Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Het algemene doel van dit protocol is het ontwikkelen van een methode voor snelle, geautomatiseerde high-throughput screening van plantenprotoplasten, specifiek om de huidige bottleneck bij de vroege screening van grote aantallen doelen voor genoomredactie en gen-silencing aan te pakken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de plantbiotechnologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het high-throughput geautomatiseerde protoplastproductie en transformatie mogelijk maakt voor snelle parallelle screening van promoterfuncties in genexpressie.

Deze procedure wordt gedemonstreerd met behulp van de veelgebruikte tabaks suspensiecultuur 'bright yellow two', of BY-2. Begin met het kweken van een BY-2-cultuur in een Erlenmeyerkolf, zoals beschreven in de protocoltekst. Meng de cultuur op de dag van de protoplastisolatie grondig, aangezien cellen snel bezinken, en breng zes milliliter van de cultuur over in een centrifugebuis met kegelvormige bodem van 15 milliliter.

Laat de cellen gedurende ten minste 10 minuten bezinken. Pas het gepakte celvolume aan tot 50% van het totale volume door het juiste volume supernatant te verwijderen. Schud de buis door deze om te keren en gebruik vervolgens wide bore pipetten om 500 microliters celstuspensie in elke well van een six-well plaat te pipetteren voor digestie.

De eerste stap in deze procedure is het inschakelen van alle componenten van het robotstelsel, namelijk de microplate-verplaatsaar, de vloeistofhandler, de multi-mode platenlezer, de multi-mode dispenser, de platenverwarmer of -koeler en de computers. Open vervolgens de software voor taakplanning van de platenverplaatser, die de microplate-verplaatser integreert met de andere apparatuur om de overdracht van platen tussen elk apparaat mogelijk te maken. Definieer in de software van de platenverplaatser de technische specificaties voor het laboratoriummateriaal dat in het protocol wordt gebruikt.

Klik op Setup in de hoofdbalk en select Jeu het commando Manage Container Types. Selecteer het juiste Container Type uit de lijst met bestaande Container Types. Definieer de technische specificaties voor al het laboratoriummateriaal dat de plaatverplaatser zal tegenkomen.

De volgende stap is het definiëren van de start- en eindposities voor elke container. Klik in een specifiek protocol op het tabblad Start/End. Selecteer de startpositie van elke container en vink het vakje voor Lidded, Unlidded aan bij zowel de start- als de eindpositie.

Nadat de start- en eindposities voor elk stuk laboratoriummateriaal zijn gedefinieerd, worden alle platen handmatig in de startpositie voor de gehele workflow geplaatst. Plaats de 96-well fluorescentie-screeningplaten in hotel twee, de zes-well platen met BY-2 cellen in hotel drie, een 96-deep well plaat die voor transformatie zal worden gebruikt op nest twee van de plaatverwarmer of -koeler, en een 50 milliliter conische buis met de enzymoplossing op de multi-mode dispenser. Om de transformatie in het protocol uit te voeren, wordt elke well van de 96-deep well plaat vooraf gevuld met 10 microliters plasma-DNA dat het oranje fluorescerende eiwit-reporterconstruct bevat, waarna deze op de plaatverwarmer of -koeler bij vier graden Celsius wordt geïncubeerd.

Plaats alle benodigdheden en platen op de geautomatiseerde vloeistofbehandelingsplatform op de aangewezen locaties. Plaats een 96-wells plaat die vooraf is gevuld met 200 µL van een 40% polyethyleenglycol-oplossing per well in kolom één. Plaats een doos pipetpunten in nest acht.

Om de locatie van elk item in de software van de geautomatiseerde vloeistofbehandelingsplatformen te definiëren, selecteert u Tools uit het menu en klikt u op Labware Editor. Selecteer het type laboratoriummateriaal uit het vervolgkeuzemenu. Selecteer het tabblad Main Protocol en klik op Configure Labware om de positie van elk stuk laboratoriummateriaal te definiëren.

Klik op Run om alle apparaten te initialiseren die in het protocol worden gebruikt. Klik ten slotte in het venster Work Explorer op Add Work Unit om alle labware in het systeem te verifiëren en het geautomatiseerde protocol te starten. Het meest gevoelige deel van de procedure is de protoplasttransformatie.

