Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes
August 7th, 2016
Er wordt een methode beschreven waarbij quantum dot (QD) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor correlatieve immunocytochemische studies van in epoxy ingebed weefsel van menselijke pathologie. We gebruiken commerciële antilichaamfragment-geconjugeerde QD's die worden gevisualiseerd door breedveldfluorescentielichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie.
Het algemene doel van deze methode is om correlatieve licht- en elektronenmicroscopie, of CLEM-gegevens, te verkrijgen door fluorescentie-immunocytochemische informatie te combineren met ultrastructurele morfologie van transmissie-elektronenmicroscopie in een enkele afbeelding. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunocytochemie en pathologie, zoals met welke subcellulaire structuur een bepaald eiwit van belang geassocieerd is. Het grote voordeel van deze techniek is dat dezelfde quantum dot-nanodeeltjessonde wordt gebruikt om zowel het levende microscoop-signaal van het doeleiwit als de structurele lokalisatie van de elektronenmicroscopie te verkrijgen.
Na het fixeren, inbedden en snijden van humaan somatostatinoom-tumorweefsel volgens het tekstprotocol, bereid een sectie-adhesie-oplossing voor door 20 centimeter helder plakband in een fles van vijf milliliter te plaatsen die 2,0 milliliter aceton bevat en laat het 10 minuten staan. Verwijder het plakband en dompel een nikkelrooster in de oplossing, verwijder vervolgens het rooster en laat het aan de lucht drogen. Eenmaal droog, gebruik de doffe kant van het rooster om een ultradunne sectie op te pakken.
Het is van cruciaal belang om de juiste tsijtijd vast te stellen voor de gekozen harsformulering. 30 minuten werkt goed voor deze formulering, maar deze moet mogelijk opnieuw worden berekend voor hardere of zachtere formuleringen. Bereid een milliliter verse verzadigde natriummetaperiodaat-tsij-oplossing in gedistilleerd water en plaats druppels van de oplossing op een schone laboratoriumfilmoppervlakte.
Plaats volledig droge roosters met secties op de druppels en incubeer 30 minuten op kamertemperatuur. Breng vervolgens de roosters over naar druppels gedistilleerd water gedurende 60 seconden om ze af te wassen. Om antilichaam en quantum dot, of QD-labeling, uit te voeren op een schone laboratoriumfilmoppervlakte, pipet druppels van 0,05 molair glyceen en PBS.
Plaats de roosters op de druppels en incubeer gedurende 10 minuten om resterend aldehyde op de secties te blokkeren. Om het aldehydeblok te verwijderen, dep kort de rand van het rooster. Plaats vervolgens het rooster op een druppel van een procent normaal geitenserum, of NGS, en een procent BSAC in PBS gedurende 10 minuten.
Bereid een milliliter blokkeringsoplossing voor door 10 microliter NGS en 100 microliter BSAC toe te voegen aan 890 microliter PBS. Condisioneer vervolgens de secties door ze 10 minuten op een druppel antilichaamverdunner te plaatsen. Gebruik vervolgens antilichaamverdunner om anti-somatostatine polyklonaal antilichaam een op tien te verdunnen en plaats de roosters op druppels van de oplossing.
Incubeer in een vochtige kamer bij kamertemperatuur gedurende een uur. Na de incubatie verwijdert u het antilichaamreagens door de rand van het rooster af te deppen. Gebruik vervolgens antilichaamverdunner om de secties twee keer vijf minuten lang af te wassen.
Na het verdunnen van secundair antilichaam een op tien en het voorbereiden van druppels, incubeer de roosters op de druppels bij kamertemperatuur gedurende een uur. Verwijder vervolgens de antilichaammo oplossing en was de secties twee keer. Verdun streptavidine-geconjugeerd QD's een op tien en incubeer de monsters op druppels van de oplossing in het donker, bij kamertemperatuur gedurende een uur.
Gebruik vervolgens antilichaamverdunner om de roosters twee keer te wassen, elke keer gedurende vijf minuten, en dep de rand van de roosters af. Was vervolgens de roosters gedurende twee minuten in gedistilleerd water voordat u de randen droog dept. Plaats de geïmmunogekleurde roostersectie in een druppel water op een glasplaat en gebruik een glasdekje om deze te bedekken.
Om fluoresceringslichtmicroscopie uit te voeren, plaats een filterkubus met de volgende kenmerken en gebruik 365 nanometer LED-verlichting. Plaats de geïmmunogekleurde sectie op het immunofluorescencemicroscoop-podium. Gebruik lichtmicroscopie om het labelpatroon, het niveau van eventuele niet-specifieke labelingen en om vast te stellen dat negatieve controles duidelijk zijn, te evalueren.
Identificeer vervolgens ROI's in relatie tot rasterstaven. Stel vervolgens een volledig gekleurde digitale camera in op FL auto-kleur en stel de witbalans in op 3.200 K.Stel de camera in op automatische belichtingsmodus met een gamma-instelling tussen 0,45 en 1,00 om het uiterlijk van de afbeeldingen te optimaliseren, en stel de analoge versterking in op een X. Klik in de ZEN Two Light software grafische interface op het camerapictogram om live te gaan. Richt vervolgens op het beeld en klik op Snap in de ZEN Two Light software grafische interface om het beeld naar de framestore te vangen.
