Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution
7 oktober 2016
We beschrijven een protocol voor het volumetrisch afbeelden van met fluorescente eiwitten gelabelde cellen diep in intacte embryonale en postnatale harten. Door gebruik te maken van weefselklaringsmethoden in combinatie met gehele montagekleuring, kunnen enkele met fluorescente eiwitten gelabelde cellen in een embryonaal of postnataal hart duidelijk en nauwkeurig worden afgebeeld.
Het algemene doel van deze procedure is om fluorescente eiwitgelabelde cellen diep in intacte harten volumetrisch te beeld, om genfuncties met enkele celresolutie te bestuderen tijdens de hartontwikkeling en in postnatale harten. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden tijdens de hartontwikkeling, zoals het bestuderen van genfuncties en het helpen beeld te vormen met enkele-celresolutie tijdens de hartontwikkeling en animidaalse artefacten. Het grote voordeel van deze methode is dat het relatief eenvoudig, goedkoop en pro-wise is in speciale temporele analyse van de gen- en eiwitfuncties met enkele celresolutie in intact embryo of hart.
Hoewel we dit systeem gebruiken om hartontwikkeling bij muizen te bestuderen, kun je het ook gebruiken om andere orgaansystemen te bestuderen, zoals spieren, hersenen en longen en ook bij andere modelorganismen. Fluorescente eiwitpositieve embryo's van Tamoxifren-behandelde R-26 Cre-RET2 confetti moeders worden hier gebruikt. Begin met kleuren door elk paraformaldehyde-gefixeerd embryo in een milliliter van 0,1%PBST in de putjes van een 48-putjesplaat onder te dompelen.
Incubeer gedurende twee uur op een plaatjesschudder op kamertemperatuur om het weefsel te permeabiliseren. Vervolgens vervangt u de permeabilisatieoplossing door één ml blokkeringsbuffer en incubeert u, met schudden, gedurende twee uur op kamertemperatuur of een nacht bij vier graden Celsius. Bereid vervolgens een een-op-honderdverdunning van het endotheelcel-specifieke antilichaam, PECAM, in 0,3 milliliter blokkeringsbuffer voor elke put en voeg dit toe aan de putten met de embryo's.
Incubeer gedurende 48 uur met schudden bij vier graden Celsius. Na de incubatie, wast u de embryo's vijf keer met PBST gedurende 30 minuten elke keer om overtollig primaire antilichaam uit het weefsel te verwijderen. Dompel vervolgens de embryo's onder in Alexa Fluor 647 goat antivat secundair antilichaamoplossing en incubeer met schudden gedurende 48 uur bij vier graden Celsius, terwijl beschermd tegen licht.
48 uur later, na het wassen ervoor, post-fixeert u de embryo's met 4%PFA gedurende één uur op kamertemperatuur met schudden. Was vervolgens twee keer met PBS gedurende vijf minuten elke keer en incubeer de embryo's met DAPI nucleaire kleurstof gedurende tien minuten. Volg met twee PBS-wasbeurten van vijf minuten elk, en ga vervolgens door naar weefselheldering.
De weefselheldering is de meest cruciale stap in dit protocol om het hart met een enkele-celresolutie te beeld. Ook is de selectie van de helderheidsmethode, ofwel schaal of CUBIC, ook erg belangrijk om fluorescente signalen in het intacte embryonale hart te behouden. Breng de gewassen, gekleurde embryo's over in een scintillatieglas omwikkeld met aluminiumfolie, dat één milliliter van schaal A2-oplossing bevat.
Incubeer bij vier graden Celsius met incidenteel zachtjes schudden met de hand gedurende 48 uur. Na de schaal A2-incubatie, vervang de oplossing in het glas door één milliliter van schaal B4-oplossing, en incubeer bij vier graden Celsius met incidenteel zachtjes schudden voor nog eens 48 uur. Incubeer de embryo's nog eens 48 uur met één milliliter van schaal 70 bij vier graden Celsius met incidenteel zachtjes schudden zoals voorheen.
