Name: Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Leer een weefselophelderingsmethode voor volumetrische beeldvorming van fluorescent gelabelde cellen in intacte embryonale en postnatale harten. Deze techniek maakt gedetailleerde analyse van genfuncties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de leden van het M.W. laboratorium voor de wetenschappelijke discussie. Dit werk wordt ondersteund door AHA [13SDG16920099] aan M.W., en door National Heart, Lung, and Blood Institute subsidies [R01HL121700] aan M.W. Beelden werden vastgelegd in de Imaging Core Facility aan het Albany Medical College.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in Albany Medical College en uitgevoerd volgens de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. 1. Oplossing Voorbereidingen LET OP: De Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17 en Rosa26-mTmG (mTmG) 20 muis lijnen werden in de winkel gekochte cTnT-Cre 18 was een geschenk van Dr. Jiao aan de Universiteit van Alabama Nfatc1-Cre.. was een gift van Dr. Bin Zhou bij Albert Einstein College of Medicine 19. Muizen werden gedood door inhalatie van kooldioxide in een gesloten kamer gedurende ten minste 60 seconden gevolgd door fysieke middelen dood verificatie door bilaterale thoracotomie, onthoofding of cervicale dislocatie. <ol><li> Bereid Tamoxifen. Los 10 mg Tamoxifen in 10 ml van zonnebloemzaad oil. Zodra het volledig is opgelost, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Ontbinden Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) en KCl (0,20129 g) in 1 liter gedestilleerd water en breng de pH op 7,4. </li><li> Bereid PBST: 0,1% Tween-20 in PBS oplossing door het oplossen van 100 ul Tween-20 in 100 ml PBS. </li><li> Bereid blokkerende buffer. Voeg 3% runderserumalbumine (BSA) blokkeeroplossing door het oplossen van 3 g BSA in 100 ml PBST dat 0,2% Tween-20. </li><li> Bereid CUBIC-1 (reagens 1). Meng 25 gew% ureum, 25 gew% N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamine en 15 gew% Triton X-100 in dH 2 O. </li><li> Bereid CUBIC-2 (reagens 2). Meng 50 gew% sucrose, 25 gew% ureum, 10 gew% 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;- nitrilotriethanol en 0,1% (v / v) Triton X-100 in dH 2 O. </li><li> Bereid Sca le A2: 4 M ureum, 10% w / v glycerol en 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Breng de pH op 7,7. </li><li> Bereid Sca le B4: 8 M ureum en 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Stel de pH tot 8,7. </li><li> Bereid Sca le 70: 4 M ureum, 70% w / v glycerol en 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. </li></ol> 2. Tamoxifen Inductie, Embryo Isolatie en Fixation <ol><li> Tamoxifen Inductie en Embryo Isolation <ol><li> Met behulp van een gebogen voedingssonde goedgekeurde protocol (ACUP 13-12007), maagsonde de vrouwelijke R26Cre ERT2 Confetti muizen (gestopt door R26Cre ERT2 mannelijke muizen) met 10 ug / g van Tamoxifen op embryonale ontwikkelingsstoornis dag E7.75 33. Op embryonale dag 9,5 (E9.5) of E10.5, euthanaseren de vrouwelijke muizen met CO 2 en cervicale dislocatie. </li><li> Na controle van de muis dood (zie paragraaf 1 Opmerking), opent u de muis buikholte met een schaar en ontleden de baarmoeder hoorn, verwijder de eileider lagen met behulp van een schaar en pincet, en release het embryo uit de eileider 23,24. <ol><li> Breng de embryo een petrischaaltje met PBS (pH 7,4). Onder de dissectiemicroscoop opheffen van de niet-embryonale lagen (chorion, dooierzak en amnion) met behulp van een pincet. </li></ol></li><li> Met behulp van een pincet en een schaar, het verzamelen van de vrouwelijke muis en embryo staart monsters voor genotypering zoals eerder gemeld 22. Met een plastic pipet elk embryo een putje van een 48 putjesplaat met 1 ml 1x PBS. </li><li> Onder een fluorescentiemicroscoop, identificeren de GFP / RFP / CFP positieve embryo via een omgekeerde microscoop met camera. Schil weg het hartzakje met een pincet en draai het hart / embryo met behulp van gebogen pincet om het aantal fluorescerende klonen aan beide zijden van het hart met de GFP / RFP / GVB filters te bepalen. Geen bezuinigingen nodig zijn. </li></ol></li><li> Na het identificeren van GFP / RFP / GVB positieve embryo&#39;s snel de embryo&#39;s te wassen tweemaal (2 min elk) met 1x PBS in the 48 goed plaat op een bord shaker bij kamertemperatuur (RT). Dit zal overtollig bloed te verwijderen. </li><li> Bevestig de embryo / embryonale hart met behulp van 4% paraformaldehyde (PFA) bij kamertemperatuur. De bevestiging is afhankelijk van de embryonale leeftijd en weefselgrootte. Voor E9.5 bevestig de embryo gedurende 2 uur bij KT. De late embryonale stadium embryo&#39;s vereisen een langere fixatie tijd, die zelfs kan worden verlengd tot 24 uur voor postnatale hart. LET OP: Paraformaldehyde is giftig, contact met de huid, ogen en slijmvliezen vermijden. </li><li> Na fixatie, was de embryo / hart in de 48 goed plaat twee keer (10 min elk) met 1x