Meten In Vitro ATPase activiteit voor enzymatische Karakterisatie
23 augustus 2016
We beschrijven een basisprotocol voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd op basis van het activiteitsniveau en de vereisten voor een bepaalde gezuiverde ATPase.
Het algemene doel van deze procedure is om de in vitro ATPase-activiteit van gezuiverde eiwitten te kwantificeren voor functionele karakterisering. Deze methode kan worden gebruikt om nieuwe putatieve ATPase's te karakteriseren, effectieve potentiële activatoren of remmers te evalueren en om de bijdrage van bepaalde domeinen of residuen aan ATPase-activiteit te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige, gevoelige methode is voor het meten van in vitro ATPase-activiteit en gemakkelijk kan worden geoptimaliseerd.
Bereid voorraad van alle benodigde reagentia voor incubatie met gezuiverd eiwit zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng 100 millimolar magnesiumchloride en 100 millimolar ATP in een verhouding van één op één net voordat u de ATP-hydrolysereactie instelt. Bereid en label 1,5 milliliter buisjes voor het verzamelen van monsters op regelmatige intervallen gedurende de reactie.
Bereid buisjes voor om monsters te verzamelen op tijdstippen nul evenals op tijdstippen van 15, 30, 45 en 60 minuten. Voeg 245 microliter 1x HNG-buffer toe aan elke buis om de monsters die zijn verzameld uit de ATP-hydrolysereacties te verdunnen met een verdunning van één op 50. Bereid vervolgens een bad van droog ijs en ethanol voor om monsters snel te bevriezen en de reactie te stoppen.
Voeg in een rubberen ijsemmer of andere veilige container verschillende stukken droog ijs toe en giet voorzichtig genoeg 70% tot 100% ethanol om het droog ijs te bedekken. Verdun het gezuiverde eiwit in 1X HNG-buffer en bewaar het op ijs. Stel de ATP-hydrolysereacties in de voorbereide 0,5 milliliter buisjes in door een vooraf berekend volume water toe te voegen om een eindvolume van de reactie van 30 microliter te bereiken.
Geflankeerd door zes microliter 5X HNG of andere buffer, drie microliter 100 millimolar magnesiumchloride ATP-mengsel en 0,25 tot vijf micromolar eiwit. Incubeer een buffer alleen negatieve controleconditie waarin geen eiwit wordt toegevoegd. Vervolgens verwijdert u vijf microliter van de reactie op tijdstip nul.
Verdun vervolgens het aliquot één op 50 in het voorbereide 1,5 milliliter buisje dat 245 microliter HNG-buffer bevat. Vries het monster onmiddellijk in het droogijs-ethanolbad in. Incubeer reacties bij 37 graden Celsius om ATP-hydrolyse gedurende één uur te laten plaatsvinden.
Verwijder bij elk interval vijf microliter aliquots uit de reactie en voeg toe aan gelabelde monsterbuisjes die HNG-buffer bevatten zoals eerder. Aan het einde van de ATP-hydrolysereactie, verplaatst u verdunde monsters naar een vriezer van 80 graden Celsius voor opslag. Om ervoor te zorgen dat alle monsters volledig bevroren zijn, wacht u minimaal 10 minuten voordat u verdergaat.
Ontdooi de verdunde monsters die aliquots van de ATP-hydrolysereactie bevatten van elk tijdstip bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens een 96-wells plaat met monsters en fosfaatstandaarden. Verdun in een 0,5 milliliter buis de fosfaatstandaard van 800 micromolar naar 40 micromolar door 5,5 microliter van de standaard toe te voegen aan 104,5 microliter HNG-buffer.
Meng goed en voeg 100 microliter van deze 40 micromolar fosfaatstandaard toe aan put A1 van de 96-wells plaat. Voeg 50 microliter HNG-buffer toe aan putten B1 tot en met H1 voor een-op-een seriële verdunningen van de fosfaatstandaard. Verwijder 50 microliter 40 micromolar fosfaat van put A1, voeg het toe aan de 50 microliter van de testbuffer in put B1 en meng.
