Name: Meten In Vitro ATPase activiteit voor enzymatische Karakterisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Leer hoe u in vitro ATPase-activiteit van gezuiverde eiwitten kwantitatief meet voor functionele karakterisering. Deze methode helpt onderzoekers bij het evalueren van activatoren en inhibitoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de financiering erkennen van een National Institutes of Health-subsidie RO1AI049294 (aan M. S.).

1. Voer ATP hydrolysereactie met Purified Protein <ol><li> Bereid voorraden alle benodigde reagentia voor incubatie met gezuiverde eiwit. <ol><li> Bereid 5x HEPES / NaCl / glycerol (HNG) buffer die 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl en 5% glycerol (of ander testbuffer gebruik). </li><li> Bereid 100 mM MgCl 2 (of ander metaal, indien ATPase metaal-afhankelijk) in water. </li><li> Bereid verse 100 mM ATP in 200 mM Tris Base (denk pH niet verder aan te passen) met behulp van hoge zuiverheid ATP. Aliquot en opslaan van de ATP-voorraad bij -20 ° C niet langer dan een paar weken, als ATP af zal breken na verloop van tijd, en zich te onthouden van invriezen en ontdooien van de ATP-voorraad. </li><li> Premix MgCl2 en ATP in een 1: 1 verhouding net voordat de ATP hydrolysereactie. </li></ol></li><li> Bereiden en labelen 1,5 ml buisjes voor het nemen van monsters op regelmatige tijdstippen gedurende de reactie. Bereid buisjes om monsters te verzamelen op tijd 0 en op het moment 15, 30,45 en 60 min. Opmerking: Als alternatief verzamelen monsters slechts op tijdstip 0 en het eindpunt. <ol><li> Voeg 245 ul 1x HNG buffer aan elke buis om monsters van het ATP hydrolyse reacties 1:50 verdunnen. </li></ol></li><li> Bereid een bad van droogijs en ethanol voor snel invriezen monsters om de reactie te stoppen. In een rubberen ijsemmer of andere veilige (niet-plastic) container, voeg verschillende stukken van droog ijs en giet genoeg 70-100% ethanol om het droogijs te dekken. </li><li> Verdun gezuiverde eiwit in 1x HNG buffer, voor zover van toepassing (gewoonlijk 5-10 uM), en blijf op ijs. </li><li> Stel de ATP hydrolyse reacties. <ol><li> In afzonderlijke buizen van 0,5 ml voor elk monster, de volgende reagentia (in volgorde): H2O (tot een eindvolume van 30 pl), 6 pl 5x HNG of andere buffer, 3 pl 100 mM MgCl 2 -ATP mengsel, en 0,25-5 uM eiwit. </li><li> Onder meer een buffer-enige negatieve controle conditie waarin geen eiwit wordt toegevoegd.</li></ol></li><li> Verwijderen 5 ul van het reactiemengsel op tijdstip 0, 1:50 verdunnen in de bereide 1,5 ml buis die 245 gl HNG buffer en onmiddellijk bevriezen van het monster in droogijs / ethanol bad. </li><li> Incubeer reacties bij 37 ° C om ATP hydrolyse optreedt gedurende 1 uur. Bij elk interval (15, 30, 45 en 60 min), 5 ul aliquots verwijderd uit het reactiemengsel en voeg aan gemerkt monsterbuizen met HNG buffer in stap 1,6. </li><li> Aan het eind van de hydrolysereactie ATP, verdunde monsters verplaatsen naar een -80 ° C vriezer voor opslag. Om ervoor te zorgen alle monsters zijn volledig bevroren, wacht minstens 10 minuten voordat u verder gaat. </li></ol> 2. Incubate monsters die Gratis Pi met Detection Reagent <ol><li> Dooi verdunde monsters met ATP hydrolysereactie porties op elk tijdstip (verkregen van stap 1,6 en 1,7) bij kamertemperatuur. </li><li> Het