Aangezien de transformatie door het robotsysteem wordt uitgevoerd, is het essentieel dat de geautomatiseerde protocollen correct zijn ingesteld. Voor de doeleinden van deze video worden slechts geselecteerde stappen in de geautomatiseerde protocollen getoond. Tijdens het transformatieprotocol zuigt het geautomatiseerde vloeistofbehandelingsplatform 70 µL van de protoplastoplossing op uit de zes-wells plaat en brengt dit over in de 96-deep well plaat in nest zes.

Vervolgens worden nieuwe pipetpunten gebruikt om langzaam 70 µL van de zeer viskeuze polyethyleenglycoloplossing uit de vooraf gevulde deep well plate op te zuigen en de oplossing volledig te dispenseren in de toepasselijke wells van de deep well plate. Daarna verplaatst het geautomatiseerde vloeistofhandelingsplatform de deep well plate van nest zes naar nest negen, waar de plate mover de plaat oppakt, naar het plaatshake-station verplaatst en deze 30 seconden schudt bij 1500 RPM. Na een incubatie van 20 minuten zonder schudden om het equilibrium van de protoplasten mogelijk te maken, verplaatst de plate mover de 96-deep well plate naar de multi-mode dispenser en start het wasprotocol.

Wanneer het geautomatiseerde protocol voor de isolatie en transformatie van protoplasten is voltooid, verwijder dan de plaat met de getransformeerde protoplasten uit hotel één van het robotische systeem. Zet de omgekeerde microscoop, de camera en de fluorescentielamp aan. Selecteer het 10X objectief voor de initiële scherpstelling op de protoplasten.

Zet de halogeenlamp aan en sluit de sluiter van de fluorescentielamp. Plaats de plaat op het microscopiesysteem en stel scherp op de protoplasten met behulp van helderveldmicroscopie. Zet vervolgens de halogeenlamp uit en open de sluiter van de fluorescentielamp.

Selecteer de Cy3/TRITC-filterset voor visualisatie van het oranje fluorescerende eiwit dat tot expressie wordt gebracht door de transgene protoplasten. Scan elke put om het aantal protoplasten te bepalen dat de fluorescerende marker tot expressie brengt. Enzymatische digestie van protoplasten onder de in dit protocol gespecificeerde condities resulteerde in 2.820.000 protoplasten per six-well plaat.

Het verlies in protoplastconcentratie na elke overdrachtstap in het protocol werd geëvalueerd. Na het digestieprotocol werden 11.500 protoplasten naar elke put van de 96-deep well plates overgebracht. Nadat het transformatieprotocol was voltooid, werden 1.230 protoplasten overgebracht naar de 96-well fluorescentiescreeningplaat.

Om er zeker van te zijn dat meerdere pipetteerstappen de protoplasten niet hadden beschadigd, werd hun levensvatbaarheid bepaald via propidiumjodide-kleuring. De resultaten toonden geen significant verschil in levensvatbaarheid na digestie, na overdracht naar de 96-well fluorescente screeningsplaat en na het transformatieprotocol. Het transformatieprotocol was succesvol in het genereren van transgene cellen die oranje fluorescent eiwit tot expressie brengen, hoewel de transformatie-efficiëntie laag was, ongeveer 2%. Dit is te wijten aan het grote gebruikte binaire plasmide en aan het feit dat het protocol niet specifiek was geoptimaliseerd voor BY-2 protoplasten.

De verkregen metrieken voor het verloop van het protocol laten zien dat de grootste tijdsinvestering plaatsvindt tijdens de digestiefase. De totale duur van de protoplastisolatie en -transformatie was drie uur, 50 minuten en 53 seconden, zonder dat er externe input van de operator nodig was. Eenmaal correct ingesteld, kan deze techniek door de robot in minder dan vier uur worden uitgevoerd.

Na de ontwikkeling is deze techniek de wegbereider voor onderzoekers in het veld van de plantbiotechnologie om high-throughput genomische gewasprocedures uit te voeren, zoals genoomredactie en promotorscreening.