Aggregate Size Optimization in Microputjes voor Suspension basis Cardiac Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen
September 25th, 2016
Gebruikelijke werkwijzen tot inleiding suspensie geaggregeerde basis cardiale differentiatie van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) geplaagd cultuur heterogeniteit met betrekking tot de totale grootte en vorm. Hier beschrijven we een robuuste methode voor cardiale differentiatie gebruik microputjes genereren maat gecontroleerde HPSC aggregaten gekweekt onder omstandigheden cardiale bevorderen.
Eerst centrifuge een enkele menselijke pluripotente stamcel of HPSC-suspensie, bij 200 keer g gedurende vijf minuten. Na de centrifugatie, aspireer het wasmedium en suspendeer de cellen opnieuw in aggregaatmedium, bij een dichtheid van 1,2 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Zaai vervolgens één milliliter van de celsuspensie in elke put op de voorbereide microputplaat en verdeel de cellen gelijkmatig.
Om een groot aantal putten te zaaien, moet je de celsuspensie periodiek vortexen om sedimentatie te voorkomen. Na het zaaien, centrifugeer de plaat bij 200 keer g gedurende vijf minuten. Na het centrifugeren, observeer de plaat onder de microscoop om te bevestigen dat de cellen naar de bodem van elke microput zijn gedraaid.
Vervolgens incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in een 5% CO twee, 5% O twee hypoxische incubator. Een dag na de aggregatie, inspecteer de aggregaten onder de microscoop. Vergeleken met de directe post-centrifuge aggregatie, zouden ze intact moeten zijn met gladde randen.
Verwijder het supernatant door de microputplaat horizontaal vast te houden en de punt van een P-1000 micropipettor op het oppervlak van het kweekmedium te plaatsen, tegen de rand van de put. Vervolgens verwijder je langzaam het medium, zorgvuldig om de aggregaten op de bodem van de microputten niet te verstoren. Nadat het mediumniveau tot ongeveer één tot twee millimeter van het getextureerde oppervlak van de microput is verlaagd, kantelt je de plaat langzaam en aspireer je langzaam het resterende medium uit de put.
Voeg één milliliter vers bereid voorverwarmd stadium één inductiemedium toe door de pipettepunt tegen de binnenrand van de put te houden en het medium zeer langzaam tegen de binnenwand van de put te doseren. Breng de plaat terug naar de incubator onder hypoxische omstandigheden voor drie dagen. Op dag vier, gebruik een vijfdelige serologische pipette om de aggregaten uit elke put van de microputplaat te oogsten.
Verzamel maximaal 10 putten aggregaatsuspensie in een 15-milliliter conische buis. Laat de aggregaten 15 minuten in een hypoxische incubator bezinken. Nadat de aggregaten zijn bezonken, aspireer je voorzichtig het supernatant en suspendeer je de aggregaten opnieuw in tien milliliter voorverwarmd wasmedium om resterende inductieve cytokinen te verwijderen.
Centrifugeer de aggregaten bij 50 keer g gedurende twee minuten. Na de centrifugatie, aspireer je het supernatant en suspendeer je de gepelletiseerde aggregaten in voorverwarmd stadium twee inductiemedium. Breng de aggregaatsuspensie over naar een 24-well ultra-low attachment plaat bij één milliliter per put.
Observeer de aggregaten onder de microscoop als uniforme compacte celclusters. Incubeer onder hypoxische omstandigheden tot dag zes. Op dag zes, verzamel je maximaal 10 milliliter aggregaten per 15-milliliter conische buis zoals eerder.
Nadat de aggregaten zijn bezonken, aspireer je het supernatant en suspendeer je de aggregaten in het voorverwarmde stadium drie inductiemedium. Gebruik een vijfdelige serologische pipette om de aggregaten opnieuw te verdelen in een 24-well ultra-low attachment plaat, bij één milliliter per put. Voer een volledige mediumverversing uit op dag 10 van de kweek.
Op dag 12, breng je de cellen over naar normoxische kweekomstandigheden van 20% zuurstof en 5% koolstofdioxide voor de rest van de kweekperiode. Na 12 dagen differentiatie, wat overeenkomt met zes dagen in cardiale inductiestadium drie medium, werden krachtige aggregate-brede contracties waargenomen. Op dag 17 is 74,8% van de cellen positief voor cardiale troponine T, door middel van flowcytometrie, zoals aangegeven door het gevulde gedeelte van de histogram.
Ook getoond zijn cellen die zijn gekleurd met alleen de secundaire antilichaam, getoond door het ongevulde gedeelte van de histogram. Bij het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om de aggregaten goed te wassen op dag vier, om sporenniveaus van cytokinen te verwijderen, specifiek activin-A, die endoderm differentiatie bevorderen, ten koste van cardiale inductie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals koude kweek van inductieve celtypen binnen het aggregaat, worden uitgevoerd om andere vragen te beantwoorden, zoals hoe paracriene signalering van naburige embryonale weefsels de differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in de cardiale lijn beïnvloedt.