PBS op een plaat schudder bij RT. Dit verwijdert het overtollige PFA van het embryo / hart. De embryo&#39;s worden dan verder verwerkt voor de hele mount kleuring en weefsel clearing. </li></ol> 3. Hele Mount kleuring OPMERKING: Nadat PFA fixatie het embryo / hart als volgt wordt onderworpen aan ganse berg vlekken. <ol><li> Permeabilize het embryo / hart in een 48 goed plaat met behulp van 1 ml 0,1% PBST gedurende 2 uur op plaat schudder bij kamertemperatuur. </li><li> Na permeabilisatie, dompel de embryo / hart in 1 ml van het blokkeren van buffer, gedurende 2 uur of &#39;s nachts op een plaat schudder bij 4 ºC. </li><li> Dompel het embryo / hart naar de endotheelcel-specifiek antilichaam PECAM (CD31), verdund (1: 100) in 0,3 ml blokkerende buffer gedurende 48 uur op plaat schudder bij 4 ° C. </li><li> Was de embryo / hart met behulp van PBST 5 keer, 30 min elk bij RT op plaat shaker. Dit verwijdert de overmaat niet-specifiek gebonden primair antilichaam uit het weefsel. </li><li> Dompel het embryo / hart in Alexa Fluor 647 geit anti-rat secundair antilichaam, verdund (1: 1000) in 1 ml blokkeerbuffer gedurende 48 uur op plaat schudder bij 4 ° C. </li><li> Herhaal stap 3,4 aan het secundaire antilichaam was. </li><li> Post-fix het embryo / hart met 4% PFA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op plaat schudder en tweemaal wassen met PBS 5 minuten elk. </li><li> Vlekken op het embryo / hart met de nucleaire vlek 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (verdund in PBST bij een concentverhouding van 0,01 mg / ml) gedurende 10 min op plaat schudder bij kamertemperatuur. Volg met PBS twee wassingen van 5 minuten elk. </li></ol> 4. Embryo / hart Clearing met Sca l e of CUBIC Method LET OP: Na het ganse berg kleuring, wordt het embryo / hart onderworpen aan ofwel de Sca le of KUBIEKE weefsel clearing methode. De wijze is afhankelijk van de weefselgrootte en embryonale leeftijd. Voor E11.5 of jongere leeftijd embryo&#39;s, gebruik Sca l e weefsel clearing methode, terwijl voor oudere embryo&#39;s of postnatale harten de CUBIC weefsel clearing methode heeft de voorkeur. <ol><li> Schaal Tissue Clearing Methode <ol><li> Incubeer de embryo / hart met 1 ml Sca l e A2 oplossing in een scintillatieflesje (verpakt in aluminiumfolie) waarbij af en toe voorzichtig schudden (handmatig) gedurende 48 uur bij 4 ° C. </li><li> Na Sca l e A2 incubatie Incubeer de embryo / hart met 1 ml Sca l e B4 oplossing bij 4 ° C in dezelfde flacon af en toe lichtjes schudden Anothaar 48 uur. </li><li> Incubeer de embryo / hart voor een 48 uur met 1 ml Sca l e 70 bij 4 ° C met af en toe voorzichtig schudden. Mount embryo met behulp van 90% glycerol (zie paragraaf 5.1). </li></ol></li><li> CUBIC Tissue Clearing Methode <ol><li> Voor de hele embryo / hart CUBIC clearing, dompel elk embryo / hart in 1 ml kubieke-1 met af en toe voorzichtig schudden gedurende 48 uur bij 37 ° C 7. Na 48 uur werd de oplossing vervangen met hetzelfde volume verse CUBIC reagens 1 en incubeer het monster gedurende nog 48 uur bij 37 ° C met af en toe schudden met de hand. </li><li> Was de CUBIC-1 behandelde hart / embryo met 1x PBS meerdere malen bij kamertemperatuur onder zacht schudden met de hand. Dit verwijdert de overtollige CUBIC-1 oplossing. </li><li> Na uitwassen CUBIC-1 met PBS, dompel de embryo&#39;s / hearts in kubieke-2-oplossing (1 g per embryo / heart) gedurende 48 uur bij 37 ° C met af en toe lichtjes schudden met de hand. Dit volgt embryo / heart montage met behulp van glycerol (zie hoofdstuk 50,2). </li></ol></li></ol> 5. Sample Montage en Imaging LET OP: De ontruimde embryo&#39;s of organen in Sca l e 70 of CUBIC-2-oplossing kan direct respectievelijk worden afgebeeld met schaal 70 en CUBIC-2-oplossing als de beeldvormende medium. Echter, gezien de kwetsbaarheid van de embryonale monsters clearing reagentia, indien de monsters worden niet onmiddellijk worden afgebeeld, maar opgeslagen langdurige monsters worden in 90% glycerol de onderstaande protocol. <ol><li> Direct dompel de Sca le ontruimd monster in 1 ml van 90% glycerol en bewaar bij 4 ° C tot beeldvorming. </li><li> Was de kubische behandelde monster met 1x PBS tweemaal 5 min elk en achtereenvolgens incuberen van het monster met 1 ml van 30%, 50%, 70% en 90% glycerol oplossing elke 30 minuten. </li><li> Voor beeldvorming, breng het monster glazen bodem petrischaal met een minimale hoeveelheid van 90% glycerol en beeld klonen met een confocale microscoop met twee foton mogelijkheden. </li><li> Afbeelding het hart of embryo in de glycerol met een 10X / 0.3 NA, een 25X / 0.8 NA onderdompeling, of een 40X / 1.2 NA water corrigerende objectief. Afbeelding DAPI met behulp van 2-foton excitatie van een coherent titanium: saffier kameleon laser. De keuze van de microscoop objectieflens zal afhangen van het doel van de experimenten, bijvoorbeeld voor superresolutie kan een lichtwaaier fluorescentiemicroscoop worden gebruikt. </li></ol>