opzetten van een 96-well plaat met monsters en fosfaat standaarden. <ol><li> In een 0,5 ml tute verdunnen standaard fosfaat (Pi voorzien detectiereagens) van 800 uM tot 40 uM door toevoeging van 5,5 pi van 800 pM standaard 104,5 gl HNG buffer. Meng goed en voeg 100 ul van deze 40 pM Pi standaard goed A1 van een 96-wells plaat. </li><li> Voeg 50 ul HNG buffer aan putjes B1-H1 voor 1: 1 seriële verdunningen van de Pi-standaard. </li><li> Verwijder 50 pi 40 pM Pi uit goed A1 en voeg aan 50 pl assaybuffer in zowel B1, mixen en verwijdert 50 gl uit goed B1 en voeg goed C1, aanhoudende verdunningen met zowel G1. Gooi 50 gl van zowel G1 na menging te verzekeren elk putje heeft hetzelfde volume. Goed H1 mogen alleen buffer tot een norm vast Pi 40-0 uM bevatten. OPMERKING: Indien een aanvullende factor (bijvoorbeeld remmer) werd aan de monsters toegevoegd, maakt een standaardcurve die deze factor te controleren veranderingen in fosfaat afgifte of absorptie onder die omstandigheden. </li><li> Voeg 50 ul van elk sample in tweevoud op de plaat. samples toe te voegen uit dezelfde tijd punt in de kolommen verticaal (monster 1 keer 0 = A2, A3; sample 2 keer 0 = B2, B3) en verschillende tijdstippen horizontaal. Dit maakt maximaal 8 samples en 5 tijdstippen per plaat. </li></ol></li><li> Een steriele pipet voldoende malachietgroen / molybdaat Pi detectiereagens verwijderen om 100 ul toe aan elk van de putjes die monsters en standaarden (reagens vereist (ml) = 0,1 x aantal monsters en standaarden) en aan een schotel voor eenvoudige pipetteren met behulp van een multichannel pipet. Niet direct giet de detectie reagens in de schaal, als Pi besmetting dreigt te ontstaan. </li><li> Met een multichannel pipet, voeg 100 ul van de pi detectiereagens aan elk putje en meng door voorzichtig pipetteren en neer een consistent aantal keren zonder dat er luchtbellen, bij voorkeur in volgorde van de laatste tijdstippen aan de eerste tijdstippen. </li><li> Incubeer de plaat gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur, of volgens de mabrikant&#39;s richtingen. </li></ol> 3. Resultaten kwantificeren met behulp van een Microplate Reader <ol><li> Lees de absorptie van de monsters bij 650 nm onder toepassing van een absorptie microplaat reader. </li><li> Maak een Pi standaard curve. Met behulp van een grafische software, grafiek de absorptiewaarden voor de Pi standaardmonsters tegen de concentratie om een ​​gebruikte vergelijking op te lossen voor de hoeveelheid fosfaat in elk monster te vinden. </li><li> Bereken de ATPase-activiteit voor elk monster door ijken met fosfaat standaard. Fosfaat vrijgegeven = (OD 650 - Y as) / helling. <ol><li> Het gemiddelde van de totale Pi van duplicaten van elk monster. Trek de buffer-only control&#39;s absorptie het lezen van dit nummer. Vermenigvuldig dit met de verdunningsfactor (50 in ons voorbeeld). </li><li> Bepaal de nmol Pi vrijgegeven per umol eiwit. Grafische deze waarden voor elk tijdpunt in een kinetische proef moet lineaire fits van ten minste R = 0,99 (figuur 1) werd verkregen; als not, kan de test worden aangepast met min of meer eiwitten of kortere of langere incubatietijd. </li></ol></li><li> Vertegenwoordigen de resultaten als nmol Pi / umol proteïne / min (figuren 2, 3), of als nmol Pi / ug eiwit / min indien gewenst. </li></ol>