Overzicht
Dit artikel presenteert een robuuste methode voor hartdifferentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) met behulp van microwells om grootte-gecontroleerde aggregaten te genereren. De methode behandelt kwesties van cultuurheterogeniteit geassocieerd met conventionele technieken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamceldonderszoek
- Hartdifferentiatie
- Weefselengineering
Achtergrond
- Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) kunnen differentiëren in verschillende celtypen, inclusief hartcellen.
- Conventionele methoden resulteren vaak in aggregaten van verschillende grootten en vormen, wat de differentiatieresultaten beïnvloedt.
- Microwelltechnologie biedt een oplossing voor het genereren van uniforme aggregaten.
- Hartbevorderende omstandigheden zijn essentieel voor effectieve differentiatie.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het genereren van grootte-gecontroleerde hPSC aggregaten.
- Om de consistentie van hartdifferentiatieresultaten te verbeteren.
- Om verder onderzoek naar hartweefselengineering te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Centrifugatie van hPSC suspensie om aggregaten te vormen.
- Gebruik van microwellplaten om de grootte van aggregaten te controleren.
- Incubatie onder hypoxische omstandigheden om hartdifferentiatie te bevorderen.
- Sequentiële mediumveranderingen om differentiatiefasen te induceren.
Belangrijkste resultaten
- Uniforme aggregaten werden gevormd en gehandhaafd gedurende het differentiatieproces.
- Aanzienlijke expressie van cardiale troponin T werd waargenomen in gedifferentieerde cellen.
- Verbeterde verwijdering van inductieve cytokinen verbeterde de hartlijn commitering.
- Aggregate-brede contracties werden opgemerkt na 12 dagen van differentiatie.
Conclusies
- De microwellmethode biedt een betrouwbare benadering voor hartdifferentiatie van hPSCs.
- Grootte-gecontroleerde aggregaten leiden tot meer consistente differentiatieresultaten.
- Deze techniek kan worden toegepast om de hartontwikkeling en ziektemodellering verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Controlling aggregate size in suspension-based cardiac differentiation addresses a key bottleneck in hPSC-derived cardiomyocyte production: culture heterogeneity leading to variable yields. By enforcing uniform aggregate formation via microwell technology, this method enhances predictive confidence in differentiation outcomes, supporting scalable and reproducible preclinical model generation. This positions the approach as a strategic tool for de-risking cardiac lineage commitment in early discovery and translational workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of size-dependent signaling pathways in cardiac induction, clarifying mechanistic drivers of lineage specification.
- Operational Value: Reduces variability in aggregate formation, improving reproducibility across experiments and teams.
- Predictive Value: Supports dose-response modeling of morphogen exposure by standardizing aggregate geometry as a controlled variable.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces uniform microtissues suitable for high-content imaging and flow cytometry-based cardiomyocyte quantification.
- Scalability: Microwell plate format allows parallel processing of multiple conditions or genetic backgrounds for comparative screening.
- Quantitative Output: Enables consistent measurement of cardiac troponin T-positive cells as a functional readout for compound or genetic perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Generates scalable, homogeneous cardiac aggregates for modeling inherited cardiomyopathies or drug-induced cardiotoxicity.
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage differentiation with preclinical validation by providing lot-to-lot consistent cellular material.
- Mechanistic De-risking: Minimizes confounding variables from aggregate size heterogeneity, increasing confidence in phenotype-to-genotype associations.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized hPSC differentiation, which feeds into downstream applications such as disease modeling, safety pharmacology, and regenerative medicine candidate evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing around biophysical cues in cardiac lineage commitment through precise control of aggregate size and shape.
- Screening: Delivers reproducible microtissue arrays for compound library screening with reduced noise from aggregation variability.
- Analytics: Facilitates quantitative flow cytometry and imaging readouts (e.g., cardiac troponin T) with improved signal-to-noise due to population homogeneity.
- Translational Research: Provides a scalable source of cardiomyocytes for preclinical functional assays, including contractility and electrophysiology.
- Enterprise Reuse: Microwell plates can be reused across projects and cell lines, supporting platform-level standardization in stem cell differentiation workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in differentiation outcomes by minimizing biological noise from aggregate size variation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput via standardized, scalable aggregate formation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in early cardiac programs by reducing false negatives from inefficient differentiation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted resource allocation based on reliable cardiomyocyte yield metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hPSC culture, aggregate handling, and hypoxic incubation systems.
- Dependent on access to microwell plates with defined well dimensions and low-attachment surfaces.
- Necessitates standardized medium exchange protocols to avoid aggregate disruption during washing steps.
- Requires validation across hPSC lines to ensure size-to-differentiation efficiency relationships are consistent.
- Limited by the need for specialized equipment (hypoxic incubators, low-attachment plates) and optimized cytokine wash steps to prevent off-target differentiation.
