Name: Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer een geautomatiseerde methode voor high-throughput protoplastisolatie en transformatie in tabak BY-2-cellen. Dit robotplatform versnelt parallelle screening van genexpressie en genoombewerking in plantenbiotechnologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award nr. DE-AR0000313.

1. De vaststelling van Suspension Cell Cultures <ol><li> Bereid vloeibare BY-2 media door het toevoegen van 4,43 g Linsmaier &amp; Skoog basale media, 30 g sucrose, 200 mg KH 2PO 4 en 200 ug van 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur (2,4-D) aan 900 ml gedestilleerd water en pH 5,8 met 0,1 M KOH. Na het aanpassen van de pH, aan te passen uiteindelijke volume tot 1000 ml met gedestilleerd water en autoclaaf. Media kunnen tot 2 weken bewaard bij 4 ° C. </li><li> Inoculeren een 250 ml Erlenmeyer fles met 100 ml vloeibaar BY-2 media en één stuk BY-2 callus (&gt; 1 cm in diameter) gekweekt op vaste BY-2 medium (vloeistof BY-2 medium met de toevoeging van 1% agar) en sluit af met aluminiumfolie. Incubeer kweken bij 28-30 ° C onder schudden gedurende 5 dagen. LET OP: BY-2 eelt wordt gehandhaafd op vaste media voor langdurige opslag, zoals vloeibare kweken snel zal overwoekeren. Kweekvolume kan zodanig aangepast, kenmerkend een 100 ml kweek in staat zijn het laden drieëndertig 6-well platen. </li><li> Overdracht 2 ml log fase BY-2 cultuur tot 98 ml vers BY-2-media en incubeer gedurende 5-7 dagen bij 28-30 ° C onder schudden. OPMERKING: Sub-kweken van gevestigde vloeibare kweken kan worden uitgevoerd regelmatig met 1: 100 verdunningen van 5-7 dagen oude kweken, in plaats van inoculatie met callus. </li><li> Meng de cultuur grondig, als cellen zich snel zal vestigen, en de overdracht 6 ml van de celkweek aan een 15 ml conische bodem centrifugebuis en laat de cellen genoegen nemen met ten minste 10 min. Stel het gepakte celvolume tot 50% van het totale volume door het verwijderen van supernatant. </li><li> Schud de buis door het omkeren en pipet 500 ul in elk putje van een 6-wells plaat voor de spijsvertering. Gebruik wide-bore pipetten aan de cellen dragen in dit stadium, omdat ze dicht en verstoppen standaard pipetpunten. </li></ol> 2. protoplastisola- <ol><li> Zet alle componenten van het robotsysteem (Figuur 1A) en open de plaat mover taak plannen zachteware. De taak planningsprogramma integreert de microplaat mover met de andere apparatuur om de overdracht van de platen tussen elk apparaat mogelijk te maken. </li><li> Voorafgaand aan experimenten, bepalen de technische specificaties voor laboratorium (bijvoorbeeld borden, deksels) die in het protocol, en begin- en eindposities voor elk stuk laboratorium, in de plaat mover software als volgt: <ol><li> Klik op Setup van de belangrijkste werkbalk in de plaat mover-software en selecteer het beheren Container Types commando. </li><li> Als het type container in de bestaande soort container bibliotheek wordt vermeld, selecteer vervolgens de juiste container. </li><li> Als het type container niet in de bestaande soort container bibliotheek wordt weergegeven en klik vervolgens op Toevoegen om een nieuwe container opgeven. </li><li> Na het toevoegen van een nieuw type container, plaatst u de afmetingen van de nieuwe container (hoogte, breedte, stapelen dimensies en grijper offset) in de juiste tabbladen en klik op Opslaan.