<ol><li>Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%2B+proteins%3A+have+engine%2C+will+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AAA+ proteins: have engine, will work.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).</li>
<li>Baker, T. A., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP%2C+an+ATP-powered+unfolding+and+protein-degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).</li>
<li>Maxson, M. E., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vacuolar-type+H%2B-ATPase+at+a+glance+-+more+than+a+proton+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump.</a> J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).</li>
<li>Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+genes+for+secretion+NTPases%3A+Identification+of+the+widespread+tadA+subfamily+and+development+of+a+diagnostic+key+for+gene+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).</li>
<li>Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Extracellular+Protein+Secretion+NTPase+EpsE+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae.</a> J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).</li>
<li>Camberg, J. L., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+Vibrio+cholerae+type+II+secretion+ATPase+EpsE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE.</a> J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).</li>
<li>Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+secretion+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Type II secretion and pathogenesis.</a> Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%2C+Real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+An+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation.</a> J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+kinetic+analysis+of+the+intracellular+domain+of+human+protein+tyrosine+phosphatase+%CE%B2+%28HPTP+%CE%B2%29+using+synthetic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides.</a> Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).</li>
<li>Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+stimulation+of+EpsE+ATP+hydrolysis+by+EpsL+and+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids.</a> EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).</li>
<li>McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+weak+ATPase+activity+of+human+Hsp90+by+a+client+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein.</a> J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).</li>
<li>Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XpsE+oligomerization+triggered+by+ATP+binding%2C+not+hydrolysis%2C+leads+to+its+association+with+XpsL%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL.</a> EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).</li>
<li>Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+flagellar+ATPase+motor+shows+ATP-dependent+hexameric+assembly+and+activity+stimulation+by+specific+lipid+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding.</a> Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Savvides, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirB11+ATPases+are+dynamic+hexameric+assemblies%3A+new+insights+into+bacterial+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion.</a> EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).</li>
<li>Sanghera, J., Li, R., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+luminescent+ADP-Glo+assay+to+a+standard+radiometric+assay+for+measurement+of+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Techn%22%5BJournal%5D)">Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity.</a> Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).</li>
<li>Sherman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+catalytic+activity+from+biological+function+of+the+ATPase+that+powers+lipopolysaccharide+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cofactor+regulation+with+disease-associated+p97%2FVCP+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).</li>
<li>Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit is een algemeen protocol voor het meten van ATPase-activiteit in vitro van gezuiverde eiwitten voor biochemische karakterisatie. Deze werkwijze is eenvoudig geoptimaliseerd; bijvoorbeeld het aanpassen van de hoeveelheid proteïne, buffer en zout samenstellingen, temperatuur, en het variëren van de lengte en assay intervallen (inclusief de bevordering totaal aantal intervallen) kan activiteit kwantificering verbeteren. In de handel verkrijgbare malachietgroen-gebaseerde reagentia zijn zeer gevoelig en kunnen ...

