Een High-gehalte In Vitro Eilandjes van Langerhans β-cel Replication Discovery Platform
16 juli 2016
Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van deze hoge inhoud beta-cel replicatie screeningplatform, is om het onderzoek naar de moleculaire paden die de bètacelgroei beperken te vergemakkelijken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van bèta-cel biologie. Zoals een van de belangrijkste signaalmoleculen en paden die de bètacel regeneratie controleren.
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze de doorvoer van cellijnen naar een specifieke beoordeling mogelijk maakt en de geautomatiseerde data-analyse van primaire eilandje-celreplicatie. Het gebruik van deze techniek heeft het potentieel om zich te richten op de ontwikkeling van regeneratieve therapie voor diabetes. Een ziekte met grote gezondheids- en economische kosten voor onze samenleving.
Begin door een pancreatische spijsverteringsoplossing te gebruiken die is geladen in een spuit van 10 milliliter, voorzien van een naald van 22 gauge, om de gemeenschappelijke galgang te stimuleren op of net distaal van de kruising van de cystische en gemeenschappelijke leverkanalen. Ondersteun de gemeenschappelijke galgang met een scalpelhandgreep, injecteer langzaam 10 milliliter van de oplossing. Nadat alle collageenase is toegediend, gebruik gekromde forceps en schaar om de opgeblazen alvleesklier te scheiden van de aflopende dikke darm, darmen, maag en milt.
Plaats vervolgens maximaal twee alvleesklieren in een 50 milliliter buis op ijs met vijf milliliter pancreatische spijsverteringsoplossing. Wanneer alle alvleesklieren zijn verzameld, plaats de verteringsbuizen in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 15 minuten met zacht schudden elke drie minuten. Aan het einde van de vertering, schud de buizen krachtig 10 keer verticaal.
En voeg 10 milliliter koude wasbuffer toe aan de monsters. Schud de buizen krachtig vijf keer meer en plaats ze op ijs. Vul vervolgens de buizen tot een eindvolume van 50 milliliter met koude wasbuffer en draai de buizen vijf keer om.
Draai vervolgens de weefsels naar beneden en giet de supernatanten af, zorg ervoor dat de pellets niet losraken. Re-suspendeer het weefselslurry in 25 milliliter wasbuffer gevolgd door voorzichtig vortexen. Herhaal de stappen van centrifugeren en re-suspenderen nog twee keer.
Plaats vervolgens de weefselsuspensies door een 30 mesh weefselzeef in een steriele 250 milliliter beker. Spoel de verteringsbuizen met een extra 20 milliliter wasbuffer en giet de wassingen op het gaas om het onverteerde pancreas en vetweefsel te verwijderen. Verdeel het gefilterde materiaal tussen twee nieuwe 50 milliliter buizen en pellet het weefsel door centrifugatie.
Decanteer vervolgens de supernatant en draai de buizen om om het overtollige buffer af te tappen. Om de eilandjes te zuiveren, voeg 20 milliliter koude dichtheidsgradiënt toe aan de pancreasweefsel pellets en pipet voorzichtig vijf keer op en neer om de inhoud homogeen te re-suspenderen. Overlaat vervolgens langzaam 10 milliliter HBSS langs de wand van elke buis van gradiënt en zorg ervoor dat een scherpe vloeistoflaag wordt gehandhaafd en scheid de pancreascellen door centrifugatie.
Gebruik een 10 milliliter pipet om de eilandjeslaag van de interface over te brengen naar nieuwe 50 milliliter conische buizen. Was vervolgens de eilandjes in 40 tot 50 milliliter wasbuffer drie keer. Draai de buizen om de pellets tussen elke centrifugatie te re-suspenderen.
Na de laatste wasbeurt, breng de buizen in een weefselkweek hok. Aspireer de supernatant. En re-suspendeer de pellets in zes milliliter eilandje medium.