<ol><li>Vincent, S. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+heart%3A+the+origin+and+regulation+of+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells.</a> Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+discoveries+in+cardiac+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A decade of discoveries in cardiac biology.</a> Nat Med. 10, 467-474 (2004).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+in+the+evolution+and+development+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart.</a> Science. 313, 1922-1927 (2006).</li>
<li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+high-resolution+episcopic+microscopy+%28HREM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM).</a> Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).</li>
<li>Soufan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+gene+expression+patterns+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development.</a> Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916(2012).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+genetic%2Fpharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Agah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+recombination+in+postmitotic+cells.+Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+cardiac-restricted%2C+site-specific+rearrangement+in+adult+ventricular+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo.</a> J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).</li>
<li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151, 1083-1096 (2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+spindle+orientation+controls+cell+entry+into+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium.</a> Dev Cell. 19, 114-125 (2010).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+family+proteins+are+essential+for+cardiac+morphogenesis+and+progenitor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation.</a> Development. 141, 281-295 (2014).</li>
<li>Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , Academic Press. London. (1992).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).</li>
<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li>
<li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterior+heart-forming+field%3A+voyage+to+the+arterial+pole+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart.</a> Trends Genet. 18, 210-216 (2002).</li>
<li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricle%2C+outflow+tract%2C+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary%2Fanterior+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Dev Biol. 287, 134-145 (2005).</li>
<li>Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+the+secondary+heart+field+leads+to+tetralogy+of+Fallot+and+pulmonary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia.</a> Dev Biol. 284, 72-83 (2005).</li>
<li>Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-acting+regulatory+sequences+governing+Wnt-1+expression+in+the+developing+mouse+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS.</a> Development. 120, 2213-2224 (1994).</li>
<li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural%5BTitle%5D)+AND+%22Developement%22%5BJournal%5D)">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Developement. 127, 1607-1616 (2000).</li>
<li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat Rec. 201, 157-168 (1981).</li>
<li>Wu, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+family+proteins%3A+novel+players+in+cardiac+morphogenesis+and+cardiac+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+concepts%22%5BJournal%5D)">Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation.</a> Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Lineage+Tracing+Reveals+that+Oriented+Cell+Division+Contributes+to+Trabecular+Morphogenesis+and+Regional+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification.</a> Cell reports. 15, 158-170 (2016).</li>
<li>Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+on+thermal-+and+chemical-induced+denaturation+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).</li>
<li>Captur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+myocardial+trabeculae+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo.</a> J Anat. , (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

