Aggregate Size Optimization in Microputjes voor Suspension basis Cardiac Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen
25 september 2016
Gebruikelijke werkwijzen tot inleiding suspensie geaggregeerde basis cardiale differentiatie van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) geplaagd cultuur heterogeniteit met betrekking tot de totale grootte en vorm. Hier beschrijven we een robuuste methode voor cardiale differentiatie gebruik microputjes genereren maat gecontroleerde HPSC aggregaten gekweekt onder omstandigheden cardiale bevorderen.
Eerst centrifuge een enkele menselijke pluripotente stamcel of HPSC-suspensie, bij 200 keer g gedurende vijf minuten. Na de centrifugatie, aspireer het wasmedium en suspendeer de cellen opnieuw in aggregaatmedium, bij een dichtheid van 1,2 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Zaai vervolgens één milliliter van de celsuspensie in elke put op de voorbereide microputplaat en verdeel de cellen gelijkmatig.
Om een groot aantal putten te zaaien, moet je de celsuspensie periodiek vortexen om sedimentatie te voorkomen. Na het zaaien, centrifugeer de plaat bij 200 keer g gedurende vijf minuten. Na het centrifugeren, observeer de plaat onder de microscoop om te bevestigen dat de cellen naar de bodem van elke microput zijn gedraaid.
Vervolgens incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in een 5% CO twee, 5% O twee hypoxische incubator. Een dag na de aggregatie, inspecteer de aggregaten onder de microscoop. Vergeleken met de directe post-centrifuge aggregatie, zouden ze intact moeten zijn met gladde randen.
Verwijder het supernatant door de microputplaat horizontaal vast te houden en de punt van een P-1000 micropipettor op het oppervlak van het kweekmedium te plaatsen, tegen de rand van de put. Vervolgens verwijder je langzaam het medium, zorgvuldig om de aggregaten op de bodem van de microputten niet te verstoren. Nadat het mediumniveau tot ongeveer één tot twee millimeter van het getextureerde oppervlak van de microput is verlaagd, kantelt je de plaat langzaam en aspireer je langzaam het resterende medium uit de put.
Voeg één milliliter vers bereid voorverwarmd stadium één inductiemedium toe door de pipettepunt tegen de binnenrand van de put te houden en het medium zeer langzaam tegen de binnenwand van de put te doseren. Breng de plaat terug naar de incubator onder hypoxische omstandigheden voor drie dagen. Op dag vier, gebruik een vijfdelige serologische pipette om de aggregaten uit elke put van de microputplaat te oogsten.
Verzamel maximaal 10 putten aggregaatsuspensie in een 15-milliliter conische buis. Laat de aggregaten 15 minuten in een hypoxische incubator bezinken. Nadat de aggregaten zijn bezonken, aspireer je voorzichtig het supernatant en suspendeer je de aggregaten opnieuw in tien milliliter voorverwarmd wasmedium om resterende inductieve cytokinen te verwijderen.
Centrifugeer de aggregaten bij 50 keer g gedurende twee minuten. Na de centrifugatie, aspireer je het supernatant en suspendeer je de gepelletiseerde aggregaten in voorverwarmd stadium twee inductiemedium. Breng de aggregaatsuspensie over naar een 24-well ultra-low attachment plaat bij één milliliter per put.
Observeer de aggregaten onder de microscoop als uniforme compacte celclusters. Incubeer onder hypoxische omstandigheden tot dag zes. Op dag zes, verzamel je maximaal 10 milliliter aggregaten per 15-milliliter conische buis zoals eerder.
Nadat de aggregaten zijn bezonken, aspireer je het supernatant en suspendeer je de aggregaten in het voorverwarmde stadium drie inductiemedium. Gebruik een vijfdelige serologische pipette om de aggregaten opnieuw te verdelen in een 24-well ultra-low attachment plaat, bij één milliliter per put. Voer een volledige mediumverversing uit op dag 10 van de kweek.
Op dag 12, breng je de cellen over naar normoxische kweekomstandigheden van 20% zuurstof en 5% koolstofdioxide voor de rest van de kweekperiode. Na 12 dagen differentiatie, wat overeenkomt met zes dagen in cardiale inductiestadium drie medium, werden krachtige aggregate-brede contracties waargenomen. Op dag 17 is 74,8% van de cellen positief voor cardiale troponine T, door middel van flowcytometrie, zoals aangegeven door het gevulde gedeelte van de histogram.
Ook getoond zijn cellen die zijn gekleurd met alleen de secundaire antilichaam, getoond door het ongevulde gedeelte van de histogram. Bij het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om de aggregaten goed te wassen op dag vier, om sporenniveaus van cytokinen te verwijderen, specifiek activin-A, die endoderm differentiatie bevorderen, ten koste van cardiale inductie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals koude kweek van inductieve celtypen binnen het aggregaat, worden uitgevoerd om andere vragen te beantwoorden, zoals hoe paracriene signalering van naburige embryonale weefsels de differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in de cardiale lijn beïnvloedt.
Overzicht
Dit artikel presenteert een robuuste methode voor cardiale differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) met behulp van microwells om aggregaten van een gecontroleerde grootte te genereren. De methode pakt problemen aan met betrekking tot cultuurheterogeniteit die geassocieerd worden met conventionele technieken.
Belangrijkste Onderzoeksonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Cardiale differentiatie
- Tissue engineering
Achtergrond
- Humaan pluripotente stamcellen (hPSCs) kunnen differentiëren tot diverse celtypen, waaronder hartcellen.
- Conventionele methoden resulteren vaak in aggregaten van verschillende groottes en vormen, wat de differentiatieresultaten beïnvloedt.
- Microwell-technologie biedt een oplossing voor het genereren van uniforme aggregaten.