Vervolgens verwijdert u 50 microliter van put B1 en voegt u het toe aan put C1, en gaat u door met verdunning tot put G1. Gooi 50 microliter uit put G1 na het mengen om ervoor te zorgen dat elke put hetzelfde volume heeft. Put H1 zou alleen buffer moeten bevatten om een fosfaatstandaard van 40 tot nul micromolar te creëren. Voeg vervolgens 50 microliter van elk monster in duplicaat toe aan de plaat.
Voeg monsters van hetzelfde tijdstip verticaal in kolommen toe en van verschillende tijdstippen horizontaal. Dit maakt tot acht monsters en vijf tijdstippen per plaat mogelijk. Gebruik een steriele pipette om voldoende malachietgroen meliptaat fosfaat detectiereagens te verwijderen om 100 microliter toe te voegen aan elk van de putten met monsters en standaarden.
Voeg het detectiereagens toe aan een schaal voor gemakkelijk pipetteren met een multi-kanaals pipette. Giet het detectiereagens niet direct in de schaal omdat fosfaatbesmetting waarschijnlijk is. Voeg met behulp van een multi-kanaals pipette 100 microliter van het fosfaat detectiereagens toe aan elke put en meng voorzichtig door op en neer te pipetteren een consistent aantal keren zonder bellen te introduceren, werkend in volgorde van het laatste tijdstip naar het eerste tijdstip.
Laat de plaat 25 minuten op kamertemperatuur staan of volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Om de resultaten te kwantificeren, lees de absorptie van de monsters bij 650 nanometer met behulp van een absorptie micro plaatlezer. Representatieve resultaten van kinetische en endpoint ATPase's worden getoond, waarin de activiteit van wilde type en mutante vormen van de type twee secretie ATPase/EPSE wordt bepaald in aanwezigheid en afwezigheid van een stimulant cardiolipine.
Hier worden de resultaten van een kinetische cardiolipine-gestimulante ATPase getoond, die de lineaire fosfaatrelease over tijd aantoont voor wild type EPSE en een dubbele lysine mutant, waarbij bovijn serum albumine dient als een negatieve controle. Deze gegevens kunnen worden weergegeven als de hoeveelheid fosfaat die per minuut wordt vrijgegeven, gedeeld door de eiwitconcentratie om de ATPase-activiteit van elk eiwit te kwantificeren en te vergelijken. De gegevens geven aan dat twee lysine residuen, K417 en K419, bijdragen aan de cardiolipine-gestimulante ATPase-activiteit van EPSE.
Een vergelijking van de ATPase-activiteit van dezelfde eiwitten zonder cardiolipine-stimulatie toont aan dat deze twee lysine residuen niet bijdrag
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het kwantificeren van de in vitro ATPase-activiteit van gezuiverde eiwitten, die geoptimaliseerd kan worden voor specifieke vereisten. Het is ontworpen voor de functionele karakterisering van ATPases en hun potentiële activatoren of remmers.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biochemie
- Enzymkinetiek
- Proteïnekarakterisering
Achtergrond
- ATPases zijn cruciaal voor diverse cellulaire processen.
- Inzicht in hun activiteit kan bijdragen aan de ontwikkeling van geneesmiddelen.
- Karakterisering van ATPases helpt bij het identificeren van hun rollen in het metabolisme.
- Deze methode maakt de evaluatie van specifieke eiwitdomeinen mogelijk.
Doel van de studie
- Om de ATPase-activiteit in vitro te kwantificeren.
- Om nieuwe vermoedelijke ATPases te karakteriseren.
- Om potentiële activatoren of inhibitoren te evalueren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van reagensvoorraden voor incubatie.
- Mengen van magnesiumchloride en ATP vóór de reactie.
- Verzamelen van monsters met regelmatige tussenpozen tijdens de reactie.