De embryo isolatie is een zeer belangrijke stap. E9.5 embryo&#39;s zijn erg kwetsbaar en klein in omvang, dus extra zorg moeten worden genomen van het embryo / hart structuren niet te beschadigen tijdens het isolement. De niet-embryonale extra lagen omhult het embryo / hart moeten zorgvuldig vooral als beeldvorming van de hele embryo worden verwijderd. Dit maakt het mogelijk antilichaam en clearing mengsel penetratie diep in de embryonale weefsels, en helpt ook bij het verwijderen van de achtergrond signaal wanneer beel...

Cardiale morfogenese is een sequentiële Indien de spatiotemporele organisatie van vier verschillende typen cardiale progenitorcellen in verschillende sectoren van het hart nodig en vereist meerdere genetische regulerende netwerken om dit proces orkestreren de functionele hart 1,2 vormen ook. Cardiale specificatie, differentiatie, patronen, en kamermuziek rijping worden gereguleerd door cardiogene transcriptiefactoren 3. Genetische mutatie of posttranscriptionele aberratie van deze factoren in het hart stamcellen zou kunnen resulteren in een van beide embryonische dodelijkheid of aangeboren hartafwijkingen (CHD) 4. De studie van cardiale morfogenese vereist een begrip van de inherente structurele details in drie dimensies (3D) en single gelabelde cardiale voorlopercellen cel lineage tracing tijdens de ontwikkeling van het hart zal het begrip van cardiale morfogenese te promoten. Een aantal high-resolution sectie, gebaseerd tomografie methoden ontwikkeld in the afgelopen decennia aan het orgel structuur 5,6; Deze werkwijzen vereisen dure, gespecialiseerde instrumenten, uitgebreide arbeid en gebrek gedetailleerde structurele organisatie op één resolutiecel in de uiteindelijke volumetrische gereconstrueerde beeld 7,8. 3D volumetrische beeldvorming op enkele cel niveau verschaft een middel om voorlopercellen celdifferentiatie en cellulair gedrag te bestuderen in vivo 7. Echter, weefsel lichtverstrooiing blijft de belangrijkste hinderpaal voor de beeldvorming van de cellen en structuren in 3D diep in het intacte hart. Lipiden zijn een belangrijke bron van lichtverstrooiing, en het verwijderen van lipiden en / of aanpassing van het brekingsindexverschil tussen lipiden en hun omgeving zijn mogelijke benaderingen voor toenemende weefsel transparantie 8. In de afgelopen jaren een aantal weefsels clearing methoden ontwikkeld, waarmee weefsel dichtheid en lichtverstrooiing te verminderen, zoals BABB (benzylalcohol en benzyl benzoate mengsel) en DBE (tetrahydrofuran en dibenzylether); maar bij deze werkwijzen, fluorescentiedoving blijft een probleem 8-10. Het oplosmiddel gebaseerde hydrofiele methoden, zoals SeeDB (fructose / thioglycerol) en 3DISCO (dichloormethaan / dibenzylether), het behoud van fluorescerende signalen, maar niet maken het hele orgel transparant 7,8,11. Ter vergelijking: de CLARITY weefsel-clearing werkwijze maakt het orgel transparant, maar het vereist een speciale elektroforese apparaat lipiden 8,12 verwijderen, evenals PACT (passieve duidelijkheid techniek), waarvoor ook hydrogel insluiten 7,13. Voor gedetailleerde informatie over alle beschikbare weefsel opruimmethoden, zie tabel 1 in Richardson en Lichtman, et al. 7. In 2011, Hama et al. Serendipitously ontdekte een hydrofiel mengsel &#39;Sca le&#39; (ureum, glycerol en Triton X-100 mengsel), die de hersenen van muizen en embryo tran maaktent terwijl volledig behoud fluorescentiesignalen van gelabelde klonen 14. Dit zorgt voor de beeldvorming van de intacte hersenen op een diepte van enkele millimeters en grootschalige reconstructie van neuronale populaties en projecties bij een subcellulaire resolutie. Susaki et al. verder verbeterd Sca le door het toevoegen van aminoalcoholen en ontwikkelde de &#39;cubic&#39; (helder, onbelemmerd brain imaging cocktails en computationele analyse) weefsel clearing methode, die fosfolipiden oplosbaar verhoogd, verminderde clearing tijd, en toegestaan voor multicolor fluorescerende beeldvorming 8. In de huidige studie, gebruik te maken van de Sca le en CUBIC weefsel clearing technieken en een hoge resolutie 3D-optische sectie, individuele klonen in het hart tijdens cardiogenese werden opgespoord met behulp van Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong&gt; Nfatc1-Cre 19 en Rosa26-mTmG (mTmG) 20 muis lijnen. De combinatie van de werkwijze ganse berg kleuring (WMS) ontwikkeld eerder 21,22 met weefsel wismethodes verder toegestaan voor de kleuring van andere eiwitten in gelabelde klonen en voor de studie van hun gedrag in een 3D volumetrische context. De combinatie van weefsel en clearing WMS zorgt voor een beter begrip van de rol van de verschillende genen en eiwitten bij ontwikkeling van het hart en de etiologie van aangeboren hartafwijkingen. Dit protocol kan worden toegepast op andere voorlopercellen celdifferentiatie, celgedrag en orgel morfogenese gebeurtenissen bestuderen tijdens de ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>2,2&prime;,2&prime;&rsquo;-nitrilotriethanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde in PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td>BP16000</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&rsquo;,N&rsquo;-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Zonnebloemzaadolie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI nucleaire kleuring</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37oC Incubator</td><td>Thermoscientific Fischer</td><td>Heratherm, Compact Microbiological Incubators</td><td></td></tr><tr><td>48 welplaten</td><td>Cell Treat</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Analytische weegschaal</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 confocale microscoop</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 Glass Bead Sterilizer</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal 60 mm x15 mm&nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Rocker II&nbsp; Platform Rocker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Scintillatiebuizen</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipet</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging ontruimde embryonale en postnatale hearts bij single-cell resolution