ATPases zijn integrale enzymen in veel processen in alle levenskoninkrijken. ATPasen fungeren als moleculaire motoren die de energie van ATP-hydrolyse gebruiken om diverse reacties aan te drijven, zoals eiwittransport, ontvouwen en assemblage; replicatie en transcriptie; cellulaire stofwisseling; spierbeweging; celbeweeglijkheid; en ionenpompwerking1-3. Sommige ATPasen zijn transmembraaneiwitten die betrokken zijn bij het transporteren van opgeloste stoffen door membranen, andere zijn cytoplasmatisch en kunnen geassocieerd zijn met een biologisch membraan zoals het plasmamembraan of die van organellen.
AAA+ ATPasen (ATPasen geassocieerd met verschillende cellulaire activiteiten) vormen een grote groep ATPasen die enige sequentie- en structurele conservering delen. Deze eiwitten bevatten geconserveerde nucleotide-bindingsmotieven zoals Walker-A en -B boxen en vormen oligomeren (meestal hexameren) in hun actieve toestand1. Grote conformationele veranderingen in deze eiwitten bij nucleotidebinding zijn gekarakteriseerd bij verschillende leden van de AAA+ familie. EpsE is een AAA+ ATPase en lid van de bacteriële Type II/IV secretie-subfamilie van NTPasen4-6. EpsE drijft Type II Secretie (T2S) aan in Vibrio cholerae, de veroorzaker van cholera. Het T2S-systeem is verantwoordelijk voor de secretie van een grote verscheidenheid aan eiwitten, zoals de virulentiefactor choleratoxine die overvloedige waterige diarree veroorzaakt wanneer V. cholerae de menselijke dunne darm koloniseert7.
Technieken voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit zijn gevarieerd, maar meten gewoonlijk fosfaatrelease met behulp van colorimetrische, fluorescente of radioactieve substraten8-11. We beschrijven een basismethode voor het bepalen van in vitro ATPase-activiteit van gezuiverde eiwitten met behulp van een colorimetrische test op basis van een commercieel verkrijgbaar malachietgroen bevattend substraat dat het vrijkomende anorganische fosfaat (Pi) meet. Bij lage pH vormt malachietgroenmolybdaat een complex met Pi en de mate van complexvorming kan worden gemeten bij 650 nm. Deze eenvoudige en gevoelige test kan worden gebruikt om nieuwe ATPasen functioneel te karakteriseren en om de rollen van mogelijke activatoren of remmers te evalueren, om de belangrijkheid van domeinen en/of specifieke residuen te bepalen, of om het effect van bepaalde behandelingen op enzymatische activiteit te beoordelen.

<table><tbody><tr><td>HEPES buffer</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosinetrifosfaat (ATP)</td><td>Fisher</td><td>BP41325</td><td></td></tr><tr><td>96-wells platen (helder, platte bodem)</td><td>VWR</td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>BIOMOL Green</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-AK111</td><td>Voorkeursfosfaat detectie reagens. Let op: irriterend.</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td></td><td></td><td>BioTek Synergy of vergelijkbaar</td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

meten<em&gt; in vitro</em&gt; atpase activiteit voor enzymatische karakterisatie

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine-trifosfaat hydrolyserende enzymen, of ATPasen, spelen een cruciale rol in een breed scala van cellulaire functies. Deze dynamische eiwitten kunnen energie op te wekken voor het mechanisch werk, zoals eiwitten mensenhandel en degradatie, transport van opgeloste stoffen, en cellulaire bewegingen. De hier beschreven protocol is een eenvoudige test voor het meten van de in vitro activiteit van gezuiverde ATPasen voor functionele karakterisatie. Eiwitten hydrolyseren ATP in een reactie die resulteert in anorganisch fosfaat afgifte en de hoeveelheid fosfaat vrijgemaakt wordt vervolgens gekwantificeerd onder toepassing van een colorimetrische assay. Deze zeer flexibele protocol kan worden aangepast om ATPase-activiteit te meten in kinetische of eindpunt assays. Een representatief protocol is hier voorzien gebaseerd op de activiteit en vereisten van Epse, de AAA + ATPase betrokken type II Uitscheiding in de bacterie Vibrio cholerae. De hoeveelheid gezuiverde eiwit nodig te meten, lengte van de test en het tijdstip en het aantal sampling intervallen, buffer en zoutsamenstelling, temperatuur, co-factoren, stimulerende middelen (indien aanwezig), etc. kunnen afwijken van de hier beschreven en aldus sommige optimalisering nodig zijn. Dit protocol voorziet in een basiskader voor het karakteriseren ATPasen en kan snel worden uitgevoerd en gemakkelijk als nodig aangepast.

De in vitro activiteit van de T2S ATPase épse kan worden gestimuleerd door copurification van Epse met het cytoplasmatische domein van EPSL (EPSE-cytoEpsL) en toevoeging van de zure fosfolipide cardiolipine 12. Het is ook mogelijk om de rol van specifieke resten in Epse ATP hydrolyse bepalen door de activiteit van wildtype (WT) voor variante vormen van het eiwit het gebruik van deze assay. Hier wordt het effect van het substitueren twee lysineresten in de EPSE-zink-bi...

