelijken.

Daarnaast is dit de eerste studie die de specifieke populatie van monocyte-afgeleide dendritische cellen karakteriseert door middel van single-cell imaging flow cytometry. Deze methode kan ook worden toegepast als een alternatief voor de isolatie van andere zeldzame cellen met een adequaat rendement voor downstream onderzoektoepassingen. Visuele demonstratie van deze methoden is cruciaal omdat het uitdagender kan zijn om de bloedmonsters veilig te hanteren zonder de juiste instructie en ervaring.

Begin door het bloedmonster te verdunnen tot een 1 op 1-verhouding met PBS in een T75-kolf. Voeg vervolgens 15 milliliter dichtheidsgradiëntoplossing toe aan een 50 milliliter centrifugeerbuis en plaats voorzichtig 25 tot 30 milliliter van het verdunde bloed over de gradiënt. Om een goede scheiding van de perifere mononucleaire bloedcellen te bereiken, laad het bloed snel, maar voorzichtig en zonder de lagen te mengen, op de dichtheidsgradiëntoplossing.

Scheiden de cellen door centrifugatie, gevolgd door het overbrengen van de witte bloedcel-interfacelaag naar een nieuwe 50 milliliter kegelvormige buis. Was de cellen twee keer in PBS, resuspendeer het laatste pellet in 10 milliliter ammoniumchloride-kaliumlysebuffer gedurende 15 minuten bij 4 graden Celsius. Was de cellen vervolgens nog twee keer in PBS.

Om monocyten te isoleren door de adhesiemethode, kweek vijf maal 10 tot zeven cellen van de resulterende PBMC-pellet per 10 milliliter compleet medium in een nieuwe T75-kolf gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide in een bevochtigde incubator. Aan het einde van de incubatie, gooi de niet-aderente zwevende cellen weg en was de aanwezige cellen voorzichtig twee keer met PBS. Voed vervolgens de aanwezige cellen met compleet cellenkweekmedium gesupplementeerd met humane GMCSF en IL4 en plaats de kweek terug in de incubator gedurende vijf tot zeven dagen.

Om de monocyten door magnetische scheiding te isoleren, draag na het verzamelen van de PBMC door middel van dichtheidsgradiëntscheiding de witte bloedcel-laag over naar een vijf milliliter polystyreenbuis en resuspendeer de cellen in PBS met een concentratie van vijf maal 10 tot zeven cellen per milliliter. Voeg vervolgens 50 microliter van een humane monocyten-verrijkingscocktail per milliliter toe aan de cellen met mixen en incubeer de cellen met de cocktail bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 50 microliter magnetische deeltjes per milliliter cellen toe met zorgvuldig mixen en incubeer de cellen bij 4 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Aan het einde van de tweede incubatie, voeg PBS toe aan de cellen om het totale volume op twee punt vijf milliliter te brengen en mix door middel van pipetteren twee tot drie keer. Plaats vervolgens de polystyreenbuis in een geschikt magnetisch apparaat bij kamertemperatuur. Na twee en een half minuten, met de buis nog in de magneet, decanteer de gezuiverde monocytfractie in een nieuwe 15 milliliter kegelvormige buis.

Kweek vervolgens de gezuiverde monocyten en compleet cellenkweekmedium gesupplementeerd met GMCSF en IL4 gedurende vijf tot zeven dagen zoals net gedemonstreerd. Na zeven dagen differentiatie, verdeel een maal 10 tot de zesde cel-aliquots van de monocyte-afgeleide dendritische cellen in het juiste aantal een punt vijf milliliter buizen, en voeg 50 microliter hitte-inactiveerd humaan serum toe aan elk monster om elke niet-specifieke vondst te blokkeren. Na 10 minuten, centrifugeer de cellen en resuspendeer de pellets in de juiste fluoresceine-geconjugeerde primaire antilichamen gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht.

Was vervolgens de cellen twee keer in één milliliter PBS, resuspendeer de pellets in 100 microliter PBS per één maal tien tot de zesde cellen. Vlak voor de analyse, voeg één microliter DAPI toe aan elke buis. Lees vervolgens de monsters op een single-cell imaging flow cytometer volgens de instructies van de fabrikant.

Gemiddeld maken monocyten geïsoleerd door de adhesiemethode ongeveer zes punt twee procent uit van de totale perifere bloedmonocytcellen, of PBMC-populatie, terwijl de monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding tot 25 procent van de totale PBMC uitmaken. Monocyten geïsoleerd door beide methoden zijn even levensvatbaar. MDDC's gedifferentieerd uit monocyten gezuiverd door beide methoden werden eerst gepoort op basis van DAPI-negatieve of levensvatbare cellen uit de totale single-cellen, gevolgd door het poorten van elke celpopulatie.

Beide isolatiemethoden leverden een lage enkele CD14-positieve populatie op en beide methoden leverden een hoge totale CD11c-positieve populatie op. Verdere fenotypische analyse werd uitgevoerd op alle CD11c-positieve cellen en hoewel magnetische isolatie een hoger percentage dubbel-positieve CD11c-positieve CD14-positieve cellen geeft, was dit effect niet significant in vergelijking met de adhesiemethode. Deze dubbel-positieve CD11c-positieve, CD14-positieve cellen kunnen vroeg-stadium gedifferentieerde MDDC's zijn die de CD14-monocytenmarker nog niet hebben afgeworpen.

Bij het analyseren van de enkele CD11c-positieve cellen, geeft de adhesiemethode de hoogste opbrengst van CD11c-positieve, CD14-negatieve cellen. Deze enkele positieve cellen kunnen laat-stadium gedifferentieerde MDDC's zijn. Eenmaal onder de knie, kunnen de adhesie- en magnetische isolatietechnieken in drie tot vier en één tot twee uur respectievelijk worden voltooid als ze correct worden uitgevoerd.

Bij het uitvo