Sla de afbeeldingen op als tf-bestanden om compressie en pixelatie te voorkomen. Bereid een afdruk voor die de positie van de ROI in relatie tot de rasterstaven of andere belangrijke weefsellandmerken toont. Verwijder vervolgens het rooster van de plaat, was in gedistilleerd water en dep de randen voorzichtig droog.
Om transmissie-elektronenmicroscopie uit te voeren, brengt u het rooster over naar de microscoop voor onderzoek met een versnellingsspanning van 100 kilovolt. Begin met een lage vergroting van ongeveer 1.400X om rond het rooster te navigeren en de ROI's te vinden die met lichtmicroscopie zijn gevonden. Observeer individuele QD's bij een vergroting van 70.000X of hoger.
Ze zullen verschijnen als onregelmatige kristallijne structuren met matige elektronendichtheid. Klik vervolgens in de grafische interface van de beeldvormingssoftware van de digitale camera met een monochrome sensor van 1.392 bij 1.040 pixels op het camerapictogram om het aan te zetten en afbeeldingen te verwerven. Verplaats het camerapictogram naar de uit-stand om het beeld in de framestore op te slaan.
Om CLEM-beeldvorming uit te voeren, gebruikt u een afdruk van de lichtmicroscoop-beeldvorming om overeenkomstige ROI's door TEM te lokaliseren. Weefselarchitectuurkenmerken zijn nuttig voor navigatie rond de sectie. Vang een afbeelding van de overeenkomstige ROI
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het gebruik van quantum dot (QD) nanodeeltjes in correlatieve immunocytochemische studies van menselijk pathologieweefsel. De techniek combineert fluorescentie lichtmicroscopie met transmissie-elektronenmicroscopie om gedetailleerde inzichten in eiwitlokalisatie te bieden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunocytochemie
- Pathologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) is essentieel voor het begrijpen van eiwitlokalisatie.
- Quantum dots bieden een uniek voordeel bij het visualiseren van eiwitten in live microscopie.
- Deze methode beantwoordt belangrijke vragen in immunocytochemie.
- Het combineren van structurele en functionele beeldvorming verbetert de gegevensinterpretatie.
Doel van het onderzoek
- Om CLEM-gegevens te verkrijgen van menselijk somatostatinoom tumorweefsel.
- Om eiwitlokalisatie en bijbehorende subcellulaire structuren te visualiseren.
- Om een enkele nanodeeltje sonde te gebruiken voor zowel fluorescentie- als elektronenmicroscopie.
Gebruikte methoden
- Inbedding en snedemaken van menselijk tumorweefsel.
- Bereiding van een kleefoplossing met transparant plakband en aceton.
- Toepassing van quantum dot geconjugeerde antilichamen voor visualisatie.
- Gebruik van breedveld fluorescentie lichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van eiwitlokalisatie in tumorweefsel.
- Demonstratie van de effectiviteit van quantum dot nanodeeltjes.
- Integratie van fluorescentie- en elektronenmicroscopie gegevens.
- Verbeterd begrip van eiwitassociaties met subcellulaire structuren.
Conclusies
- De methode biedt een krachtig hulpmiddel voor immunocytochemische studies.
- Quantum dots maken gelijktijdige beeldvorming van structuur en functie mogelijk.
- Deze aanpak kan onderzoek in pathologie en aanverwante gebieden bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Correlative light and electron microscopy (CLEM) using quantum dot nanoparticles enables precise mapping of protein localization within human pathology tissue, bridging the gap between molecular detection and ultrastructural context. This dual-modality approach enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at critical discovery inflection points. Integrating fluorescence and electron microscopy data supports robust portfolio decisions by clarifying subcellular associations of therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein localization within disease-relevant human tissue sections.
- Supports mechanistic de-risking by correlating immunolabeling with ultrastructural features.
- Improves predictive confidence in target validation through high-resolution spatial mapping.
- Facilitates triage of targets based on subcellular distribution and context.
Screening & Assay Development
- Provides validated biological readouts for downstream assay development workflows.
- Ensures reproducibility and standardization by using the same quantum dot probe across modalities.
- Enables quantitative assessment of labeling specificity and background prior to high-content screening.
- Supports reliable evaluation of antibody and probe performance in complex tissue matrices.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular detection with ultrastructural pathology for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by leveraging archival human tissue.
- Reduces biological risk in preclinical models by confirming target localization in relevant tissue architecture.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on integrated molecular and morphological data.
Pipeline & Workflow Integration
This CLEM method positions itself at the intersection of discovery biology, assay development, and translational research, enabling seamless data integration from early validation to preclinical studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by mapping protein localization at the ultrastructural level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and probe validation.
- Analytics: Provides high-resolution measurements and overlays for direct comparison of molecular and structural data.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by confirming biomarker localization in human pathology samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging workflow adaptable to diverse targets and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in both fluorescence and electron microscopy techniques.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and digital analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of labeling and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different resin formulations or tissue types.
- Careful handling and safety precautions are essential due to hazardous reagents like osmium tetroxide.
