Name: Beeldvorming Calcium in Drosophila Bij Egg Activering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Leer calciumbeeldvorming tijdens eiactivering in Drosophila melanogaster met dit ex vivo protocol. Deze methode maakt hoge resolutie en manipulatie van rijpe eieren mogelijk voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar voor Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya voor hulp tijdens de voorbereiding van dit manuscript; Mariana Wolfner voor discussies op ei activering; Matt Wayland voor imaging-ondersteuning; en Nan Hu algemene steun in het laboratorium. Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Cambridge, ISSF om TTW [subsidie ​​nummer 097.814].

Opmerking: Voer alle stappen bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven. 1. Voorbereidingen voor Dissection Opmerking: De hier beschreven stappen zijn in overeenstemming met E. Gavis, Princeton University &amp; Weil et. al. 18. Voer de volgende stappen twee dagen voor de beeldvorming. <ol><li> Neem een ​​vlieg flacon ongeveer 10 ml vast voedsel en voeg een kleine hoeveelheid gedroogde gist een hoek, minder dan 1 g volstaat. Opmerking: Voor informatie over fly flesjes of voedsel zie &#39;Drosophila Maintenance&#39; 19. </li><li> Voeg 1-3 druppels water de gist hydrateren. </li><li> Zet de flacon opzij in een hoek van 45 ° en laat 3-5 min voor de gist tot het nemen van het water. </li><li> Terwijl de gist wordt het water absorberen, selecteert u een fles vliegen uitdrukken UASt- myr GCaMP5 20 gedreven door bad-VP16GAL4 (aangeduid als GCaMP5) die onlangs zijn ontstaan ​​(een myristoyberekende vorm van de GCaMP5 werd gekozen om een ​​hoge signaal-ruisverhouding met aanbinden de GECI het membraan in het ei). </li><li> Verdoven de vliegen in de fles met CO 2 gas. Zorg ervoor dat u de fles omgekeerd, zodat er geen vliegen te verliezen in het natvoer te houden. </li><li> Tip de verdoofd vliegen op een CO 2 pad en sorteren 10 - 15 vrouwen en 5 mannen met behulp van een penseel onder een dissectie microscoop. Opmerking: Het is standaard om mannetjes aan gezonde vrouwen voor dissectie bevatten. </li><li> Wanneer de flacon uit stap 1.3 is klaar, voeg de geselecteerde vliegen aan de flacon. Zorg ervoor dat de flacon horizontaal te houden totdat de vliegen actief worden. </li><li> Plaats het flesje bij 25 ° C gedurende ongeveer 36 uur. </li><li> De terugkeer van de resterende vliegt van de CO 2 pad naar de fles of discard. </li></ol> 2. Ontleden Drosophila Eierstokken Opmerking: De hier beschreven stappen zijn overeenkomstig Weil et. al. <sup&gt; 18. <ol><li> Na 36 uur, verdoven de vliegen uit de gegiste flacon met CO 2. </li><li> Zodra de vliegen in de flacon worden verdoofd tip hen op de CO 2 pad worden opgelost met een kwast onder een dissectie microscoop. </li><li> Selecteer een vrouw. </li><li> Isoleer beide eierstokken van de vrouw. Voor de volledige gedetailleerd protocol zie Weil et. al. 18. Samengevat: <ol><li> Plaats een kleine daling van zuurstofrijk halogene olie (serie 95) op een No. 1.5, 22 x 40 mm dekglaasje. </li><li> Pak de vrouw met tang op de voorste van de buik. </li><li> Het houden van de vrouwelijke onder de microscoop ontleden, gebruik maken van de tweede set van een tang om voorzichtig verwijderen van de achterkant van het vrouwtje. </li><li> Veeg het achterste weefsel van de tweede tang. </li><li> Knijp de buikholte tweede tang uit de voorste naar het achterste van de buik. De twee ondoorzichtige eierstokken moet vasthouden aan de tang als buitenkant van de female. </li><li> Raak de eierstokken in de olie. </li><li> Verwijder eventuele weefsel uit de tang door afvegen de tang. </li><li> Herhaal deze stappen (2.4.1 - 2.4.7) tot drie dekglaasjes te verkrijgen, die elk eierstokken van een vlieg. </li></ol></li></ol> 