Laatst, dompel het schaal-helderde monster onder in één milliliter van 90%glycerol en bewaar het bij vier graden Celsius tot beeldvorming. Om te beeld, breng het monster over naar een glasbodem petrischaal met een minimale hoeveelheid van 90%glycerol en beeld met een confocale microscoop uitgerust met twee foton mogelijkheden. Voor CUBIC-helderheid, dompel elk embryo onder in één milliliter van CUBIC een met incidenteel zachtjes schudden gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius.
Na 48 uur, vervang de oplossing door hetzelfde volume van verse CUBIC-reagens een en incubeer het monster gedurende nog eens 48 uur, zoals eerder. Na de incubatie, was de CUBIC een behandelde embryo's met PBS verschillende keren met zachtjes schudden met de hand om de overtollige CUBIC een oplossing te verwijderen. Dompel vervolgens de embryo's onder in CUBIC twee oplossing gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius met incidenteel zachtjes schudden met de hand.
Als er een vertraging zal zijn voordat beeldvorming, incubeer de monsters sequentieel met één milliliter van 30%50%en 70%glycerol en PBS gedurende 30 minuten elk. Na het doorlopen van de serie, breng over naar 90%glyceroloplossing voor opslag bij vier graden Celsius. Wanneer klaar, beeld in een glasbodem petrischaal met 90%glycerol, zoals eerder.
Deze film toont optische secties van een schaal-behandelde E 8.75 hart, van hartoppervlak tot lumen. Geel markeert de PECAM-expressie en alle cardiomyocyten zien er groen uit. De diepte is 110,4 micron en er zijn in totaal 93 plakjes.
Dit is de 3D-oppervlakte afbeelding van het net getoonde gereconstrueerde hart. Nogmaals, geel markeert PECAM-expressie, en groen labelt alle cardiomyocyten. Deze film toont secties van een enkele progenitorklon van een schaal-behandelde E 9.5 hart in de uitstroomkanaalregio.
Geel markeert de PECAM-expressie en de klon ziet er groen uit. De diepte is 36 micron en er zijn in totaal 10 plakjes. Deze film toont secties van een CUBIC-behandeld P twee hart van oppervlak tot lumen.
De diepte is 130 micron met drie micron per sectie. Deze film toont secties van een CUBIC-behandelde E 17.5 hart van oppervlak tot lumen. De diepte is 630 micron met zes micron per sectie.
Dit is een 3D-oppervlakte afbeelding van het net getoonde hart, gereconstrueerd via de 3D reconstructie software. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het embryo kwetsbaar is en hartpathologie gemakkelijk kan worden verstoord. Volgend op deze procedure, kan ander eiwit worden gerealiseerd, met behulp van kleuring om de gen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor volumetrische beeldvorming van cellen die zijn gelabeld met fluorescente eiwitten in intacte embryonale en postnatale harten. De methode combineert weefselverhelderingstechnieken met whole mount-kleuring om heldere beeldvorming op single-cell resolutie te bereiken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Hartontwikkeling
- Fluorescentie-imaging
- Genfunctieanalyse
Achtergrond
- Het begrijpen van genfuncties tijdens de hartontwikkeling is cruciaal.
- Imaging met single-cell resolutie maakt gedetailleerde analyse mogelijk.
- De methode is toepasbaar op diverse organsystemen en modelorganismen.
- Labeling met fluorescerende eiwitten verbetert de visualisatie van specifieke cellen.
Doel van de studie
- Om genfuncties op resolutie van individuele cellen in hartweefsels te bestuderen.
- Om ontwikkelingsprocessen in embryonale en postnatale harten te onderzoeken.
- Om een relatief eenvoudige en kosteneffectieve beeldvormingsmethode te bieden.
Gebruikte methoden
- Gebruik van weefselklaringstechnieken.
- Whole mount-kleuring van cellen gelabeld met fluorescente eiwitten.
- Beeldvorming van met paraformaldehyde gefixeerde embryo's.
- Toepassing van de methode op diverse orgaansystemen buiten het hart.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle beeldvorming van met fluorescerende eiwitten gelabelde cellen in intacte harten.