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Één klonale tracing en analyse op het hele hart kan tijdens hartontwikkeling cardiale voorlopercellen celgedrag en differentiatie vast, en zorgen voor de studie van de cellulaire en moleculaire basis van normale en abnormale cardiale morfogenese. Recente opkomende technologieën van retrospectieve enkele klonale analyses maken van de studie van de cardiale morfogenese bij enkele resolutie cel haalbaar is. Echter, wordt het weefsel dekking en lichtverstrooiing van het hart als imaging diepte toegenomen hinder hele hart imaging bij enkele resolutie cel. Om deze obstakels, een hele embryo clearing systeem dat het hart zeer transparant voor zowel de belichting en detectie worden ontwikkeld kan maken overwinnen. Gelukkig is in de afgelopen jaren, veel methodieken voor hele organisme clearing systemen zoals DUIDELIJKHEID, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB en PACT gemeld. Dit lab is geïnteresseerd in de cellulaire en moleculaire mechanismen van de kaartiac morfogenese. Onlangs, hebben we enkele cel lineage tracing via de ROSA26-Cre ERT2; ROSA26-Confetti systeem om spaarzaam label cellen tijdens de ontwikkeling van het hart. We aangepast enkele hele embryo clearing methodieken waaronder Sca le en CUBIC (helder, onbelemmerd brain imaging cocktails en computationele analyse) voor het embryo in combinatie ontruimen met hele mount vlekken op de foto om enkele klonen in het hart. Het hart werd met succes afgebeeld op één resolutie cel. We vonden dat Sca le het embryonale hart kan duidelijk, maar niet effectief duidelijk de postnatale hart, terwijl CUBIC de postnatale hart kan duidelijk, maar schade toebrengt aan het embryonale hart door het oplossen van het weefsel. De hier beschreven werkwijzen zal het onderzoek van genfunctie mogelijk te maken een resolutie kloon gedurende cardiale morfogenese, die op hun beurt kunnen de cellulaire en moleculaire basis van aangeboren hartafwijkingen onthullen.

