Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Het algemene doel van dit protocol is om een methode te ontwikkelen voor snel, geautomatiseerd high-throughput screening van plantenprotoplasten, specifiek om de huidige knelpunt in vroege screening van grote aantallen genoombewerking en gen-silencing doelen aan te pakken. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van plantenbiotechnologie te beantwoorden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het hoogwaardige geautomatiseerde protoplastproductie en transformatie mogelijk maakt voor snelle parallelle screening van promotorfunctie in genexpressie.

Deze procedure zal worden gedemonstreerd met behulp van de veelgebruikte tabaksheldere gele twee, of BY-2, suspensiecultuur. Begin met het kweken van een BY-2 cultuur in een Erlenmeyer kolf, zoals beschreven in de protocoltekst. Op de dag van protoplastisolatie, meng de cultuur grondig, aangezien cellen snel zullen bezinken, en breng zes milliliter van de cultuur over naar een 15 milliliter centrifugeerbuis met conische bodem.

Laat de cellen minimaal 10 minuten bezinken. Pas het gepakte celvolume aan tot 50%van het totale volume door het juiste volume supernatant te verwijderen. Schud de buis door deze te keren en gebruik vervolgens brede buisjes om 500 microliter celsuspensie in elk putje van een zes-putjesplaat te pipetten voor vertering.

De eerste stap in deze procedure is het inschakelen van alle componenten van het roboticasysteem, namelijk de microplaatbeweger, de vloeistofafhandelaar, de multi-mode plate reader, de multi-mode dispenser, de plate heater of chiller en de computers. Open vervolgens de plate mover task scheduling software die de microplaatbeweger integreert met de andere apparatuur om het overbrengen van platen tussen elk stuk apparatuur mogelijk te maken. Definieer in de plate mover software de technische specificaties voor de in het protocol gebruikte labware.

Klik op Setup in de hoofdwerkbalk en selecteer de opdracht Beheren Containertypen. Selecteer het juiste Containertype uit de lijst met bestaande Containertypen. Definieer de technische specificaties voor alle labware die de plate mover zal tegenkomen.

De volgende stap is het definiëren van de start- en eindposities voor elke container. Klik op het tabblad Start/Eind in een specifiek protocol. Selecteer de startpositie van elke container en vink het vakje aan voor Gedekt, Ongedekt bij zowel de start- als eindposities.

Na het definiëren van de start- en eindposities voor elk stuk labware, laadt u alle platen handmatig in de startpositie voor de volledige workflow. Laad de 96-well fluorescente screeningsplaten in hotel twee, de zes-putjesplaten met BY-2 cellen in hotel drie, een 96-diepwelplaat die zal worden gebruikt voor transformatie op nest twee van de plate heater of chiller, en een 50 milliliter conische buis met de enzymoplossing op de multi-mode dispenser. Om transformatie in het protocol uit te voeren, preload elke put van de 96-diepwelplaat met 10 microliter plasma-DNA bevattende de oranje fluorescente proteïne reporterconstructie en incubeer op de plate heater of chiller bij vier graden Celsius.

Laad alle benodigdheden en platen op het geautomatiseerde vloeistofafhandelingsplatform in de aangewezen locaties. Laad een 96-well plaat voorgeladen met 200 microliter van een 40%polyethyleenglycoloplossing per put in kolom een. Laad een doos pipette tips in nest acht.

Om de locatie van elk item in de software van de geautomatiseerde vloeistofafhandelingsplatform te definiëren, selecteert u Tools uit het menu en klikt u op Labware Editor. Selecteer het type labware uit het uitklapmenu. Selecteer het tabblad Main Protocol en klik op Configure Labware om de positie van elk stuk labware te definiëren.

Klik op Run om alle apparaten die in het protocol zullen worden gebruikt te initialiseren. Klik ten slotte in het Work Explorer-venster op Add Work Unit om alle labware in het systeem te verifiëren en begin met het geautomatiseerde protocol. Het meest gevoelige deel van de procedure is de protoplasttransformatie.

Aangezien de transformatie wordt uitgevoerd door het roboticasysteem, is het van cruciaal belang dat de geautomatiseerde protocollen correct zijn ingesteld. Voor de doeleinden van deze video worden alleen geselecteerde stappen in de geautomatiseerde protocollen getoond. Tijdens het transformatieprotocol aspireert de geautomatiseerde vloeistofafhandelingsplatform 70 microliter van de protoplastoplossing uit de zes-putjesplaat en geeft deze vrij in de 96-diepwelplaat in nest zes.

Vervolgens worden nieuwe pipette tips gebruikt om langzaam 70 microliter van de zeer viskeuze polyethyleenglycoloplossing uit de voorgeladen diepwelplaat te aspireren en de oplossing volledig in de toepasselijke putjes van de diepwelplaat te geven. Vervolgens verplaatst de geautomatiseerde vloeistofafhandelingsplatform de diepwelplaat van nest zes naar nest negen waar de plate mover de plaat oppikt en verplaatst naar de plate shaker station en schudt deze met 1500 RPM gedurende 30 seconden. Na een incubatie van 20 minuten zonder schudbeweging om equilibratie van protoplasten mogelijk te maken, verplaatst de plate mover de 96-diepwelplaat naar de multi-mode dispenser en activeert het wasprotocol.

Wanneer het geautomatiseerde protoplastisolatie- en transformatieprotocol voltooid is, verwijdert u de plaat met de getransformeerde protoplasten uit hotel een van het roboticasysteem. Schakel de omgekeerde microscoop, camera en fluorescentielamp in. Selecteer het 10X objectief voor initieel focussen op de protoplasten.

Schakelt u de halogeenlamp in en sluit de sluiter voor de fluorescentielamp. Laad de plaat op het microscoopsysteem en focus op de protoplasten met behulp van helder veld. Schakel vervolgens de halogeenlamp uit en open de sluiter voor de fluorescentielamp.

Selecteer de Cy3/TRITC filterset voor visualisatie van het oranje fluorescente proteïne dat wordt uitgedrukt door de transgene protoplasten. Scan elk putje om het aantal protoplasten dat het fluorescente marker uitdrukt te bepalen. Enzymdigestie van protoplasten onder de in dit protocol gespecificeerde omstandigheden resulteerde in 2.820.000 protoplasten per zes-putjesplaat.

De verlies in protoplastconcentratie na elke overdrachtstap in het protocol werd geëvalueerd. Na het digestieprotocol werden 11.500 protoplasten overgebracht naar elk putje van de 96-diepwelplaten. Zodra het transformatieprotocol was voltooid, werden 1.230 protoplasten overgebracht naar de 96-well fluorescente screeningsplaat.