We beschrijven een basisprotocol voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd op basis van het activiteitsniveau en de vereisten voor een bepaalde gezuiverde ATPase.

Meten<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase activiteit voor enzymatische Karakterisatie

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van de in vitro ATPase-activiteit van gezuiverde eiwitten voor functionele karakterisering. Deze methode kan worden gebruikt om nieuwe vermeende ATPases te karakteriseren, potentiële effectieve activatoren of inhibitoren te evalueren en om de bijdrage van specifieke domeinen of residuen aan de ATPase-activiteit te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige, gevoelige methode is voor het meten van de in vitro ATPase-activiteit en gemakkelijk kan worden geoptimaliseerd.Bereid stocks van alle benodigde reagentia voor incubatie met het gezuiverde eiwit voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng 100 millimol magnesiumchloride en 100 millimol ATP in een verhouding van één op één vlak voordat de ATP-hydrolyse-reactie wordt opgezet. Bereid 1,5 milliliter buisjes voor en label deze voor het verzamelen van monsters met regelmatige intervallen gedurende de reactie.Bereid buisjes voor om monsters te verzamelen op tijdstip nul en op tijdstippen van 15, 30, 45 en 60 minuten. Voeg 245 µL 1x HNG-buffer toe aan elk buisje om de monsters die uit de ATP-hydrolysereacties zijn verzameld te verdunnen met een verdunningsfactor van 1:50. Bereid vervolgens een bad van droogijs en ethanol voor om de monsters snel te bevriezen en zo de reactie te stoppen.Voeg in een rubberen ijsemmer of een andere veilige houder enkele stukken droogijs toe en giet voorzichtig voldoende 70% tot 100% ethanol om het droogijs te bedekken. Verdun het gezuiverde eiwit in 1X HNG-buffer en bewaar dit op ijs. Stel de ATP-hydrolysereacties op in de voorbereide 0,5 milliliter buisjes door een vooraf berekend volume water toe te voegen om een eindreactievolume van 30 microliters te bereiken.Voeg vervolgens zes µL 5X HNG of een andere buffer toe, drie µL van een mengsel van 100 mM magnesiumchloride en ATP, en 0,25 tot vijf µM proteïne. Incubeer een negatieve controleconditie met alleen buffer waarin geen proteïne is toegevoegd. Neem vervolgens op tijdstip nul vijf µL uit de reactie.Verdun vervolgens het aliquot 1:50 in de voorbereide buis van 1,5 milliliter die 245 microliters HNG-buffer bevat. Vries het monster onmiddellijk in in het bad van droogijs en ethanol. Incubeer de reacties gedurende één uur bij 37 graden Celsius om ATP-hydrolyse mogelijk te maken.Verwijder bij elk interval aliquots van vijf µL uit de reactie en voeg deze toe aan gelabelde monsterbuisjes met HNG-buffer, zoals eerder beschreven. Verplaats de verdunde monsters aan het einde van de ATP-hydrolysereactie naar een vriezer van 80 °C voor opslag. Wacht ten minste 10 minuten voordat u verdergaat om er zeker van te zijn dat alle monsters volledig bevroren zijn.Ontdooi de verdunde monsters met ATP-hydrolyse-reactie-aliquots van elk tijdstip bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens een 96-wells plaat voor met monsters en fosfaatstandaarden. Verdun in een 0,5 milliliter buis de fosfaatstandaard van 800 micromolar naar 40 micromolar door 5,5 microliters van de standaard toe te voegen aan 104,5 microliters HNG-buffer.Meng