Beeldvorming van het ontruimde embryonale hart Gewervelde hartvorming een spatiotemporeel morfogene gereguleerd proces en is afhankelijk van de organisatie en differentiatie van progenitorcellen uit vier verschillende bronnen 1. Cellen van het eerste hart gebied van cardiale halve maan zal vouw in de richting van de ventrale middellijn om een ​​lineaire hart buis te vormen. De cellen van het tweede hart veld aanvank...

We beschrijven een protocol voor het volumetrisch afbeelden van met fluorescente eiwitten gelabelde cellen diep in intacte embryonale en postnatale harten. Door gebruik te maken van weefselklaringsmethoden in combinatie met gehele montagekleuring, kunnen enkele met fluorescente eiwitten gelabelde cellen in een embryonaal of postnataal hart duidelijk en nauwkeurig worden afgebeeld.

Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Het algemene doel van deze procedure is om cellen die zijn gelabeld met fluorescerende eiwitten volumetrisch in beeld te brengen diep in intacte harten, om genfuncties op enkelcelresolutie te bestuderen tijdens de cardiale ontwikkeling en in postnatale harten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de cardiale ontwikkeling, zoals de studie van genfuncties en het ondersteunen van beeldvorming op enkelcelresolutie tijdens de cardiale ontwikkeling en dierlijke artefacten. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat deze relatief eenvoudig, goedkoop en efficiënt is voor de specifieke temporele analyse van gen- en eiwitfuncties op enkelcelresolutie in een intact embryo of hart.Hoewel we dit systeem gebruiken om de hartontwikkeling bij muizen te bestuderen, kan het ook worden ingezet voor het bestuderen van andere orgaansystemen, zoals spieren, de hersenen en de longen, evenals in andere modelorganismen. Hier worden fluorescent proteïne-positieve embryo's van Tamoxifen-behandelde R-26 Cre-RET2 confetti-moeders gebruikt. Begin de kleuring door elk met paraformaldehyde gefixeerd embryo onder te dompelen in één milliliter 0,1% PBST in de wells van een 48-wells plaat.Incubeer gedurende twee uur op een plaatshaker bij kamertemperatuur om het weefsel te permeabiliseren. Vervang vervolgens de permeabilisatielosuning door 1 mL blokkeringsbuffer en incubeer, onder schudden, gedurende twee uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 °C. Bereid daarna voor elke well een verdunning van 1:100 van het endotheelcel-specifieke antilichaam, PECAM, in 0,3 mL blokkeringsbuffer en voeg dit toe aan de wells met de embryo's.Incubeer gedurende 48 uur onder schudding bij 4 °C. Was de embryo's na de incubatie vijf keer met PBST gedurende telkens 30 minuten om overtollig primair antilichaam uit het weefsel te verwijderen. Dompel de embryo's vervolgens onder in een Alexa Fluor 647 geit anti-vat secundair antilichaam-oplossing en incubeer deze onder schudding gedurende 48 uur bij 4 °C, terwijl ze beschermd worden tegen licht.48 uur later, na het voorafgaand uitwassen, worden de embryo's gefixeerd met 4% PFA gedurende één uur bij kamertemperatuur onder schudding. Na tweemaal vijf minuten wassen met PBS, worden de embryo's tien minuten geïncubeerd met DAPI-kernkleuring. Volg dit op met twee PBS-wasbeurten van vijf minuten elk en ga vervolgens over tot het helder maken van het weefsel.Het klaren van het weefsel is de meest kritische stap in dit protocol om het hart op resolutie van een