3. Isoleren Individuele rijpe eicellen <ol><li> Onder een standaard dissectie microscoop met het ingesteld op 4X, op de eerste dekglaasje van stap 2,4 vergroting, scheiden de twee eierstokken door het scheuren van de eileider. </li><li> Invoering van een paar gesloten pincet in het midden van een eierstok, verzorgen elk ei kamers niet doorboren. </li><li> Plaats een standaard dissectie sonde in het midden van het ovarium naast de gesloten tang. </li><li> Voorzichtig sleept u de ontleden sonde door de eierstok naar de achterste paal, waar de rijpe eicellen (fase 14 ei kamers) bevinden zich. </li><li> Herhaal stap 3,1-3,4 2-5 keer afhankelijk van de grootte van het ovarium en het aantal eieren. Opmerking: Toevoeging van CO 2 </sub&gt; veroorzaakt meestal de afzetting van een enkel ei die groter zijn met opgeheven dorsale aanhangsels dan eerder afgegeven eieren zal verschijnen. Deze eieren moeten worden weggegooid voor beeldvorming omdat het reeds in de vrouwelijke geactiveerd. Opmerking: De rijpe eieren zijn waarschijnlijk gemakkelijk te scheiden van de eierstokken bindweefsel. </li><li> Als er geen rijpe eicellen zijn zichtbaar buiten de eierstok, blijven voorzichtig plagen met het ontleden sonde. </li><li> Zodra de rijpe eicellen zijn zichtbaar op het dekglaasje buitenkant van de eierstok, manoeuvreren 3-5 in een lijn in het midden van het dekglaasje. Opmerking: Voor de beste resultaten voert u de sonde voorzichtig langs de zijkant van de eieren. Opmerking: Vermijd het trekken aan de dorsale aanhangsels, omdat dit het ei kan beschadigen. Opmerking: Afhankelijk van de toekomst beeldvorming set-up, uitlijnen de eieren ongeveer 200 urn van elkaar loodrecht op het dekglaasje voor maximale beeldgebied. </li><li> Eenmaal uitgelijnd, verwijder de rest van het eierstokweefsel door het weg te slepen uit de uitgelijnde eieren behulp van de forceps. </li><li> Verwijder overtollige olie door deppen met de hoek van een medische vegen. Zorg ervoor dat u de rijpe eicellen te raken met de medische veegt als rijpe eicellen die worden benaderd zullen verloren gaan. </li><li> Teken een draadkruis op het dekglaasje met een marker te vereenvoudigen lokaliseren van het monster onder de microscoop. </li><li> Stel de dekglaasje op een veilige plaats en laat de voorbereide ei kamers op het dekglaasje te rusten voor 5-10 min. Dit maakt het mogelijk eieren te vestigen in de olie. Monsters kunnen gebruikt worden tot 1 uur na dissectie. </li><li> Herhaal stap 3,1-3,11 de rest van de dekglaasjes met eierstokken erop. </li></ol> 4. Voorbereiding van Imaging <ol><li> Breng bereid activeringsbuffer 15 tot kamertemperatuur. Opmerking: activering buffer is een hypotonische buffer: 3,3 mM NaH 2PO 4, 16,6 mM KH 2PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% polyethyleenglycol 8000, 2 mM CaCl2, pH 6,4 gebracht met 1: 5 verhouding van NaOH: KOH.Voor meer informatie zie Mahowald, 1983 15. Porties activeringsbuffer kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende maanden bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. </li><li> vervoeren zorgvuldig voorbereide dekglaasjes, activering buffer en glazen pipetten voor de beeldvorming faciliteit. Opmerking: Een breed gebied confocale, draaiende schijf of plaat licht microscoop kan worden gebruikt. We raden het gebruik van een omgekeerde microscoop. De representatieve resultaten werden verkregen met een confocale microscoop. </li><li> Een objectieve geschikt voor beeldvorming van het gehele rijpe eicel moet (hier: 20X 0.7 NA) worden gekozen. </li><li> Monteer de eerste voorbereide dekglaasje op de microscoop podium. Zorg ervoor dat u de dekglaasjes op het podium te breken. </li><li> Kwalitatief selecteert u een gezichtsveld met een volwassen ei kamer voor activering. Niet image doorboord ei kamers of mensen