- Gebruik van een gevoelige methode voor het meten van de ATPase-activiteit.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol biedt een betrouwbare meting van de ATPase-activiteit.
- Het kan eenvoudig worden geoptimaliseerd op basis van specifieke behoeften.
- Resultaten kunnen inzicht geven in de functionele rollen van ATPases.
- Karakterisering kan leiden tot inzichten in metabole routes.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het bestuderen van de ATPase-activiteit.
- Het maakt het mogelijk om de proteinfunctionaliteit te beoordelen.
- Optimalisaties kunnen de nauwkeurigheid van de resultaten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Kwantitatieve meting van de ATPase-activiteit maakt functionele karakterisering van gezuiverde eiwitten mogelijk, wat target-validatie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Deze assay biedt voorspellende zekerheid door specifieke residuen te koppelen aan enzymatische functies, wat helpt bij het mechanistisch verminderen van risico's. De aanpasbaarheid van de methode vergemakkelijkt de screening-gereidheid en translationele continuïteit voor ATPase-gerelateerde targets.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door ATPase-activiteit te koppelen aan specifieke proteinedomeinen of residuen.
- Operationele waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk via gevoelige, kwantitatieve detectie van fosfaatvrijgave.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door basale ATPase-activiteit te onderscheiden van gestimuleerde activiteit, wat bijdraagt aan de prioritering van targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening via gestandaardiseerde ATPase-activiteitsmetingen.
- Operationele waarde: Garandeert de reproduceerbaarheid van de assay door gedefinieerde bemonsteringsintervallen en colorimetrische fosfaatkwantificering.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform met aanpasbare kinetische of eindpuntformaten voor de evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt de karakterisering van ATPase in de ontdekkingsfase met preklinische validatie via consistente functionele metrieken.
- Risico-gecorrigeerde Beslissingen: Maakt beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van dosis-responsrelaties met stimulantia zoals cardiolipine.
- Mechanistische Risicoreductie: Verduidelijkt activatiemechanismen door onderscheid te maken tussen residuen die vereist zijn voor stimulatie versus basale activiteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
De ATPase-assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en levert functionele gegevens die worden gebruikt bij de screening en optimalisatie van verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door veranderingen in ATPase-activiteit te kwantificeren na domeinmutatie of blootstelling aan een inhibitor.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door middel van reproduceerbare, tijdsongeloopte fosfaatmetingen die geschikt zijn voor de evaluatie van compound-bibliotheken.
- Analytics: Genereert kwantitatieve readouts (fosfaat per minuut per proteïneconcentratie) die vergelijkingen tussen verschillende condities en de selectie van hits mogelijk maken.
- Translational Research: Slaat een brug naar preklinisch werk door ATPase-activiteit vast te stellen als een vertaalbare biomarker voor target engagement.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare methode voor verschillende ATPase-targets dankzij de aanpasbare buffer-, temperatuur- en bemonsteringsparameters.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in de doelfunctie, vermindering van mechanistische ambiguïteit en functionele inzichten op residuniveau.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en gevoeligheid van fosfaatdetectie voor een betrouwbare activiteitsmeting.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door duidelijke stimulatieprofielen, kapitaalefficiëntie en verminderd risico op falen van het doelwit in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van het ATPase-activatiepotentieel en stimulantafhankelijkheid.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in enzymkinetiek en eiwithandling voor een accurate reactie-opstelling en bemonstering.
- Afhankelijk van spectrophotometrische infrastructuur voor fosfaatdetectie bij 650 nm en temperatuurgecontroleerde incubatie.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor de bereiding van reagentia, in het bijzonder voor het mengen van magnesium-ATP en protocollen voor monsterverdunning.
- Vereist overwegingen voor aanpassingen bij niet-bacteriële ATPases, waaronder buffercompatibiliteit en optimale temperatuurbereiken.
- Praktische beperkingen omvatten het risico op fosfaatcontaminatie, waardoor wegwerpmaterialen en ultrapuur water noodzakelijk zijn, zoals vermeld in de bron.