<ol><li> Als de juiste afmetingen zijn niet verkrijgbaar bij de fabrikant, vervolgens nauwkeurig alle dimensies op de millimeter te bepalen met behulp van remklauwen. Fouten in het meten van de container afmetingen zal leiden tot het falen van de plaat mover. </li></ol></li><li> Herhaal de stappen 2.2.2 tot 2.2.4.1 voor elk type container die de plaat verhuizer zal tegenkomen. Na voltooiing van deze stap voor laboratorium, is het noodzakelijk om het begin- en eindpunt van elke container (stap 2.2.6) definiëren. LET OP: Voor dit protocol het laboratorium bevat de 6-wells plaat, de deep-well plaat, en de 96-well fluorescerende screening plaat. </li><li> Aan het begin en einde positie van elke container te definiëren, klikt u op het tabblad Start / End in een specifiek protocol. Selecteer eerst de startpositie van elke container. Vervolgens vinkt u het vakje voor Dekselkisten / Unlidded op zowel de begin- en eindstand. Herhaal dit voor alle containers. OPMERKING: Als de container zal worden overgelaten aan een ander stuk van equipment (in plaats van de plaat mover) het einde locatie kan worden ingevuld. </li></ol></li><li> Op dit moment staat alle platen laden in de uitgangspositie voor de gehele workflow. Laad de 96-well fluorescerende zeefplaten in hotel 2, 6-well platen met BY-2 cellen in hotel 3, een 96 deep-well plaat die wordt gebruikt voor transformatie op plaat verwarmer / koeler nest 2, en een 50 ml conische buis die het enzym oplossing (zie Hulp File, paragraaf 1.2.2) op de multi-mode dispenser. <ol><li> Als de transformatie in het protocol zal worden uitgevoerd, pre-laad de 96 deep-well plaat met 10 ul van plasmide-DNA per putje (1 ug / ul, A 260/280&gt; 1.8) die het OFP reporter construct en broeden op de plaat verwarmer / koeler bij 4 ° C. Elk putje wordt gebruikt voor een enkele transformatie, waardoor het aantal putten gevuld is afhankelijk van de experimentele opstelling. </li></ol></li><li> Laad alle leveringen en platen op het automatiserend liquid handling platform in de aangewezen locaties en bepalen de positie van elk item in de automatisering controle software (Figuur 1B). <ol><li> Plaats een 96-wells plaat voorgeladen met 200 pi 40% PEG in MMG (0,4 M mannitol, 100 mM MgCl2, 4 mM MES, pH 5,7) in kolom 1, 200 ul propidiumjodide (PI, 1 ug / ml) in kolom 2, en 200 ui ethanol in kolom 3 (nest 2), en een doos van pipet tips in het nest 8. </li><li> Om de locatie van het laboratorium in de software van de geautomatiseerde liquid handling platform, selecteer Tools in het menu te definiëren en klik op Labware Editor. </li><li> Selecteer het type laboratorium uit het pulldown menu of definieer een nieuw laboratorium in met behulp van het nieuwe Laboratoriumbestek knop. </li><li> Bepaal de positie van elk stuk van laboratorium geselecteerd door het tabblad Main Protocol en klik op Configure Labware. Zorg ervoor dat elk stuk van laboratorium geplaatst op de geautomatiseerde verwerking vloeistof platform isgedefinieerd vóór het uitvoeren van het protocol. </li><li> Om de geautomatiseerde protocollen starten, klikt u op de Profile Explorer-venster en selecteer de naam van het protocol worden uitgevoerd (protoplastisolatie, celgetal, en PEG-gemedieerde transformatie). </li><li> Klik op Uitvoeren om alle apparaten die worden gebruikt in het protocol initialiseren. </li><li> Ten slotte is in het venster Work Explorer, klikt u op Toevoegen Work Unit om alle containers / laboratorium in het systeem te controleren en beginnen met het automatische protocol. OPMERKING: Volledige gegevens van geautomatiseerde