Zeef de eilandjes van elke buis in afzonderlijke putjes van een zes putjes weefselkweek plaat. En draai de plaat om de eilandjes in het midden van de putjes te verzamelen. Evalueer de eilandje zuiverheid onder de microscoop.
Om de eilandjes verder te zuiveren, verzamel ze met een pipet van één milliliter en breng ze over naar de aangrenzende put met zes milliliter eilandje medium. Herhaal het draaien, verzamelen, overbrengen en microscopisch evalueren van eilandjes totdat een zuiverheid van meer dan 90 procent is bereikt. Breng vervolgens de eilandjes over naar een enkele weefselkweek schaal van 10 centimeter met 20 milliliter eilandje medium.
Nadat alle eilandjes zijn geoogst, plaats de kweekschaal in een weefselkweek incubator voor een nacht. Bedek vervolgens de putjes van een 384-putjes plaat met 40 microliters 804G, geconditioneerd medium per putje en plaats de plaat voor een nacht in de incubator. De volgende dag, gebruik een celschraper om de eilandjes voorzichtig los te maken.
Breng vervolgens de eilandjes over naar een 50 milliliter buis. Verzamel de eilandjes door centrifugatie. Was ze vervolgens met 20 milliliter warm p, b, s.
Centrifugeer gedurende één minuut. Aspireer de supernatant. En re-suspendeer de pellet in nul punt twee, vijf procent Trypsin.
Incubeer de eilandjes gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius met behulp van een pipet van één milliliter om de eilandjes 10 keer op te zuigen en af te geven op vijf en tien minuten. Na de tweede triteratie, tel een monster van 20 microliter van de trypsinized eilandje cellen. Als de weefsels volledig zijn verteerd, suspendeer de dissociatieve eilandje cellen op een concentratie van vier punt vijf keer tien tot de vier cel per milliliter in eilandje functie medium.
Gebruik vervolgens een 12-putjes manifold aspirator om het 804G conditiemedium te verwijderen van de eerder bereide 384-putjes plaat. En zeef 70 microliter eilandjes per putje in rijen c tot n in kolommen vier tot 21. Laat de eilandjes gedurende 48 uur in de weefselkweek incubator aanhechten.
Na twee dagen, gebruik de 12-putjes manifold aspirator om voorzichtig het eilandje medium te verwijderen en gebruik een 12-kanaals pipet om 35 microliter eilandje functie medium toe te voegen aan elke put. Breng vervolgens 35 microliter van de vers bereide twee x verbindingsoplossingen van belang over naar elke put. En breng de eilandjes terug naar de incubator voor nog eens 48 uur.
Na 48 uur, fixeer, kleuren en analyse
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een high-content screeningmethode die gericht is op het identificeren van kleine moleculen die de replicatie van β-cellen bevorderen. De techniek pakt kritieke uitdagingen in diabetesonderzoek aan, in het bijzonder het begrijpen van de moleculaire mechanismen die de groei van β-cellen reguleren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Diabetesonderzoek
- Celbiologie
- β-celregeneratie
Achtergrond
- Inzicht in de replicatie van β-cellen is essentieel voor de behandeling van diabetes.
- Huidige methoden om de regeneratie van β-cellen te stimuleren zijn beperkt.
- High-content screening kan de identificatie van moleculen die replicatie bevorderen, verbeteren.
- Diabetes vormt een aanzienlijke gezondheidslast en economische uitdaging.
Doel van de studie
- Om moleculaire paden te onderzoeken die de groei van β-cellen beperken.
- Om een platform te ontwikkelen voor high-throughput screening van kleine moleculen.
- Om onderzoek naar β-celbiologie en regeneratieve therapieën te faciliteren.
Gebruikte methoden
- High-content screeningplatform voor β-celreplicatie.
- Geautomatiseerde data-analyse voor primaire replicatie van eilandjes van Langerhans-cellen.
- Beoordeling van kleine moleculen op hun replicatiebevorderende activiteit.
