Name: Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Leer CLEM met quantum dot nanodeeltjes voor immunocytochemisch onderzoek van humane tumortweefsel. Deze methode combineert fluorescentie lichtmicroscopie met transmissie-elektronenmicroscopie voor gedetailleerde eiwitlokalisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen de steun van Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratorium) en de afdeling Anatomische Pathologie, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australië, erkennen.

1. Tissue Dissection en Fixation <ol><li> tissue Dissection <ol><li> Ontleden weefsel stukken uit een chirurgisch weggesneden tumor specimen of weefsel biopsie. Opmerking: Het weefsel toegepast bij dit onderzoek werd routinematig gefixeerd in formaline maar vers weefsel ook geschikt. Wij selecteerden een gebied bevestigd en gemeld door een anatomische patholoog somatostatinoma tumor bevatten na routinematige histologische kleuring en anti-somatostatine immunokleuring (niet getoond). </li><li> Gebruik weefsel stukken niet groter dan ongeveer 1,0 mm 3. </li></ol></li><li> Bereiding cacodylaatbuffer <ol><li> Bereid een voorraad bufferoplossing (1 M) door toevoeging van 21,4 g natriumcacodylaat (zie Materialen List) en 3,0 ml 1% calciumchloride oplossing 90 ml gedestilleerd water en bijvullen oplossing tot een eindvolume van 100 ml. Roer de oplossing en laat het een nacht staan, zodat de kristallijne reagens volledig oplost. </li><li&gt; Bereid een werkoplossing bufferoplossing door toevoeging van 20 ml van de oplossing 170 ml water en daarna controleren van de pH met indicatorpapier. Breng de pH op 7,4 door toevoegen van 3-4 druppels van 3% HCl. Vul de oplossing tot een eindvolume van 200 ml met uiteindelijke molariteit van 0,1 M. </li></ol></li><li> Fixatief bereiding en toepassing <ol><li> Voeg een 10 ml ampul 50% glutaaraldehyde oplossing 20 ml natriumcacodylaat voorraadoplossing (1 M). Vul met gedestilleerd water tot 190 ml. Controleer de pH en stel de 7,4 door toevoeging van 1-4 druppels van 3% zoutzuur (HCl) indien nodig. </li><li> Vul met gedestilleerd water tot een uiteindelijk volume van 200 ml te maken. </li><li> Dompel het weefsel in fixeermiddel met 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaat pH 7,4 gedurende 24 uur bij 4 ° C in een glazen monsterbuis. Gooi ongebruikte fixerende na 1 week. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Processing and Embedding <ol><li> osmium TetroXide kleuring <ol><li> Na fixatie voltooid, dompelen het weefsel in natriumcacodylaatbuffer buffer (0,1 M) gedurende 20 min herhaal nog eens 20 min. </li><li> Bereid een 2% waterig osmiumtetroxide (OsO 4) werkoplossing door toevoeging van 8,0 ml van een 5% OsO 4 stockoplossing aan 2,0 ml natrium cacodylaatbuffer voorraadoplossing (1 M) en 10,0 ml gedestilleerd water tot een eindvolume te maken 20,0 ml. </li><li> Verwijder de buffer dompel het weefsel in 2% OsO 4 bij pH 7,4 gedurende 4 uur bij kamertemperatuur geroerd. LET OP! Wees voorzichtig bij het ​​overgieten en het voorbereiden van OsO 4 oplossingen, draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en werken in een zuurkast te allen tijde. </li></ol></li><li> Uranylacetaat kleuring <ol><li> Na weefsel osmication is voltooid, verwijdert de OsO 4-oplossing en dompel weefsel in 2% natriumacetaat gedurende 10 min. Verwijder 2% natriumacetaat vervolgens ondergedompeld in 2% uranylacetaat gedurende 1 uur bijkamertemperatuur. </li></ol></li><li> uitdroging <ol><li> Dehydrateer weefsel door graded alcoholen. Gebruik 50% ethanol gedurende 10 minuten, 70% ethanol gedurende 10 min, 95% ethanol gedurende 10 minuten en twee veranderingen van 100% ethanol gedurende 20 min elk bij kamertemperatuur. </li><li> Voer twee veranderingen van 100% aceton gedurende 30 minuten elk. </li></ol></li><li> Harsimpregnatie en uitharden <ol><li> Meng met lage viscositeit epoxy hars in een wegwerp polyethyleen beker. Voeg 10,0 g vinylcyclohexeen dioxide (ERL 4221) epoxymonomeer, 6 g diglycidylether van polypropyleenglycol (DER 732) en 26,0 g nonenyl barnsteenzuuranhydride (NSA). Roer goed met de hand met houten stokken gedurende 2 minuten. </li><li> Voeg vijftien druppels 2-dimethylaminoethanol (DMAE) epoxy gaspedaal en roer opnieuw gedurende 2 minuten. Zorg ervoor dat de ERL, DER en NSA componenten volledig te mengen voor het toevoegen van de DMAE gaspedaal. </li><li> Start hars impregneren van het weefsel door vervanging van 100% aceton 1: 1 harsaceton gedurende 1 uur, daarna vervangen door 6: 1 hars aceton gedurende 3 uur, en ten slotte 100% hars &#39;s nachts. </li><li> Breng de weefsel in verse hars in 8 mm micromoulds. Cure op 70 o C &#39;s nachts. Hars dient hard, maar niet bros na harden. </li></ol></li></ol> 3. ultramicrotomie <ol><li> Mes, snijden Parameters en coupedikte <ol><li> Plaats een semithin diamantmes in ultramicrotoom en gesneden coupes van het weefsel met een dikte van 500 nm. </li><li> Float secties op het waterbad achter de snede. Pak de secties op een glasplaatje en droog ze naar beneden voor 10 tot 20 seconden met behulp van een kookplaat bij ongeveer 110 o C. </li><li> Ets de secties met natriumethoxide oplossing voor 20 sec en dan afwassen met 100% ethanol vervolgens gedestilleerd water. Vlek met 2% methyleenblauw in 1% borax gedurende 20 seconden op de kookplaat, spoelen met stromend water gedurende 5 seconden en droog op de kookplaat gedurende 5 sec. dan stain met 1,5% elementaire fuchsine op de kookplaat voor 5 sec en droog op de kookplaat gedurende 20 sec. </li><li> Onderzoek door helder-veld lichtmicroscopie en bevestigen dat tumorcellen en een gebied van belang (ROI) aanwezig in de sectie. </li><li> Wijzig de semithin diamantmes een ultradunne diamantmes en stel de juiste meshoek en snijsnelheid zoals aanbevolen door de fabrikant mes. </li><li> Snijd ultradunne secties op 90 nm dik. Houd rekening met de gouden kleur van de delen als drijvend op het water bad. </li><li> Strek en plat de secties door wuivende chloroform damp van een 1 cm 2 stuk filterpapier binnen een paar millimeter van de secties. Zorg ervoor dat u de chloroform gedrenkt papier in contact komen met het water mee te nemen. </li></ol></li><li> Ultradunne Section Grid Montage <ol><li> Til de ultradunne