protocollen zijn opgenomen in de aanvullende bestand. </li></ol></li></ol> 3. Vaststelling van Standard Curve voor celtellingen <ol><li> Handmatig concentreren protoplasten bij een concentratie van 1 x 10 6 protoplasten / ml in een volume van 1 ml. Centrifugeer protoplasten bij 1000 xg gedurende 10 min, en verwijder supernatant. </li><li> Voeg 900 pl 70% ethanol (gehandhaafd op 4 ° C) aan de protoplast pelleten resuspendeer de pellet. Incubeer gedurende 10 min op ijs om cellen te repareren. </li><li> Voeg 100 ul van PI (1 ug / ml) aan de protoplasten om de kernen te labelen en waarmee de aanwezigheid van de plaatlezer. </li><li> Load 80 ul van vloeistof BY-2 media in elke kolom en rij van de 96-well fluorescerende screening plaat te beginnen bij kolom 2. </li><li> In kolom 1 van een 96-well fluorescerende schermplaat, voeg 70 ul van protoplasten en 50 gl BY-2 medium aan elk putje van de kolom. </li><li> Plaats de plaat in nest 6 van de geautomatiseerde liquid handling-platform, en uitvoeren van een 2-voudige seriële verdunning. <ol><li> Een seriële verdunning van de geautomatiseerde vloeistofverwerking platform voeren op starten seriële Wizard verdunning en het volume overdracht (60 ui), aantal mixen en volume (2, 70 ui), aanvankelijk putjes (kolom 1, rijen AF), verdunning aanpassen Wells (Kolommen 2-11, Rijen AF), en aspireren en afzien eigenschappen (0,5 mm uit goed onder). </li><li> Na het instellen van de parameters, behalve eend het protocol uit te voeren. Opmerking: Aangezien alle protoplasten worden gelabeld met PI (vanwege fixatie van cellen), de fluorescentie is evenredig met de concentratie protoplast. </li><li> Nadat de seriële verdunning is voltooid, verwijdert u de plaat uit nest 9 en in te voegen in de plaat lezer en voer de standaard curve protocol in de plaat lezer software. OPMERKING: Een standaard curve wordt dan gegenereerd door vergelijking van de fluorescentie van PI (excitatie 536 nm / emissie 620 nm) in elk putje met bekende concentratie protoplast. </li></ol></li><li> Na voltooiing van de plaat lezer protocol, verwijder de plaat en het verzamelen van elke transgene cellen voor behandeling in een autoclaaf of andere de-vitalisering procedures zoals gedefinieerd in bioveiligheid protocollen &#39;. </li></ol> 4. Microscopische analyse van Transformatie <ol><li> Verwijder plaat met getransformeerd protoplasten (het product van Automated Protocol 3, Aanvullende File) van Hotel 1 van het robotsysteem. </li><li> Beurtop omgekeerde microscoop, camera, en tl-lamp. </li><li> Selecteer de 10X doelstelling voor de initiële focus op de protoplasten, zet de halogeenlamp, en sluit de sluiter voor de tl-lamp. </li><li> Load plaat op microscopische systeem en de focus op de protoplasten met behulp van helderveld. </li><li> Na de nadruk op protoplasten, uitschakelen van de halogeenlamp en open de sluiter voor de tl-lamp. </li><li> Selecteer de CY3 / TRITC filterset voor visualisatie van de pporRFP eiwit door de transgene protoplasten uitgedrukt. </li><li> Scannen elk putje het aantal protoplasten expressie pporRFP de fluorescente merker bepalen. </li><li> Bereken de transformatie-efficiëntie als het totaal aantal protoplasten uiting van de fluorescente merker het totaal aantal protoplasten. </li><li> Verzamel elke platen met transgene cellen in goedgekeurde bioveiligheid zakken voor een autoclaaf of andere de-vitalisering procedures zoals gedefinieerd in bioveiligheid protocollen &#39;. </li></ol>