- Duidelijke visualisatie van genfuncties tijdens de ontwikkeling van het hart.
- Demonstratie van de veelzijdigheid van de methode over verschillende orgaansystemen heen.
- Vestiging van een protocol dat toegankelijk en efficiënt is.
Conclusies
- Het protocol maakt gedetailleerde studie van de hartontwikkeling op cellulair niveau mogelijk.
- Het kan worden aangepast voor gebruik in andere biologische systemen.
- Deze methode vergroot ons begrip van genfuncties tijdens de ontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het afbeelden van geklaarde embryonale en postnatale harten met resolutie op enkelcelniveau maakt een gedetailleerd onderzoek mogelijk naar het gedrag en de differentiatie van cardiale progenitorcellen tijdens de ontwikkeling. Deze benadering ondersteunt doelwitvalidatie door de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grond liggen aan normale en abnormale cardiale morfogenese te verduidelijken. De methode biedt voorspellende zekerheid in preklinische modellen door genfunctie te koppelen aan structurele uitkomsten in intact weefsel.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de clonale dynamiek in ontwikkelend hartweefsel te visualiseren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe observatie van de bijdrage van progenitorcellen aan hartstructuren.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in de selectie van targets door genperturbatie te koppelen aan fenotypische uitkomsten op single-cell resolutie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound screening door fluorescente signalen na het clearing-proces te behouden.
- Operationele waarde: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via reproduceerbare workflows voor weefselclearing en whole-mount kleuring.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform over embryonale en postnatale stadia met stadium-specifieke clearing-methoden (ScaLe voor embryonaal, CUBIC voor postnataal).
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door consistente beeldvorming van genfuncties mogelijk te maken over verschillende ontwikkelingsstadia heen.
- Mechanistische risicoreductie: Onthult de cellulaire basis van aangeboren hartafwijkingen via clonale analyse in intacte harten.
- Ziekterelateerd systeem: Biedt een fysiologisch contextrijk model voor het bestuderen van cardiale morfogenese die relevant is voor de menselijke ontwikkeling.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetests van targets tot lead-identificatie en preklinische validatie, door kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste read-outs van genfuncties in intact hartweefsel mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetests en pathway-verduidelijking door de visualisatie van clonale expansie en differentiatie tijdens de hartontwikkeling.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde clearing- en kleuringsprotocollen die epitopen en fluorescent proteinsignalen behouden.
- Analytica: Genereert kwantitatieve 3D-beeldgevingsgegevens waardoor vergelijking van clonale distributie, grootte en lokalisatie over verschillende experimentele condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door longitudinale beoordeling mogelijk te maken van cardiale structurele fenotypes gekoppeld aan genetische perturbaties.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbare beeldgevingscapaciteit die toepasbaar is op diverse organsystemen (hart, hersenen, long, spier) en modelorganismen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in cardiale ontwikkelingspaden te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door gedefinieerde clearing- en kleuringsstappen die compatibel zijn met confocale en twee-fotonen beeldvorming.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door direct visueel bewijs te leveren van target-interactie en fenotypische gevolgen in intact weefsel.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door vroege ontwikkelingsfenotypes te koppelen aan potentiële mechanismen van aangeboren afwijkingen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescerende eiwitlabeling, whole-mount immunostaining en weefselklarings-technieken.
- Is afhankelijk van toegang tot confocale of twee-foton microscopiesystemen die in staat zijn tot deep-tissue imaging.
- Maakt standaardisatie van de selectie van de klaringsmethode (ScaLe versus CUBIC) noodzakelijk op basis van het ontwikkelingsstadium om de weefselintegriteit en het signaal te behouden.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van het protocol op andere organsystemen vanwege variaties in weefseldichtheid en klaringstolerantie.
- Omvat praktische beperkingen zoals de fragiliteit van weefsels tijdens de hantering en potentiële verstoring van de pathologie als de klaring niet is geoptimaliseerd voor het ontwikkelingsstadium.