secties van het wateroppervlak met behulp van een 300-mesh thin-bar nikkel TEM raster dat is ondergedompeld in paragraaf Zelfklevendee oplossing. Zoek de secties aan de saaie kant van het rooster. De roosters hebben een doffe of matte oppervlak aan één kant en een gepolijst of glanzend oppervlak aan de andere kant. Nr dragerfilm vereist. Opmerking: Het is noodzakelijk deze netten anti-magnetische tang omgaan met netten vasthouden aan de tang voorkomen. </li><li> Bereid de sectie lijm door het plaatsen van 20 cm van duidelijke plakband in een 5 ml flacon met 2,0 ml aceton. Cap en schud het flesje, laat staan ​​voor 10 min en verwijder de band verlaten van de lijm oplossing. </li></ol></li></ol> 4. immunokleuring <ol><li> antigen ontmaskeren <ol><li> Bereid 1 ml verse verzadigde natriummetaperjodaat etsoplossing in gedestilleerd water en gebruik het onmiddellijk. Plaats druppeltjes van de etsoplossing op een schoon oppervlak labfilm. </li><li> Plaats droog netten secties beneden druppeltjes van natriummetaperjodaat oplossing bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Breng de roosters aan gedestilleerd water DroPlets voor 60 sec wasgoed. </li></ol></li><li> Antilichaam incubatie en QD Probe Labeling <ol><li> Voer alle incubaties en etikettering op druppeltjes van de oplossing geplaatst op een schone Parafilm oppervlak. </li><li> Plaats het rooster op een druppel van 0,05 M glycine in PBS gedurende 10 min om resterend aldehyde in het onderdeel blokkeert. Verwijder het aldehyde blok door kort deppen de rand van het rooster. </li><li> Plaats het rooster op een druppel 1% normaal geit serum (NGS) en 1% BSAC (10%) in PBS gedurende 10 min. Bereid de blokkerende oplossing door toevoeging van 10 pl en 100 pl NGS BSAC tot 890 pl PBS tot een eindvolume van 1000 pi geven. </li><li> Conditioneer de secties door het plaatsen van een druppel antilichaam verdunningsmiddel voor 10 min. </li><li> Voer de immunokleuring incubatie onder toepassing van anti-somatostatine polyklonaal antilichaam verdund 1:10 met antilichaam oplosmiddel, tot een concentratie van 3,47 g / l. Opmerking: Antibody incubatie gebeurt door roosters druppeltjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur temperature in een vochtige kamer. </li><li> Verwijderen antilichaamreagens uit stap 4.2.5 blotting door de rand van het rooster daarna wassen secties in verdunningsmiddel voor 2 x 5 min. </li><li> Incubeer in secundair antilichaam (gebiotinyleerd geiten anti-konijn polyklonaal) verdund 1:10 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing. Wassen in verdunningsmiddel voor 2 x 5 min. </li><li> Incubeer in streptavidine geconjugeerd QD (585 nm) verdund 1:10 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Dek af met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te verminderen tijdens de incubatie. </li><li> Was grids in zoet gedestilleerd water gedurende 2 minuten. Dep de randen van het rooster droog. </li></ol></li></ol> 5. Fluorescentie lichtmicroscopie <ol><li> Lichtbron en Filter Cubes <ol><li> Gebruik 365 nm licht-emitterende diode (LED) verlichting voor wide-field fluorescentie lichtmicroscopie. Plaats een filter kubus met de volgende kenmerken: (Ex G 365 nm, BS FT 395 en EM LP 420 nm). Let op: Dit filter kubus wziek toestaan ​​dat de emissie spectra van alle QDs maten tegelijkertijd onder dezelfde golflengte excitatie worden gevisualiseerd. </li></ol></li><li> Bekijken en Imaging Secties <ol><li> Plaats het immunologisch raster gedeelte neer op een glasplaatje in een druppel water en dek af met een glazen afdekplaat slip (dikte nummer 1.5). Gebruik lichte microscopie de etikettering patroon, het niveau van een niet-specifieke labeling te evalueren en om vast te stellen dat de negatieve controles zijn duidelijk voor de etikettering. </li><li> Identificeer ROI met betrekking tot rooster bars. Finder rasters nuttig voor het vaststellen van coördinaten van doelstructuren zijn. </li><li> Acquire beelden van positieve etikettering op de sectie met behulp van een full colour digitale camera met de camera instelling op &quot;FL auto kleur&quot; en &quot;White Balance&quot; vastgesteld op 3,200K. Gebruik de camera in &quot;Automatische belichting&quot; mode met een instelling &quot;Gamma&quot; tussen de 0,45 en 1,00 om het uiterlijk van de beelden en &quot;Analog Gain&quot; ingesteld op 1x optimaliseren.Klik op het camera-icoontje in de Zen 2 Lite software grafische interface om &quot;Live&quot;, de focus van de afbeelding en klik op &#39;Snap &quot;om het beeld vast te leggen aan de Framestore. </li><li> Bewaar afbeeldingen als tif-bestanden om te voorkomen dat compressie en pixelation steeds duidelijker. </li><li> Bereid een afdruk die de positie van de ROI ten opzichte van de roosterstaven of andere belangrijke oriëntatiepunten weefsel. Deze drukken zullen bij latere navigatie van de sectie en opnieuw vinden ROI door transmissie- elektronenmicroscopie (TEM) zijn. </li><li> Verwijder het rooster van de glijbaan, wassen in gedestilleerd water en voorzichtig dep de randen droog. Opmerking: Gebruik geen overdreven intense verlichting fluorescentie beelden te verwerven. De fotostabiliteit van QDs maakt beeldvorming tijden van tot een paar seconden, maar zorg niet om de blootstelling te verlengen als het doven van de QD signaal kan optreden na ongeveer 1 minuut in water. Verlengde of permanente fotostabiliteit wordt alleen verkregen wanneer QD gelabelde secties gedehydrateerd met tolueen eningebouwd onder dekglaasjes volgens specificaties van de fabrikant. Echter, dit proces dan uitsluiten dat correlatieve onderzoek van dezelfde sectie met TEM. </li></ol></li></ol> 6. Transmission Electron Microscopy <ol><li> TEM-instelling en de Viewing <ol><li> Breng het rooster om de TEM voor onderzoek met een versnellingsspanning van 100 kV. Gebruik lage vergroting van ongeveer 1,400X om te navigeren rond het net en vind ROI die correleren met de opvattingen lichtmicroscoop. Uitzicht op clusters van QDs bij vergrotingen rond 50,000X. </li><li> Observeer individuele QDs bij 70,000X vergroting of hoger. Let op de QDs als onregelmatig kristallijne structuren met een matige elektronendichtheid. </li></ol></li><li> Imaging <ol><li> Gebruik een digitale camera voor TEM beeldvorming. Een