<ol><li>Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+transgenic+nematode+control+in+developed+and+developing+world+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops.</a> Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).</li>
<li>Duke, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+transgenic%2C+herbicide-resistant+crops+in+the+United+States+almost+20+years+after+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction.</a> Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).</li>
<li>Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomics%2C+physiology+and+breeding+approaches+for+improving+drought+tolerance+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops.</a> Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).</li>
<li>Hu, H., Xiong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+and+breeding+of+drought-resistant+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Bio%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops.</a> Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).</li>
<li>Marco, F., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarco%2C+F+%22Plant+Biology+and+Biotechnology%22">Plant Biology and Biotechnology</a>. , Springer. 579-609 (2015).</li>
<li>Edgerton, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+insect+resistance+traits+increase+corn+yield+and+yield+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability.</a> Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).</li>
<li>Vanhercke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+biomass+for+high+energy+density%3A+oilseed-like+triacylglycerol+yields+from+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech.+J%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves.</a> Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).</li>
<li>Baxter, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-year+field+analysis+of+reduced+recalcitrance+transgenic+switchgrass%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech.+J%22%5BJournal%5D)">Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass.</a> Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).</li>
<li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 327(2014).</li>
<li>Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-mediated+transient+gene+expression+and+silencing+system+in+maize+mesophyll+protoplasts%3A+a+valuable+tool+for+signal+transduction+study+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physio.+Plant%22%5BJournal%5D)">PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize.</a> Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).</li>
<li>Martinho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+miRNA+pathways+using+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).</li>
<li>Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+for+gene+silencing+using+siRNAs+in+rice+leaf+and+stem-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts.</a> Plant Methods. 2 (1), 13(2006).</li>
<li>Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasts%3A+a+useful+research+system+for+plant+cell+biology%2C+especially+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation.</a> Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).</li>
<li>Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+meets+plant+sciences%3A+Gold+functionalized+mesoporous+silica+nanoparticle+mediated+protein+and+DNA+codelivery+to+plant+cells+via+the+biolistic+method%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method.</a> Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).</li>
<li>Křenek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+plant+transformation+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens%3A+Principles%2C+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications.</a> Biotechnol. Adv. , (2015).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+growth+and+cryopreservation+of+plant+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures.</a> Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).</li>
<li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+BY-2+cell+line+as+the+%26%2334%3BHeLa%26%2334%3B+cell+in+the+cell+biology+of+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Tobacco BY-2 cell line as the &#34;HeLa&#34; cell in the cell biology of higher plants.</a> Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).</li>
<li>Centomani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+DNA+methylation+in+the+control+of+cell+growth+during+heat+stress+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells.</a> Protoplasma. , 1-9 (2015).</li>
<li>Sgobba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+deficiency+stimulates+a+stress+condition+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechnologia%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells.</a> BioTechnologia. 94 (2), (2013).</li>
<li>Väisänen, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coniferyl+alcohol+hinders+the+growth+of+tobacco+BY-2+cells+and+Nicotiana+benthamiana+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings.</a> Planta. 242 (3), 747-760 (2015).</li>
<li>Ortiz-Espìn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+Trxo1+increases+the+viability+of+tobacco+BY-2+cells+under+H2O2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Botany%22%5BJournal%5D)">Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment.</a> Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis-Golgi+proteins+accumulate+near+the+ER+exit+sites+and+act+as+the+scaffold+for+Golgi+regeneration+after+brefeldin+A+treatment+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Bio.+Cell%22%5BJournal%5D)">cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells.</a> Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).</li>