goed en voeg 100 µL van deze 40 µM fosfaatstandaard toe aan well A1 van de 96-well plaat. Voeg 50 µL HNG-buffer toe aan wells B1 tot en met H1 voor seriële verdunningen van de fosfaatstandaard in een verhouding van één op één. Verwijder 50 µL van de 40 µM fosfaat uit well A1, voeg dit toe aan de 50 µL assaybuffer in well B1 en meng.Verwijder vervolgens 50 µL uit well B1 en voeg dit toe aan well C1, en zet de verdunningen voort tot en met well G1. Verwijder na het mengen 50 µL uit well G1 om ervoor te zorgen dat elke well hetzelfde volume bevat. Well H1 moet alleen buffer bevatten om een fosfaatstandaard van 40 tot nul µM te creëren. Voeg vervolgens van elk monster 50 µL in dubbeltoets toe aan de plaat.Voeg monsters van hetzelfde tijdstip verticaal in kolommen en monsters van verschillende tijdstippen horizontaal toe. Dit maakt tot acht monsters en vijf tijdstippen per plaat mogelijk. Gebruik een steriele pipette om voldoende malachietgroen meliptaatfosfaat-detectiereagens te verwijderen om 100 microliters aan elke put met monsters en standaarden toe te voegen.Voeg het detectiereagens toe aan een schaal voor eenvoudig pipetteren met een multichannelpipet. Giet het detectiereagens niet rechtstreeks in de schaal, omdat de kans op fosfaatcontaminatie groot is. Voeg met een multichannelpipet 100 µL van het fosfaatdetectiereagens toe aan elke put en meng dit voorzichtig door een consistent aantal keer op en neer te pipetteren zonder luchtbellen te introduceren, waarbij wordt gewerkt in volgorde van het laatste tijdspunt naar het eerste tijdspunt.Laat de plaat 25 minuten op kamertemperatuur staan of volgens de instructies van de fabrikant. Om de resultaten te kwantificeren, wordt de absorbentie van de monsters bij 650 nanometer gemeten met een microplaatlezer voor absorbentie. Representatieve resultaten van kinetische en eindpunt-ATPases worden getoond, waarin de activiteit van wild-type en mutante vormen van de type twee secretie ATPase/EPSE wordt bepaald in aanwezigheid en afwezigheid van het stimulerende cardiolipine.Hier worden de resultaten van een kinetische door cardiolipine gestimuleerde ATPase getoond, waarin de lineaire fosfaatvrijgave over de tijd wordt aangetoond voor wild-type EPSE en een dubbele lysine-mutant, waarbij bovine serumalbumine dient als negatieve controle. Deze gegevens kunnen worden weergegeven als de hoeveelheid vrijgekomen fosfaat per minuut gedeeld door de proteïneconcentratie om de ATPase-activiteit van elke proteïne te kwantificeren en te vergelijken. De gegevens geven aan dat twee lysineresten, K417 en K419, bijdragen aan de door cardiolipine gestimuleerde ATPase-activiteit van EPSE.Een vergelijking van de ATPase-activiteit van dezelfde eiwitten zonder cardiolipine-stimulatie laat zien dat deze twee lysine-residuen niet bijdragen aan de lage basale activiteit van EPSE, maar juist aan het vermogen van het eiwit om door cardiolipine te worden gestimuleerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de ATPase-activiteit van gezuiverde eiwitten snel en nauwkeurig kunt kwantificeren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de gevoeligheid van het fosfaatdetectiereagens.Om fosfaatcontaminatie te voorkomen, raden wij het gebruik van wegwerpplastics en ultrapuur water aan, en het uitvoeren van grootte-uitsluitings- of ionenuitwisselingschromatografie na de eiwitzuivering.