enkele cel in beeld te brengen. Daarnaast is de keuze van de klaringsmethode, hetzij scale of CUBIC, zeer belangrijk om de fluorescentiesignalen in het intacte embryonale hart te behouden. Breng de gewassen, gekleurde embryo's over naar een scintillatieflesje omwikkeld met aluminiumfolie, dat één milliliter scale A2-oplossing bevat.Incubeer 48 uur bij 4 °C met af en toe voorzichtig schudden met de hand. Vervang na de incubatie met schaal A2 de oplossing in het flacon door 1 mL van schaal B4-oplossing en incubeer nogmaals 48 uur bij 4 °C met af en toe voorzichtig schudden. Incubeer de embryo's nogmaals 48 uur met 1 mL van schaal 70 bij 4 °C, opnieuw met af en toe voorzichtig schudden.Dompel ten slotte het schaal-geklaarde monster onder in één milliliter 90% glycerol en bewaar dit bij vier graden celsius tot aan de beeldvorming. Voor de beeldvorming wordt het monster overgebracht naar een glasbodem petri-schaal met een minimale hoeveelheid 90% glycerol en afgebeeld met een confocale microscoop die is uitgerust met twee-fotonencapaciteiten. Voor CUBIC-klaring wordt elk embryo gedurende 48 uur bij 37 graden celsius ondergedompeld in één milliliter CUBIC one, met af en toe voorzichtig schudden.Vervang na 48 uur de oplossing door hetzelfde volume verse CUBIC-reagens één en incubeer het monster nogmaals 48 uur, zoals voorheen. Was de met CUBIC één behandelde embryo's na de incubatie meerdere keren met PBS onder voorzichtig handmatig schudden om de overtollige CUBIC één-oplossing te verwijderen. Dompel de embryo's vervolgens gedurende 48 uur in CUBIC twee-oplossing bij 37 °C, met af en toe voorzichtig handmatig schudden.Als er vertraging optreedt voor de beeldvorming, worden de monsters sequentieel geïncubeerd in één milliliter 30%, 50% en 70% glycerol en PBS gedurende elk 30 minuten. Na het doorlopen van deze reeks worden ze overgebracht naar een 90% glyceroloplossing voor bewaring bij vier graden celsius. Wanneer ze gereed zijn, vindt de beeldvorming plaats in een petrischaal met glazen bodem met 90% glycerol, zoals voorheen.Deze video toont optische coupes van een met schaal behandeld E 8.75 hart, van het hartoppervlak tot het lumen. Geel markeert de PECAM-expressie en alle cardiomyocyten verschijnen groen. De diepte is 110.4 microns en er zijn in totaal 93 coupes.Dit is de 3D-oppervlakteafbeelding van het zojuist getoonde gereconstrueerde hart. Opnieuw geeft geel de PECAM-expressie aan, en groen labelt alle cardiomyocyten. Deze film toont secties van één enkele progenitor-kloon uit een met scale behandelde E 9.5 hart in de regio van het uitstroomtract.Geel markeert de PECAM-expressie en de kloon verschijnt groen. De diepte is 36 microns en er zijn in totaal 10 coupes. Deze film toont secties van een CUBIC-behandeld P twee hart van het oppervlak tot het lumen.De diepte is 130 microns met drie microns per sectie. Deze film toont secties van een met CUBIC behandelde E 17.5 hart van het oppervlak tot het lumen. De diepte is 630 microns met zes microns per sectie.Dit is een 3D-oppervlaktebeeld van het zojuist getoonde hart, gereconstrueerd via de 3D-reconstructiesoftware. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het embryo fragiel is en dat hartpathologie gemakkelijk kan worden verstoord. Na deze procedure kunnen andere eiwitten worden geanalyseerd door middel van kleuring om de genfunctie in een latere fase te bestuderen.