<li>Madison, S. L., Nebenführ, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+dual-labeled+Golgi+stacks+in+tobacco+BY-2+cells+reveals+similar+behaviors+for+different+cisternae+during+movement+and+brefeldin+A+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment.</a> Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).</li>
<li>de Pinto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylation+of+ascorbate+peroxidase+is+part+of+programmed+cell+death+signaling+in+tobacco+Bright+Yellow-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).</li>
<li>Hanamata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+monitoring+of+autophagic+flux+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signa.+Behav%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510(2013).</li>
<li>Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+Studies+on+proliferation%2C+differentiation%2C+and+death+of+BY-2+cultured+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytologia%22%5BJournal%5D)">Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells.</a> Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).</li>
<li>Yasuhara, H., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphidicolin-induced+nuclear+elongation+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).</li>
<li>Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+coupled+cell-free+transcription-translation+system+based+on+tobacco+BY-2+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates.</a> Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).</li>
<li>Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+BY-2+cell-free+lysate%3A+an+alternative+and+highly-productive+plant-based+in+vitro+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system.</a> BMC Biotechnol. 14 (1), 37(2014).</li>
<li>Alieva, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+coral+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of coral fluorescent proteins.</a> PLoS ONE. 3 (7), 2680(2008).</li>
<li>Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+regeneration+from+leaf-derived+protoplasts+within+the+Daucus+genus%3A+effect+of+different+conditions+in+alginate+embedding+and+phytosulfokine+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tiss.+Org%22%5BJournal%5D)">Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application.</a> Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).</li>
<li>Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+gene+expression+system+in+Populus+euphratica+Oliv.+protoplasts+prepared+from+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physio.+Plant%22%5BJournal%5D)">A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells.</a> Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).</li>
<li>Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+PEG-mediated+transient+gene+expression+system+in+grape+protoplasts+and+its+application+in+subcellular+localization+studies+of+flavonoids+biosynthesis+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Hort%22%5BJournal%5D)">An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes.</a> Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).</li>
<li>Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+oil+palm+protoplasts+by+PEG-mediated+transfection+and+DNA+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection.</a> PLoS One. 9 (5), 96831(2014).</li>
<li>Sasamoto, H., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+nicotinic+acid%2C+nicotinamide+and+trigonelline+on+the+proliferation+of+lettuce+cells+derived+from+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts.</a> Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).</li>
<li>Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+embryo+formation+from+co-cultivated+protoplasts+of+Brassica+rapa+%26+B.+juncea%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Exp.+Ag%22%5BJournal%5D)">Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea.</a> Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).</li>
<li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li>
<li>Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplast+isolation+and+transient+gene+expression+in+switchgrass%2C+Panicum+virgatum+L%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L.</a> Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).</li>
<li>Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switchgrass+%28Panicum+virgatum+L.%29+cell+suspension+cultures%3A+Establishment%2C+characterization%2C+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application.</a> Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).</li>
<li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).</li>
<li>Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+accumulation+of+GFP+in+a+non-acididc+vacuolar+compartment+via+a+C-terminal+propeptide-mediated+sorting+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway.</a> Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).</li>
<li>De Sutter, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+jasmonate+signalling+via+automated+and+standardized+transient+expression+assays+in+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells.</a> Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financieel belang.