zwart-wit 1392 x 1040 pixel sensor is voldoende. </li><li> Acquire beelden door te klikken op het pictogram &quot;Camera&quot; op &quot;Aan&quot; in het MICRoscope grafische interface van de imaging software, vervolgens op &quot;Uit&quot; om het beeld op te slaan in de Framestore. Let op: deze operaties zullen verschillen, afhankelijk van de microscoop systeem wordt gebruikt. Gebruik de camera in de automatische belichting met een instelling &quot;Gamma&quot; van 1,00. </li><li> Bewaar afbeeldingen als .tif-bestanden. </li></ol></li></ol> 7. CLEM Imaging <ol><li> Lokaliseren van een Fluorescence ROI door TEM <ol><li> Gebruik een afdruk imago van de lichtmicroscoop uit overeenkomstige ROI door TEM te lokaliseren. Weefsel architectonische kenmerken, zoals bloedvaten en luminale structuren zijn nuttig voor navigatie rond de sectie met behulp van TEM. </li><li> Maak een foto van de overeenkomstige ROI door TEM. </li></ol></li><li> CLEM Beeldoverlay <ol><li> Controleer beeld TEM juiste oriëntatie licht microscopie en corrigeer de uitbreiding van elke zodat dezelfde structuur gezien in elke modaliteit even groot. </li><li> Oriënterenaten het licht microscopie en TEM beelden en geeft ze side-by-side of als overlays op de ultrastructurele kenmerken van immunolabeled ROI te markeren. </li><li> Maak een overlay-beeld met behulp van Photoshop CS2. Ten eerste, vergroot beeld van de fluorescentie om dezelfde vergroting een laag vermogen TEM als. Oriënteren beide afbeeldingen en plak ze naast elkaar op een canvas. </li><li> Plat de afbeelding. </li><li> Maak de fluorescentie overlay van deze afbeelding composiet. Klik op de &quot;Rectangular Marquee Tool&quot;, selecteert imago van de fluorescentie en maak een dubbele laag van. </li><li> Pas de &quot;Layer Style / Blending options&quot; naar 30-40% transparantie. </li><li> Klik op de &quot;Move Tool&quot; en sleep de fluorescentie overlay-laag op de bijbehorende TEM voorbij. Lijn de beelden. </li><li> Na het bereiken van de uitlijning, &quot;afvlakken&quot; de lagen om het uiteindelijke overlay te produceren. </li><li> Gebruik de &quot;Rectangular Marquee Tool&quot; om nieuw beeld overlay een te selecterennd kopiëren naar een nieuw doek. Opslaan als .tiff-bestand. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+correlative+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Introduction to correlative light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. , (2012).</li>
<li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopy%3A+ultrastructure+lights+up%21%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li>
<li>Faas, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+fluorescently+labeled+structures+in+frozen-hydrated+samples+using+integrated+light+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy.</a> J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).</li>
<li>Redemann, S., Müller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopy+for+the+analysis+of+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division.</a> J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).</li>
<li>Spiegelhalter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+dynamic+live+cell+imaging+to+3D+ultrastructure%3A+novel+integrated+methods+for+high+pressure+freezing+and+correlative+light-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy.</a> PLoS One. 5 (2), e9014(2010).</li>
<li>Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+immunocytochemical+localization+of+somatostatin+in+somatostatinoma+by+widefield+epifluorescence%2C+super-resolution+light%2C+and+immunoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).</li>
<li>Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+quantum+dots+as+probes+for+correlative+fluorescence%2C+conventional%2C+and+energy-filtered+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).</li>
<li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots.</a> Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).</li>
<li>Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+EM+of+non-heavy+metal+stained+biosamples%3A+Large-field+of+view%2C+high+contrast+and+highly+efficient+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling.</a> Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).</li>
<li>Barroso, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantum dots in cell biology.</a> J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+for+live+cells%2C+in+vivo+imaging%2C+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 5, 538-544 (2005).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms.</a> PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).</li>
<li>Thomas, J. M., Midgley, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+transmission+electron+microscopy%3A+the+ultimate+nanoanalytical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique.</a> Chem Commun. , 1253-1267 (2004).</li>
<li>Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy.</a> Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).</li>
<li>Marc, R. E., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+GABAergic+amacrine+cell+circuitries+in+the+retina%3A+nested+feedback%2C+concatenated+inhibition%2C+and+axosomatic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses.</a> J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).</li>
<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples%3A+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li>
<li>Loussert Fonta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+acute+brain+slices+by+electron+microscopy%3A+a+correlative+light-electron+microscopy+workflow+based+on+Tokuyasu+cryo-sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning.</a> J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Deze studie heeft de potentiële bruikbaarheid van QD universele probes voor CLEM studies aangetoond. De 585 nm QD nanodeeltjes gebruikt toonde lichte en stabiele fluorescentie wanneer bekeken door groothoek licht microscopie en waren direct waargenomen door TEM. Een eerdere studie van een van de onderhavige auteurs aangetoond QD ook geschikt voor superresolutie lichtmicroscopie 7 zijn. Hun fotostabiliteit was vooral handig voor langere periodes bekijken en lange imaging belichtingen. QD kan ook worden gebruik...