- Hartbevorderende condities zijn essentieel voor een effectieve differentiatie.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het genereren van hPSC-aggregaten met een gecontroleerde grootte.
- Het verbeteren van de consistentie van de resultaten van de cardiale differentiatie.
- Het faciliteren van verder onderzoek naar cardiale weefselengineering.
Gebruikte methoden
- Centrifugatie van de hPSC-suspensie om aggregaten te vormen.
- Gebruik van microwell-platen om de grootte van de aggregaten te beheersen.
- Incubatie onder hypoxische omstandigheden om cardiale differentiatie te bevorderen.
- Sequentiële mediumwissels om differentiatiefases te induceren.
Belangrijkste resultaten
- Uniforme aggregaten werden gevormd en behouden gedurende het gehele differentiatieproces.
- Er werd een significante expressie van cardiaal troponine T waargenomen in de gedifferentieerde cellen.
- Een verbeterde verwijdering van inductieve cytokinen versterkte de commitment naar de cardiale lineage.
- Contracties over het gehele aggregaat werden genoteerd na 12 dagen differentiatie.
Conclusies
- De microwell-methode biedt een betrouwbare aanpak voor de cardiale differentiatie van hPSCs.
- Aggregaten met een gecontroleerde grootte leiden tot consistentere differentiatieresultaten.
- Deze techniek kan worden toegepast om de cardiale ontwikkeling en ziektemodellering verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het beheersen van de aggregaatgrootte bij suspensie-gebaseerde cardiale differentiatie pakt een belangrijk knelpunt aan in de productie van hPSC-afgeleide cardiomyocyten: cultuurheterogeniteit die leidt tot variabele opbrengsten. Door een uniforme aggregaatvorming af te dwingen via microwell-technologie, verhoogt deze methode de voorspelbaarheid van de differentiatieresultaten, wat bijdraagt aan de generatie van schaalbare en reproduceerbare preklinische modellen. Dit positioneert de aanpak als een strategisch instrument om de risico's bij de toewijzing aan de cardiale lijn in vroege discovery- en translationele workflows te verminderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om grootteafhankelijke signaleringspaden bij cardiale inductie te onderzoeken, waardoor de mechanistische drijvers van lineage-specificatie worden verduidelijkt.
- Operationele waarde: Vermindert variabiliteit in aggregaatvorming, wat de reproduceerbaarheid tussen experimenten en teams verbetert.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt dosis-responsmodellering van morphogene blootstelling door de geometrie van aggregaten te standaardiseren als een gecontroleerde variabele.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert uniforme microweefsels die geschikt zijn voor high-content imaging en kwantificatie van cardiomyocyten via flowcytometrie.
- Schaalbaarheid: Het microwell-plaatformaat maakt parallelle verwerking van meerdere condities of genetische achtergronden mogelijk voor vergelijkende screening.
- Kwantitatieve output: Maakt consistente meting van cardiale troponine T-positieve cellen mogelijk als functionele readout voor studies naar verbindingen of genetische perturbaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekte-relevant systeem: Genereert schaalbare, homogene hartaggregaten voor het modelleren van erfelijke cardiomyopathieën of door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen differentiatie in de ontdekkingsfase en preklinische validatie door cellulaire materialen te leveren die consistent zijn van batch tot batch.
- Mechanische risicovermindering: Minimaliseert storende variabelen door heterogeniteit in aggregaatgrootte, waardoor het vertrouwen in fenotype-genotype-associaties toeneemt.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinische fase door gestandaardiseerde hPSC-differentiatie mogelijk te maken, wat bijdraagt aan downstream-toepassingen zoals ziekte modellering, veiligheidsfarmacologie en de evaluatie van kandidaten voor regeneratieve geneeskunde.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten rond biofysische signalen bij de commitment van de cardiale lijn door nauwkeurige controle over de grootte en vorm van aggregaten.
- Screening: Levert reproduceerbare microweefsel-arrays voor screening van verbindingenbibliotheken met minder ruis door variabiliteit in aggregatie.
- Analytics: Faciliteert kwantitatieve flowcytometrie en imaging-readouts (bijv. cardiaal troponine T) met een verbeterde signaal-ruisverhouding dankzij populatiehomogeniteit.
- Translationeel onderzoek: Biedt een schaalbare bron van cardiomyocyten voor preklinische functionele assays, inclusief contractiliteit en elektrofysiologie.
- Hergebruik op organisatieniveau: Microwell-platen kunnen worden hergebruikt in verschillende projecten en cellijnen, wat bijdraagt aan standaardisatie op platformniveau in workflows voor stamceldifferentiatie.
Operationele & zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in differentiatieresultaten door biologische ruis als gevolg van variaties in aggregaatgrootte te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en doorvoer via gestandaardiseerde, schaalbare aggregaatvorming.
- Strategische waarde: Verbetert het vertrouwen in go/no-go-beslissingen in vroege hartprogramma's door vals-negatieven als gevolg van inefficiënte differentiatie te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde toewijzing van middelen mogelijk op basis van betrouwbare metrieken voor de opbrengst aan cardiomyocyten.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in hPSC-kweek, de verwerking van aggregaten en hypoxic incubatiesystemen.
- Afhankelijk van toegang tot microwell-platen met gedefinieerde putafmetingen en oppervlakken met lage aanhechting.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor mediumverversing om disruptie van aggregaten tijdens wasstappen te voorkomen.
- Vereist validatie over verschillende hPSC-lijnen om te garanderen dat de relaties tussen grootte en differentiatie-efficiëntie consistent zijn.
- Beperkt door de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur (hypoxische incubatoren, platen met lage aanhechting) en geoptimaliseerde cytokinewasstappen om off-target differentiatie te voorkomen.