De hierboven beschreven protocol is met succes gevalideerd voor protoplastisolatie, telling, en transformatie met behulp van de door-2 tabak schorsing celkweek; echter, kon het protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar alle planten schorsing cultuur. Op dit moment heeft protoplastisolatie en transformatie gerealiseerd in tal van planten, met inbegrip van maïs (Zea mays) 10, wortel (wilde peen) 32, populier (Populus euphratica) 33, druif (Vitis vinifera)</...

In de afgelopen jaren is er een belangrijke impuls gelegd aan het ontwerp van transgene gewassen voor verschillende ziekten 1 te overwinnen, schenken herbicide weerstand 2, overleggen droogte 3,4 en zouttolerantie 5 geweest, herbivorie 6 te voorkomen, te verhogen biomassaopbrengst 7 en celwand weerspannigheid verlagen 8. Deze trend is geholpen door de ontwikkeling van nieuwe moleculaire technieken voor het genereren van transgene planten, waaronder genoom-bewerk, CRISPR Talens en 9, en silencing tot dsRNA 10, 11 miRNA en siRNA 12. Hoewel deze technologieën het genereren van transgene planten hebben vereenvoudigd, hebben ze ook een bottleneck, waarbij het grote aantal transgene planten gegenereerd kunnen niet worden gescreend met behulp van traditionele systemen die afhankelijk zijn van planten regeneratie. Voor dit knelpunt, terwijl zwijgen en genoom-editing constructen kunnen snel in planten worden ingebracht, velegerichte eigenschappen niet het gewenste effect, die vaak niet ontdekt tot planten worden geanalyseerd in de kas te produceren. In dit werk hebben we een werkwijze voor snelle, geautomatiseerde high-throughput screening van plantenprotoplasten ontwikkeld, specifiek de huidige bottleneck begin screening van grote aantallen genoom-editing en silencing streefwaarden. Het gebruik van protoplasten, in tegenstelling tot intacte plantencellen, heeft een aantal voordelen voor de ontwikkeling van een geautomatiseerd platform. Eerst worden protoplasten geïsoleerd na digestie van de plantencelwand, en deze barrière niet meer aanwezig, wordt transformatie-efficiëntie verhoogd 13. In intacte plantencellen zijn er slechts twee gevestigde methoden voor transformatie, biolistica 14 en Agrobacterium-gemedieerde transformatie 15. Geen van deze methoden kan gemakkelijk worden vertaald naar liquid handling platforms, zoals biolistica vereist gespecialiseerde apparatuur voor transformatie, terwijl Agrobacterium-gemedieerde transformatie vereist co-cultuur en de daarop volgende verwijdering van de bacteriën. Niet vatbaar voor high throughput methode. Bij protoplasten, transformatie wordt routinematig uitgevoerd met polyethyleenglycol (PEG) bemiddelde transfectie 16, die op verschillende oplossing vereist uitwisseling, en is ideaal voor vloeistofverwerking platforms. Anderzijds protoplasten per definitie zijn eencellige kweken, en dus de problemen van klontering en ketenvorming in plantencelkweken, worden niet waargenomen in protoplasten. In termen van een snelle screening met behulp van een plaat gebaseerde spectrofotometer, samenklontering van cellen, of cellen in meerdere vlakken zal leiden tot moeilijkheden bij het verkrijgen van consistente metingen. Aangezien protoplasten ook dichter dan de kweekmedia ze bezinken op de bodem van putjes, waarbij een monolaag, die bevorderlijk is voor platen gebaseerde spectrofotometrie. Tot slot, terwijl de fabriek celsuspensieculturen zijn primarily afgeleid van callus 17, kunnen protoplasten worden verzameld van verschillende plantenweefsels, waardoor de mogelijkheid om weefselspecifieke expressie te identificeren. Bijvoorbeeld, het vermogen om wortel- of blad-specifieke expressie van een gen te analyseren kan zeer belangrijk fenotype te voorspellen. Daarom werden de die in dit werk protocollen gevalideerd middels protoplasten geïsoleerd uit de veel gebruikte tabak (Nicotiana tabacum L.) Bright Yellow &#39;2 (BY-2) suspensiekweek. Het BY-2 suspensiekweek is beschreven als het &quot;HeLa&quot; cel van hogere planten door zijn alomtegenwoordige gebruik in moleculaire analyse van 18 plantencellen. Onlangs BY-2 cellen werden gebruikt om de effecten te bestuderen van plantaardige stressoren 19-22, intracellulair eiwit lokalisatie 23,24 en fundamentele celbiologie 25-27 tonen de brede bruikbaarheid van deze culturen in plantenbiologie. Een bijkomend voordeel van BY-2 culturen demogelijkheid om de kweken te synchroniseren met aphidicoline, wat kan leiden tot verbeterde reproduceerbaarheid genexpressiestudies 28. Bovendien zijn werkwijzen ontwikkeld voor de extractie van BY-2 protoplasten met behulp van goedkope enzymen 29,30, enzymen traditioneel gebruikt voor het genereren van protoplasten onbetaalbaar voor high-throughput systemen. Als zodanig heeft de hieronder beschreven protocol gevalideerd met de door-2 suspensiekweek, maar het moet geamendeerd om alle planten celsuspensie cultuur. Proof-of-concept experimenten uitgevoerd met een fluorescentie eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) vanaf het harde koraal Porites Porites 31 onder de controle van de CaMV35S-promoter.