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) is een krachtige benadering voor de analyse van transiënte dynamische gebeurtenissen 1, zeldzame gebeurtenissen 2, 3 en complexe systemen 4. Er zijn veel verschillende technische permutaties beschikbaar 5 afhankelijk van de vraag gesteld echter een gebruikelijke voorwaarde is dat dezelfde structuur in een enkel monster 6 wordt afgebeeld door meerdere modaliteiten microscopie. De specifieke benadering Clem ontwikkeld voor de studie van archivistische humane pathologie weefsel en het geval gebruikt is goed gekarakteriseerd en eerder gepubliceerd 7. Het doel was enerzijds het analytische gegevens maximaliseren van een biopsie of chirurgische monster en ten tweede fluorescentie lichtmicroscopie gebruikt om duidelijk de context van de immunocytochemische markeringspatroon zien op het ultrastructurele niveau. Quantum dot nanokristallen (QD&#39;s) bieden het potentieel van een universele marker systeem ABLe worden bekeken door zowel fluorescentie lichtmicroscopie en elektronenmicroscopie 8, 9, 10. De kristallijne kernstructuur maakt QD van verschillende maten om uiteenlopende fluorescentie-emissie pieken genereren wanneer geëxciteerd door licht met golflengte ver van hun emissiespectra 11. Hun atoomgewicht volstaat de elektronendichtheid die detecteerbaar is door transmissie elektronenmicroscopie scanning transmissie elektronenmicroscopie (STEM) of veldemissie scanning elektronenmicroscopie verkregen. Ze zijn bijzonder geschikt voor immunocytochemische studies zelfs één QD worden waargenomen die een ultieme gevoeligheid van een QD per 12 doelmolecule. Bovendien lopen de QD gebruikt kunnen individuele elementaire handtekening geschikt voor kartering bezitten. Human pathologie monsters bieden aanzienlijke voordelen voor translationeel biomedisch onderzoek. Chirurgische weefsel en biopsie monsters worden routinematig ingediend voor biobanking en met appropriate ethiek afstanden kunnen worden benaderd voor onderzoek studies. Menselijk weefsel niet kwesties van belang of de interpretatie die zich kunnen voordoen in het dier of in vitro modellen van de ziekte te hebben. Echter, prepareren pathologie monsters vaak niet optimaal. Er kunnen vertraging weefsel in fixeermiddel geplaatst, ongepaste fixatief zoals formaline plaats glutaaraldehyde TEM en ongepaste bemonstering. CLEM werkwijzen hebben het potentieel om de diagnostische en prognostische informatie van één menselijk monster optimaliseren. Sommige nieuw ontwikkelde correlatieve benaderingen zoals gebruik mini Singlet zuurstofgenerator (miniSOG) zijn niet beschikbaar voor gebruik in de pathologie vanwege de noodzaak voor de tag genetisch te coderen in de cel plaats 13. Daarom hebben we het nut van QD etikettering van routinematig bereid TEM correlatieve weefsel voor immunocytochemische studies onderzocht. QDs aangebracht op geëtste epoxy of acrylhars secties van liVerpakking goed aldehyde vaste biopsie en weefselmonsters bieden de mogelijkheid van het verkrijgen van correlatieve fluorescentie licht microscopie en TEM gegevens van een enkel monster.