measuring-in-vitro-atpase-activity-for-enzymatic-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode voor de bepaling van acetaat kinase activiteit is beschreven. Deze test maakt gebruik van een directe reactie voor het bepalen van enzymactiviteit en de kinetiek van acetaat kinase in de acetaat-vormende richting met verschillende fosforyl acceptoren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor het testen van andere acetyl fosfaat of acetyl-CoA gebruik te maken van enzymen.

Directe detectie van de acetaat-vormende activiteit van het enzym acetaat Kinase

De effecten van activering van eiwit kinase C (PKC) isozymen op mitochondriële functies geassocieerd met ademhaling en oxidatieve fosforylering en cellevensvatbaarheid beschreven. De aanpak past adenovirale techniek om selectief PKC overexpressie isozymen in primaire celkweek en verschillende assays voor mitochondriële functies en energie status van de cel te bepalen.

Beoordeling van Mitochondriale functies en levensvatbaarheid van de cellen in de nier overexpressie Proteïne kinase C-isozymen

This video demonstrates a thin-layer chromatography-based enzyme assay to determine pyrophosphokinase activity using radiolabeled nucleotides. The method provides insights into nucleotide synthesis and phosphotransfer reactions.

Thin Layer Chromatography Based Enzyme Activity Assay: A Technique to Determine In Vitro Pyrophosphokinase Activity Using Thin Layer Chromatography

This video demonstrates the in vitro measurement of enzyme activity for α-galactosidase A and acid α-glucosidase in samples using synthetic 4-Methylumbelliferyl substrates.

In Vitro Measurement of &alpha;-Galactosidase A and Acid &alpha;-Glucosidase Enzyme Activity

We beschrijven een methode om de activiteit van K+-countertransporterende P-type ATPasen te kwantificeren door heterologe expressie van de enzymen in Xenopus oöcyten en het meten van Rb+ of Li+ opname in individuele cellen door middel van atomaire absorptie spectrofotometrie. De methode is een gevoelige en veilige alternatief voor radio-isotoop flux experimenten waardoor complexe kinetische studies worden vergemakkelijkt.

Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays

Hier beschrijven we biochemische analyses die kunnen worden gebruikt om ATP-afhankelijke chromatine-hermodelleringsenzymen te karakteriseren op hun vermogen om 1) ATP-afhankelijk nucleosoomglijden te katalyseren, 2) te interageren met nucleosoomsubstraten en 3) ATP te hydrolyseren op een nucleosoom- of DNA-afhankelijke manier.

Biochemische assays voor het analyseren van activiteiten van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling Enzymen

Het huidige rapport beschrijft een in vitro enzymatische test om fosfatidylethaanolaminmethyltransferase-activiteit te meten met behulp van Leishmania-celextracten. Deze test is gebaseerd op de overdracht van een radioactieve methylgroep van S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine naar endogeen fosfatidylethaanolamine.

In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

Proteïne kinasen zijn hoog geëvolueerde signaal enzymen en steigers die kritisch zijn voor inter- en intracellulaire signaaltransductie. Wij presenteren een protocol voor het meten van kinase-activiteit door middel van radioactief gemerkte adenosintrifosfaat ([γ-32P] ATP), een betrouwbare methode om te helpen bij het ophelderen van cellulaire signalering regulering.

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Er is een vraag om preklinische testen voor een nieuwe klasse van "Wees" drugs genoemd farmacologische chaperones reproduceerbaar, snel en efficiënt. Voor patiënten die in aanmerking komen, alsmede nieuwe farmacologische chaperone drugs ontwikkelden we een eenvoudige, sterk gestandaardiseerde en veelzijdig cel cultuur gebaseerde bepaling naar het scherm.

In Vitro Enzym meting aan Test farmacologische Chaperone responsiviteit in Fabry en de ziekte van Pompe

Hier beschrijven we een methode voor de zuivering van histidine-gelabelde pyrophosphokinase enzymen en met behulp van Dunnelaagchromatografie van radioactief gelabelde substraten en producten voor de enzymatische activiteit in vitroassay. De enzym activiteit bepaling geldt in grote lijnen aan kinase, nucleotide cyclase, of fosfor-overdracht reactie waarvan mechanisme nucleotide trifosfaat hydrolyse omvat.

Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

Leer hoe u in vitro ATPase-activiteit van gezuiverde eiwitten kwantitatief meet voor functionele karakterisering. Deze methode helpt onderzoekers bij het evalueren van activatoren en inhibitoren.

Meten

Meer video's verkennen