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Microplate mover</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Liquid Handler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Multi-mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultraflat Heater/cooler</td><td>Inheco</td><td>7000190</td><td></td></tr><tr><td>Vworks Automation Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Software gebruikt om protocollen te controleren en te schrijven voor Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Momentum Software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Task scheduling software voor het bedienen van Orbiter RS</td></tr><tr><td>Liquid Handling Control 2.17 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Software gebruikt om te controleren en protocollen te schrijven voor MultiFlo FX</td></tr><tr><td>IX81 Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyla 3-Tap microscope camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost cellulase</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase/arabinase</td></tr><tr><td>Linsmaier &amp; Skoog Basal Medium</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>Voorheen Fluka PEG</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>103184</td><td></td></tr><tr><td>96-well 1.2 ml deep well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>96 well optical bottom plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

een robotic platform voor high-throughput protoplastisola- en transformatie

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

In het laatste decennium is er een opleving in het gebruik van plantaardige protoplasten die variëren van model soort tot soort gewas, voor de analyse van signaaloverdracht, transcriptionele regulatorische netwerken, genexpressie, genoom-editing, en gen-silencing is geweest. Bovendien is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de regeneratie van planten uit protoplasten, die nog meer belangstelling voor het gebruik van deze systemen voor plantengenomics heeft gegenereerd. In dit werk is een protocol ontwikkeld voor de automatisering van protoplastisolatie en transformatie van een &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tabak schorsing cultuur met behulp van een robot platform. De transformatie procedures zijn gevalideerd met een oranje fluorescerend eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) onder controle van de bloemkoolmozaïekvirus 35S-promoter (35S). OFP expressie in protoplasten werd bevestigd door epifluorescentie microscopie. Analyses omvatte ook protoplast efficiëntie van de productie methoden waarbij propidium jodide. Tenslotte werden goedkope food-grade enzymen die voor de protoplast isolatiewerkwijze, omzeilen de noodzaak van lab-klasse enzymen die kosten prohibitief in high-throughput geautomatiseerde protoplastisolatie en analyse. Op basis van het protocol ontwikkeld in dit werk, kan de volledige procedure van protoplastisolatie transformatie worden uitgevoerd in minder dan 4 uur, zonder enige inbreng van de operator. Terwijl de ontwikkelde in dit werk protocol werd gevalideerd met de BY-2 celkweek, moeten de procedures en methodes vertaalbaar naar alle planten schorsing cultuur / protoplast-systeem, dat de versnelling van het gewas genomics onderzoek moet mogelijk te maken.

In de huidige studie, de verdubbelingstijd percentage BY-2 varieerde 14-18 uur afhankelijk van de temperatuur waarbij de kweken werden geïncubeerd, in overeenstemming met eerdere rapporten van een gemiddelde lengte van de celcyclus van 15 uur. Met deze verdubbeling rate, een 1: 100 werd beginnen entstof gebruikt om culturen te initiëren, wat leidt tot culturen met een hematocriet (PCV) van 50% in 5-7 dagen. In het huidige protocol, waarin kweken werden gekweekt in 200 ml medium, een PCV ...

