Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

Het algemene doel van deze methode is om correlatieve licht- en elektronenmicroscopie, of CLEM-gegevens, te verkrijgen door fluorescentie-immunocytochemische informatie te combineren met ultrastructurele morfologie van transmissie-elektronenmicroscopie in één enkel beeld. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de immunocytochemie en pathologie, zoals met welke subcellulaire structuur een specifiek eiwit van belang geassocieerd is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat dezelfde quantum dot-nanodeeltjesprobe wordt gebruikt om zowel het live microscopiesignaal van het doeleiwit als de structurele lokalisatie via elektronenmicroscopie te verkrijgen.

Nadat het menselijke somatostatinoomtumorgeweefsel is gefixeerd, ingebed en gesneden volgens het tekstprotocol, bereidt u een sectie-adhesieoplossing door 20 centimeter transparante plakband in een flesje van vijf milliliter met 2,0 milliliter aceton te plaatsen en dit 10 minuten te laten staan. Verwijder de plakband en dip een nikkelgrid in de oplossing, verwijder vervolgens het grid en laat het aan de lucht drogen. Gebruik, zodra het droog is, de stompe zijde van het grid om een ultradunne sectie op te pakken.

Het is essentieel om de juiste etstijd voor de gekozen harsformulering vast te stellen. 30 minuten werkt goed voor deze formulering, maar dit moet mogelijk opnieuw worden berekend voor hardere of zachtere formuleringen. Bereid één milliliter verse verzadigde natriummetaperiodaat-etsoplossing voor in gedistilleerd water en breng druppels van de oplossing aan op een schoon laboratoriumfilm-oppervlak.

Plaats volledig droge grids met coupes op de druppels en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Breng de grids vervolgens gedurende 60 seconden over naar druppels gedestilleerd water om ze af te spoelen. Om antilichaam- en quantum dot- (QD-)labeling uit te voeren op een schoon labfilm-oppervlak, pipetteer dan druppels van 0,05 molar glycine en PBS.

Plaats de roosters op de druppels en laat deze 10 minuten incuberen om residueel aldehyde op de secties te blokkeren. Om de aldehydeblokkade te verwijderen, wordt de rand van het rooster kortstondig drooggedept. Plaats het rooster vervolgens gedurende 10 minuten op een druppel van 1% normaal geiten serum, of NGS, en 1% BSAC in PBS.

Bereid één milliliter blokkeringsoplossing door 10 µL NGS en 100 µL BSAC toe te voegen aan 890 µL PBS. Conditioneer vervolgens de coupes door deze gedurende 10 minuten op een druppel antilichaamverdunner te plaatsen. Verdun daarna het anti-somatostatine polyklonale antilichaam 1 op 10 met antilichaamverdunner en plaats de grids op druppels van deze oplossing.

Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Verwijder na de incubatie het antilichaamreagens door de rand van het raster droog te depen. Was de coupes vervolgens twee keer gedurende vijf minuten met antilichaamverdunning.

Nadat het secundaire antilichaam 1 op 10 is verdund en de druppels zijn voorbereid, worden de roosters één uur bij kamertemperatuur op de druppels geïncubeerd. Verwijder vervolgens de antilichaamoplossing en was de secties twee keer. Verdun streptavidine-geconjugeerde QD's 1 op 10 en incubeer de monsters op druppels van de oplossing in het donker, bij kamertemperatuur, gedurende één uur.

Was de roosters vervolgens twee keer met antilichaamverdunner, telkens gedurende vijf minuten, en dep de randen van de roosters droog. Was de roosters daarna gedurende twee minuten in gedestilleerd water voordat u de randen droogdept. Plaats het immuunkleuringsgedeelte van het rooster in een waterdruppel op een glazen objectglas en dek dit af met een glazen dekglas.

Voor het uitvoeren van fluorescentielichtmicroscopie plaatst u een filterkubus met de volgende kenmerken en gebruikt u 365 nanometer LED-verlichting. Plaats het immuungekleurde coupes op de tafel van de immunofluorescentiemicroscoop. Gebruik lichtmicroscopie om het labelingspatroon en het niveau van eventuele aspecifieke labeling te evalueren en om vast te stellen dat de negatieve controles schoon zijn.

Identificeer vervolgens de ROI's ten opzichte van de rasterstaven. Stel daarna een volledig gekleurde digitale camera in op FL auto-kleur en stel de witbalans in op 3.200 K. Zet de camera in de automatische belichtingsmodus met een gamma-instelling tussen 0,45 en 1,00 om het uiterlijk van de beelden te optimaliseren, en stel de analoge versterking (gain) in op 1X. Klik op het camera-icoon in de grafische interface van de ZEN Two Light-software voor een live-weergave. Stel vervolgens het beeld scherp en klik op Snap in de grafische interface van de ZEN Two Light-software om het beeld op te slaan in de frame-store.