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Mutaties die leiden tot aangeboren hartafwijkingen profiteren van in vivo onderzoek van de hartstructuur tijdens de ontwikkeling, maar hoogwaardige structurele studies in het embryonale muishart zijn technisch uitdagend. Hier presenteren we een robuuste immunofluorescentie- en beeldanalysemethode om cardiomyocyt-specifieke structuren in het zich ontwikkelende muishart te beoordelen.

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

We presenteren een protocol voor de analyse van coronairvaten geheel muriene embryonale hart tot E15.5, met behulp van standaard immunologische werkwijzen kleuring gevolgd door optische klaring en confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van bloedvaten door het gehele hart zonder dat tijdrovende analyse van seriële secties.

Analyse van de coronaire vaten in Gewist Embryonale Hearts

Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

Hier beschrijven we een protocol voor hele mount immunofluorescentie en beeld-gebaseerde kwantitatieve volumetric analysis van vroege fase muis embryo's. Wij presenteren deze techniek als een krachtige aanpak van kwalitatief en kwantitatief cardiale structuren beoordelen tijdens de ontwikkeling, en voor te stellen dat het wellicht grote schaal aan te passen aan andere orgaansystemen.

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) techniek gecombineerd met optische clearing om te studeren het lymfkliertest hart.

Licht vel fluorescentie microscopie voor de studie van het lymfkliertest hart

Cardiomyocyte proliferatie na letsel is een dynamisch proces dat een symfonie van extracellulaire signalen van niet-myocyte celpopulaties vereist. Met behulp van afstamming strekken, passieve helderheid, en drie-dimensionale whole-mount confocale microscopie technieken, kunnen we analyseren de invloed van een verscheidenheid van celtypes op cardiale reparatie en regeneratie.

Het vastleggen van de cardiale letselrespons van gerichte celpopulaties via Cleared Heart Driedimensionale beeldvorming

We rapporteren een methode voor mesoscopische reconstructie van het hele muizenhart door nieuwe ontwikkelingen in weefseltransformatie en kleuring te combineren met de ontwikkeling van een axiaal gescande lichtplaatmicroscoop.

Mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart

We presenteren een gedetailleerd protocol voor het kweken en beeldvorming van muizenembryo's dat 3D + tijdbeeldvorming van cardiale voorlopercellen mogelijk maakt. Deze video-toolkit behandelt de belangrijkste vaardigheden die nodig zijn voor succesvolle live imaging die anders moeilijk te verkrijgen zijn uit tekstpublicaties.

Live beeldvorming van vroege cardiale voorlopers in het muizenembryo

Het protocol maakt gebruik van geavanceerde light-sheet microscopie samen met aangepaste methoden voor het opruimen van weefsel om ingewikkelde hartstructuren in knaagdierharten te onderzoeken, met een groot potentieel voor het begrijpen van cardiale morfogenese en remodellering.

Light-sheet beeldvorming om de hartstructuur in knaagdierharten te onthullen

Dit protocol introduceert een snelle methode voor kwantitatieve driedimensionale vasculaire beeldvorming op de hele berg met behulp van light-sheet fluorescentiemicroscopie. De werkzaamheid van de methode wordt aangetoond met behulp van het faryngeale boogslagadersysteem van het kuikenembryomodel, waarbij hemodynamische krachten worden gekwantificeerd via computationele vloeistofdynamica.

Snelle beeldvorming met hoge resolutie van de hele berg van het vaatstelsel van kleine dieren voor kwantitatieve studies

Leer een weefselophelderingsmethode voor volumetrische beeldvorming van fluorescent gelabelde cellen in intacte embryonale en postnatale harten. Deze techniek maakt gedetailleerde analyse van genfuncties mogelijk.

Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution

Meer video's verkennen