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Het algemene doel van dit protocol is het ontwikkelen van een methode voor snelle, geautomatiseerde high-throughput screening van plantenprotoplasten, specifiek om de huidige bottleneck bij de vroege screening van grote aantallen doelen voor genoomredactie en gen-silencing aan te pakken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de plantbiotechnologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het high-throughput geautomatiseerde protoplastproductie en transformatie mogelijk maakt voor snelle parallelle screening van promoterfuncties in genexpressie.Deze procedure wordt gedemonstreerd met behulp van de veelgebruikte tabaks suspensiecultuur 'bright yellow two', of BY-2. Begin met het kweken van een BY-2-cultuur in een Erlenmeyerkolf, zoals beschreven in de protocoltekst. Meng de cultuur op de dag van de protoplastisolatie grondig, aangezien cellen snel bezinken, en breng zes milliliter van de cultuur over in een centrifugebuis met kegelvormige bodem van 15 milliliter.Laat de cellen gedurende ten minste 10 minuten bezinken. Pas het gepakte celvolume aan tot 50% van het totale volume door het juiste volume supernatant te verwijderen. Schud d

a-robotic-platform-for-high-throughput-protoplast-isolation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Een eenvoudige en efficiënte methode te...

Efficiënte polyethyleenglycol (PEG) gemedieerde transformatie van de Moss Physcomitrella patens</em

Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm...

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

Een high-throughput, geautomatiseerd platform van de productie cellijn ontwikkeling voor de productie van therapeutische eiwitten is beschreven. Uitvoering van de BD FACS Aria Cell Sorter, heeft CloneSelect Imager en Tecan Freedom EVO liquid handling systeem gedemonstreerd aanzienlijk toegenomen verwerkingscapaciteit in cellijn ontwikkeling met verbeterde cellijn kwaliteit en een hoge reproduceerbaarheid.

Een High-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van Manufacturing Cell Protein Therapeutics Lines voor

Dit artikel beschrijft genetische transformatie van de eencellige mariene...

Genomic Transformatie van de Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

We beschrijven een werkwijze voor de affiniteit-gemerkte zuivering van recombinante eiwitten met vloeistof handling robotica. Deze methode is algemeen toepasbaar op de kleinschalige zuivering van oplosbare His-gemerkte eiwitten in een high-throughput format.

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

Hier, wordt een geautomatiseerde workflow voor het uitvoeren van modulaire DNA "apparaat" vergadering met behulp van een modulaire klonen DNA vergadering methode op vloeistof aangestuurde robots gepresenteerd. Het protocol maakt gebruik van een intuïtieve softwaretool voor het genereren van vloeibare handler selectielijsten voor combinatorische DNA apparaat bibliotheek generatie, waaruit we met behulp van twee vloeibare behandeling platforms.

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

Hier beschrijven we een protocol om het uiten van eiwitten in protoplasten met behulp van PEG-gemedieerde transformatie methode. De methode biedt eenvoudige uitdrukking van proteïnen van belang, en efficiënte opsporing van eiwit lokalisatie en het importproces voor verschillende experimentele omstandigheden in vivo.

Eiwit invoer in chloroplasten met behulp van protoplasten studeren

Hier presenteren we een high-throughput protocol om miljoenen maïsprotoplasten tijdelijk te transfecteren voor het testen van grote bibliotheken van plasmiden in maïsmesofylcellen.

Schaalbare transfectie van maïs mesophyl protoplasten

We beschrijven het gebruik van een multiplexe hoogdoorvoerige genexpressieplatform die genexpressie kwantificeert door middel van barcodes en het tellen van moleculen in biologische substraten zonder de noodzaak voor amplificatie. We gebruikten het platform om microRNA (miRNA) expressie in vol bloed te kwantificeren bij personen met en zonder prikdarm syndroom.

Verstoringen van circulerende miRNAs in het prikkelbare darm syndroom gedetecteerd met een multiplexverzending High-throughput genexpressie Platform

Leer een geautomatiseerde methode voor high-throughput protoplastisolatie en transformatie in tabak BY-2-cellen. Dit robotplatform versnelt parallelle screening van genexpressie en genoombewerking in plantenbiotechnologie.

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Meer video's verkennen