Sla de afbeeldingen op als tf-bestanden om compressie en pixelvorming te voorkomen. Maak een afdruk die de positie van de ROI weergeeft ten opzichte van de rasterbalken of andere significante weefselkenmerken. Verwijder vervolgens het raster van de slide, was dit in gedestilleerd water en dep de randen voorzichtig droog.

Voor het uitvoeren van transmissie-elektronenmicroscopie wordt het raster overgebracht naar de microscoop voor onderzoek met een versnellingsspanning van 100 kilovolt. Begin bij een lage vergroting van ongeveer 1.400X om over het raster te navigeren en de ROI's te vinden die met lichtmicroscopie zijn vastgesteld. Observeer individuele QD's bij een vergroting van 70.000X of hoger.

Deze zullen verschijnen als onregelmatige kristallijne structuren met een matige elektronendichtheid. Klik vervolgens in de grafische interface van de beeldgevingssoftware, met een digitale camera met een monochrome sensor van 1.392 bij 1.040 pixels, op het camera-icoon om deze in te schakelen en beelden vast te leggen. Verplaats het camera-icoon naar de uit-positie om het beeld in de frameopslag op te slaan.

Gebruik voor de uitvoering van CLEM-imaging een afdruk van de lichtmicroscopische beelden om de overeenkomstige ROI's via TEM te lokaliseren. Weefselarchitectonische kenmerken zijn nuttig voor de navigatie binnen de sectie. Leg een beeld vast van de overeenkomstige ROI via TEM.

Bereid vervolgens een CLEM-afbeelding voor door te controleren of de TEM-afbeelding correct is georiënteerd en is vergroot naar dezelfde grootte en resolutie als de lichtmicroscopische afbeelding, in dit geval 300 pixels per inch. Vergroot het canvas van de lichtmicroscopische afbeelding tot het dubbele van de oorspronkelijke grootte. Kopieer vervolgens de TEM-afbeelding en plak deze naast de fluorescentieafbeelding.

Om een fluorescentie-overlay te maken in Photoshop CS2, klikt u op de rechthoekige selectietool, selecteert u de fluorescentieafbeelding en maakt u hiervan een gedupliceerde laag. Stel de mengopties van de laagstijl in op 30 tot 40% transparantie. Klik vervolgens op de verplaatsingstool en sleep de fluorescentie-overlaylaag over de overeenkomstige TEM-afbeelding en lijn de afbeeldingen uit.

Nadat de afbeeldingen zijn uitgelijnd, wordt de afbeelding platgeslagen om de uiteindelijke overlay te verkrijgen. Gebruik vervolgens het rechthoekige selectiekader om de nieuwe overlay-afbeelding te selecteren en kopieer deze naar een nieuw canvas. Sla de afbeelding tot slot op als een tf-bestand.

In deze fluorescentiemicroscopie-afbeelding bevatten individuele somatostatinoomtumorcellen overvloedige secretoire korrels en waren ze positief gelabeld voor het somatostatine-hormoon. De kernen verschenen als donkere gaten en bij lage vergroting was variabel intense granulaire oranje QD-fluorescentie zichtbaar in het cytoplasma. De met lichtmicroscopie gekozen ROI werd herkend en vastgelegd met TEM door te refereren aan een lichtmicroscopie-afbeelding met 20X vergroting, zoals hier aangegeven.

Bij een hogere vergroting vertoont de cel heldere fluorescentie en intense QD-labeling in cytoplasmatische korrels. Het over elkaar leggen van fluorescentiegegevens op TEM-beelden, zoals in dit voorbeeld, suggereert dat sterke positieve labeling overeenkomt met korrels die matig elektronendicht materiaal bevatten binnen het begrenzend membraan van de vesikel. Ten slotte, zoals hier bij een hogere vergroting te zien is, vertoonden de matig elektronendichte korrels intense QD-nanokristal-immunolabeling.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in acht uur worden uitgevoerd als dit correct gebeurt. Tijdens het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om te onthouden dat de grids voorzichtig moeten worden gehanteerd, uitsluitend bij de randen. Het aanraken van de sectie tijdens het oppakken van het grid kan ertoe leiden dat de sectie loslaat van het grid.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals multiplex immunolabeling, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of uw eiwit van belang co-lokaliseert met een ander eiwit. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de pathologie om eiwitlokalisatie te onderzoeken in gearchiveerd menselijk weefsel dat is bewerkt voor elektronenmicroscopie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u immunocytochemische informatie uit fluorescentielichtmicroscopie kunt combineren met ultrastructuur uit transmissie-elektronenmicroscopie.

Vergeet niet dat het werken met osmiumtetroxide extreem gevaarlijk kan zijn; tijdens deze procedure moeten voorzorgsmaatregelen worden getroffen, zoals het dragen van beschermende uitrusting, het werken in een zuurkast en een correcte afvoer van het afval.