- Verhoogde doorvoersnelheid voor specifieke beoordelingen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van kleine moleculen die β-celreplicatie bevorderen.
- Inzichten in belangrijke signaleringspaden die betrokken zijn bij β-celregeneratie.
- Demonstratie van de effectiviteit van het platform bij high-throughput screening.
- Potentiële implicaties voor de ontwikkeling van regeneratieve therapieën voor diabetes.
Conclusies
- De high-content screeningmethode is een waardevol hulpmiddel voor diabetesonderzoek.
- Inzicht in de biologie van β-cellen kan leiden tot nieuwe therapeutische strategieën.
- Verdere exploratie van geïdentificeerde moleculen kan de regeneratie van β-cellen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Diabetesonderzoek in de ontdekkingsfase vereist robuuste platforms om modulatoren van de replicatie van pancreatische eilandjes β-cellen te identificeren, een cruciale flessenhals in de ontwikkeling van regeneratieve therapie. Dit high-content, op beeldvorming gebaseerde screeningsplatform maakt gebruik van primaire eilandjescellen om de biologische relevantie en het voorspellende vertrouwen voor de triage van verbindingen in een vroeg stadium te maximaliseren. De automatisering en kwantitatieve output ondersteunen direct portfoliobeslissingen op het snijvlak van targetvalidatie en leadidentificatie.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om moleculaire pathways die de groei van β-cellen beperken te onderzoeken met behulp van fysiologisch relevante primaire cellen.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door onderscheid te maken tussen lineage-beperkte en algemene mitogene effecten.
- Faciliteert predictieve risicoreductie door in vivo groeibeperkingen te behouden die afwezig zijn in geïmmortaliseerde lijnen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, geautomatiseerde en kwantitatieve beoordeling van β-celreplicatie in een 384-wells formaat.
- Vermindert de bias van de experimentator en verbetert de reproduceerbaarheid via geoptimaliseerde immunokleuring en geautomatiseerde data-analyse.
- Bereidt gevalideerde primaire-celsystemen voor voor betrouwbare downstream evaluatie van verbindingen en mechanistische studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante biologie door endogene regeneratieve beperkingen van β-cellen te modelleren.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking naar preklinische validatie door aanpassing aan studies met menselijke eilandjes te ondersteunen.
- Biedt mechanistische inzichten in mitogene signaalpaden voor risicogebaseerde beslissingen over verdere ontwikkeling.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit platform slaat een brug tussen vroege ontdekking en lead-identificatie door high-content, kwantitatieve screening van kleine moleculen in primaire eilandjes-cellen mogelijk te maken, met resultaten die geschikt zijn voor translationele follow-up.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypotheseonderzoek naar de regulatie van β-celgroei en pathway-mapping.
- Screening: Biedt reproduceerbare, schaalbare en kwantitatieve resultaten voor de triage van verbindingen.
- Analytics: Maakt geautomatiseerde meting van β-celreplicatiesnelheden en lineagespecificiteit mogelijk.
- Translationeel Onderzoek: Faciliteert aanpassing aan menselijke eilandjes voor preklinische continuïteit.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare high-content screeningcapaciteit voor portfolios in de β-celbiologie.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van β-celdoelen.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows, verbetert de reproduceerbaarheid en maakt matige schaalbaarheid met primaire cellen mogelijk.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door de focus te leggen op ziekterelelevante systemen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van kandidaten voor regeneratieve therapie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in primaire eilandjes-isolatie, kweek en immunostaining.
- Toegang tot high-content imaging en een infrastructuur voor geautomatiseerde data-analyse is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie van celpreparatie en assaycondities tussen teams is vereist.
- Aanpassing naar menselijke eilandjes is haalbaar, maar kan te maken krijgen met beperkingen in middelen en doorvoercapaciteit.
- Beperkingen omvatten een verstoorde eilandjesarchitectuur en afwegingen tussen kosten en doorvoer die inherent zijn aan het gebruik van primaire cellen.