<table><tbody><tr><td>Sodium cacodylate</td><td>Proscitech</td><td>C0205</td><td>Schadelijk chemisch product</td></tr><tr><td>Osmium tetroxide</td><td>Proscitech</td><td>C010</td><td>Alleen gebruiken in afzuigkap</td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>Univar-Ajax</td><td>569</td><td>Gevaarlijk chemisch product</td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Fronine</td><td>JJ008</td><td></td></tr><tr><td>Acetone 100%</td><td>Fronine</td><td>JJ006</td><td></td></tr><tr><td>ERL 4221</td><td>Proscitech</td><td>C056</td><td></td></tr><tr><td>DER 732</td><td>Proscitech</td><td>C047</td><td></td></tr><tr><td>NSA</td><td>Proscitech</td><td>C059</td><td></td></tr><tr><td>DMAE</td><td>Proscitech</td><td>C050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium metaperiodate</td><td>Analar BDH</td><td>10259</td><td></td></tr><tr><td>anti-somatostatin antibody</td><td>Dako</td><td>A0566</td><td></td></tr><tr><td>Antibody diluent</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 585 Streptavidin Conjugate&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10113MP</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody</td><td>Sigma</td><td>B7389-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 50%</td><td>EMS</td><td>16320</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>PBS "Dulbecco A"</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>BSAc (10%)</td><td>Aurion</td><td>900.022</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney PP</td><td>M</td><td></td></tr><tr><td>pH indicator strips (pH 2.0 - 9.0)</td><td>Merck</td><td>1.09584.0001</td><td></td></tr><tr><td>Micromoulds</td><td>Proscitech</td><td>RL063</td><td></td></tr><tr><td>Diamond knife</td><td>Diatome</td><td>Ultra 45</td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscope</td><td>FEI</td><td>Morgagni 268D</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence light microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axioscope A1</td><td></td></tr><tr><td>Grids 300 mesh nickel (thin bar)</td><td>Agar Scientific</td><td>G2740N</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC</td><td>Powertome</td><td></td></tr><tr><td>TEM camera control software</td><td>Soft Imaging System</td><td>AnalySIS</td><td>Versie 3.0</td></tr><tr><td>Image processing software</td><td>Adobe Systems Incorporated</td><td>Photoshop CS2</td><td></td></tr></tbody></table>

correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van quantum dot nanodeeltjes

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Een werkwijze wordt beschreven waarbij quantum dot (QD) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor immunocytochemische correlatieve studies van humane pathologie weefsel met behulp groothoek fluorescentie lichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Het protocol wij epoxy ultradunne coupes van humane tumor somatostatinoma immunolabeled Een primair antilichaam tegen somatostatine, gevolgd door een gebiotinyleerd secundair antilichaam en visualisatie met streptavidine geconjugeerd 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QD) tonen. De secties zijn gemonteerd op een TEM monster raster vervolgens op een glasplaatje geplaatst voor observatie door groothoek fluorescentie licht microscopie. Lichtmicroscopie onthult 585 nm QD etikettering als fel oranje fluorescentie de vorming van een korrelige patroon binnen de tumorcel cytoplasma. Bij lage tot mid-range vergroting met lichtmicroscopie de etikettering patroon gemakkelijk kan worden herkend en het niveau van niet-specifieke of achtergrond labeling beoordeeld. Dit is een kritiekestap voor daaropvolgende interpretatie van de immunokleuring patroon met TEM en evaluatie van de morfologische context. In dezelfde paragraaf wordt vervolgens droog gedept en bekeken door TEM. QD probes gezien worden gehecht aan amorf materiaal op individuele secretoire granules. Beelden worden verkregen uit dezelfde regio van belang (ROI) gezien door lichtmicroscopie voor correlatieve analyse. Overeenkomstige beelden uit elke modaliteit kan dan worden vermengd om de fluorescentie gegevens overlay over TEM ultrastructuur van de betrokken regio.

De somatostatinoma tumor specimen gebruikt voor deze studie omvatte tumorcellen vormen ductale structuren gemengd met collageen stoma weefsel. Met behulp van fluorescentie microscopie licht, individuele tumorcellen die overvloedige secretoire korrels bevatte toonde positieve etikettering van de somatostatine-hormoon. Kernen verscheen als donkere gaten met minimale niet-specifieke labeling detecteerbaar (Figuur 1). Bij lage vergrotingen werd variabel intense granulaire fl...

Er wordt een methode beschreven waarbij quantum dot (QD) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor correlatieve immunocytochemische studies van in epoxy ingebed weefsel van menselijke pathologie. We gebruiken commerciële antilichaamfragment-geconjugeerde QD's die worden gevisualiseerd door breedveldfluorescentielichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Het algemene doel van deze methode is om correlatieve licht- en elektronenmicroscopie, of CLEM-gegevens, te verkrijgen door fluorescentie-immunocytochemische informatie te combineren met ultrastructurele morfologie van transmissie-elektronenmicroscopie in één enkel beeld. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de immunocytochemie en pathologie, zoals met welke subcellulaire structuur een specifiek eiwit van belang geassocieerd is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat dezelfde quantum dot-nanodeeltjesprobe wordt gebruikt om zowel het live microscopiesignaal van het doeleiwit als de structurele lokalisatie via elektronenmicroscopie te verkrijgen.Nadat het menselijke somatostatinoomtumorgeweefsel is gefixeerd, ingebed en gesneden volgens het tekstprotocol, bereidt u een sectie-adhesieoplossing door 20 centimeter transparante plakband in een flesje van vijf milliliter met 2,0 milliliter aceton te plaatsen en dit 10 minuten te laten staan. Verwijder de plakband en dip een nikkelgrid in de oplossing, verwijder vervolgens het grid en laat het aan de lucht drogen. Gebruik, zodra het droog is, de stompe zijde van het grid om een ultradunne

correlative-light-electron-microscopy-using-quantum-dot

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De CLEM techniek is aangepast aan ultrastructurele morfologie van membranen, organellen, en subcellulaire structuren die door microgeïnjecteerde moleculen analyseren. Deze methode combineert de krachtige technieken van micromanipulatie / micro-injectie, confocale fluorescentie microscopie, en elektronenmicroscopie zodat millimeter tot multi-nanometer resolutie. Deze techniek is ontvankelijk voor een groot aantal toepassingen.

Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer

We beschrijven een werkwijze voor het lokaliseren van fluorescent gemerkte eiwitten in electronenmicroscoop. Fluorescentie wordt eerst gelokaliseerd met foto-geactiveerde lokalisatie microscopie op ultradunne secties. Deze beelden worden dan uitgelijnd op elektronenmicrofoto's van dezelfde sectie.

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

We beschrijven de bereiding van colloïdale quantum dots met minimale hydrodynamische grootte voor single-molecule fluorescentie beeldvorming. Vergeleken met conventionele quantum dots, deze nanodeeltjes zijn vergelijkbaar in grootte met globulaire eiwitten en zijn geoptimaliseerd voor single-molecule helderheid, stabiliteit tegen afbraak en resistentie tegen specifieke binding aan eiwitten en cellen.

Compact Quantum Dots voor Single-molecule Imaging

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Single fluoroforen kunnen worden gelokaliseerd met nanometer precisie met behulp van FIONA. Hier een overzicht van de FIONA techniek is gemeld, en hoe FIONA experimenten uit te voeren wordt beschreven.

Fluorescentie Imaging met One-nanometer nauwkeurigheid (FIONA)

Hier presenteren we een betrouwbare methode om de incorporatie van nanodeeltjes in een polymeer gastheermatrix te monitoren via zwellingscapsulering. We laten zien dat de oppervlakteconcentratie van cadmiumselenide kwantumdots nauwkeurig kan worden gevisualiseerd door middel van dwarsdoorsnede fluorescentiebeeldvorming.

Uitgebreide analyse van de samenstelling van nanodeeltjes-polymeer Composites Met behulp van Direct Fluorescence Imaging

In dit protocol stellen quantum dots geconjugeerd aan recombinant SARS-CoV-2 spike celgebaseerde assays in staat om spikebinding aan hACE2 aan het plasmamembraan en daaropvolgende endocytose van de gebonden eiwitten in het cytoplasma te controleren.

Confocale beeldvorming met hoge doorvoer van Quantum Dot-geconjugeerde SARS-CoV-2 Spike Trimers om binding en endocytose in HEK293T-cellen te volgen

Het huidige protocol beschrijft een methode voor het immuno-labelen van een eiwit in de hartweefselsecties met behulp van quantum dots. Deze techniek biedt een handig hulpmiddel om de subcellulaire lokalisatie en expressie van elk eiwit op ultrastructureel niveau te visualiseren.

Visualisatie van subcellulaire lokalisatie van een eiwit in het hart met behulp van Quantum Dots-Gemedieerde immuno-labeling gevolgd door transmissie-elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol voor geoptimaliseerde on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie op basis van endogene, fluorescerende labeling als een hulpmiddel om de lokalisatie van zeldzame eiwitten in relatie tot cellulaire ultrastructuur te onderzoeken. De kracht van deze aanpak wordt aangetoond door ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 in uitgehongerde cellen zonder behandeling met Bafilomycine.

Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.

Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft een mechanisme voor het gebruik van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie om de interactie van mitochondriën en lysosomen, gelabeld met mEosEM en APEX2 respectievelijk, te visualiseren.

Dual-color correlatieve licht- en elektronenmicroscopie voor de visualisatie van interacties tussen mitochondriën en lysosomen

Leer CLEM met quantum dot nanodeeltjes voor immunocytochemisch onderzoek van humane tumortweefsel. Deze methode combineert fluorescentie lichtmicroscopie met transmissie-elektronenmicroscopie voor gedetailleerde eiwitlokalisatie.

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

Meer video's verkennen