met blebbing in het membraan. Opmerking: voor de stappen 4,6-4,7, softwareopdrachten is afhankelijk van microscoop en fabrikant. </li><li> Set imaging parameter voor standaard GFP excitatie (488 nm) en emissie (500-580 nm). Ook het opzetten van een bright-field oog in oog te visualiseren en te oriënteren de rijpe eicel en ontheemde olie. </li><li> Selecteer de laagste Z-vlak waarbinnen rijpe eicellen zijn toegankelijk en tot fullcolour Z-stack te worden genomen voor 40 urn ongeveer 2 micrometer per stap. Stel de parameters zodat er geen vertraging tussen Z-stack acquisitie. Stel de tijdreeks te leggen gedurende ongeveer 30 minuten. </li></ol> 5. Imaging Ex Vivo Egg Activation <ol><li> Start beeld vast te leggen. </li><li> Wacht 1-2 full Z-stacks te verwerven. Dit toont de rijpe eicel voorafgaande aan activatie. </li><li> Trekken ongeveer 300 gl buffer activatie in een glazen pipet. </li><li> Positioneren van het uiteinde van de glazen pipet met activatie buffer bij een 45 ° hoek boven het dekglaasje, langzaam de pipet in de stralengang totdat deze direct boven de rijpe eicel wordt afgebeeld. De glazen pipet moetzijn 1-2 cm boven de olie. </li><li> Voeg 1-2 druppels activeringsbuffer in minder dan 5 seconden van de glazen pipet. Dit moet de olie vervangen. Vermijd het toevoegen overtollige activering buffer of het aanraken van het ei met de glazen pipet als het verplaatsen van de rijpe eicel kan veroorzaken. Zorg ervoor dat u het dekglaasje te raken met de pipet, omdat dit een verandering in de focal plane of luchtbellen kunnen veroorzaken te vormen in de immersie olie tussen de objectieve en dekglaasje. </li><li> Terwijl het toevoegen van activering buffer tijdens beeldacquisitie, controleer dan de bright-field kanaal om ervoor te zorgen dat de olie is verdrongen door de activering buffer. Opmerking: Deze verschijnt eerst als een schaduw door het breken van de pipet stralengang maar zal ook leiden tot het verschijnen van kleine oliedruppeltjes. Sommige oliedruppeltjes kan geassocieerd blijven met de rijpe eicel die experimentele resultaten en de beeldkwaliteit zal beïnvloeden. </li><li> Als de olie niet wordt verplaatst van de eerste toevoeging van activering buffer herhaalt u stap 5,4-50,6. </li><li> Zodra de olie met succes wordt verplaatst, zodat de tijdreeksen te lopen tot aan de voltooiing. Let op: Als gevolg van zwelling van eicellen bij activering, sommige ei kamers zal drastisch uit de focal plane of gezichtsveld verplaatsen na toevoeging van de activering buffer. In deze situatie, stopt de verwerving en monteer de volgende dekglaasje. </li><li> Na de reeks afbeeldingen overname heeft afgerond, opslaan van gegevens. </li></ol> 6. Post-acquisitie Image Processing <ol><li> Open de dataset met behulp van Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), of gelijkwaardige software voor beeldverwerking, en selecteer de relevante bestanden voor analyse. </li><li> Om een ​​projectie van de verkregen gegevens te bouwen selecteren: Afbeelding&gt; Stacks&gt; Z-project. </li><li> Selecteer een start Z-slice en een stop Z-slice, meestal de hele sectie. Selecteer een projectie type doorgaans ingesteld op &#39;Max Intensity&#39;. Controleer hokje &#39;All Time Frames&#39; om de gekozen instellingen toe te passen op de hele reeks. </li><li> Alsmeer dan een TL-kanaal is afgebeeld, gebruik maken van de Kanalen tool om beweging tussen kleuren maken, maak een composiet, of maak de afbeelding grijstinten. Selecteer Afbeelding&gt; Kleuren&gt; Kanalen tool. </li><li> Om de helderheid van het beeld aan te passen en het contrast te selecteren Afbeelding&gt; Aanpassen&gt; Helderheid / Contrast. </li><li> Om een ​​enkel beeld te exporteren, verplaatsen tijdschaal schuifregelaar naar relevante frame en selecteer Bestand&gt; Opslaan als&gt; Jpeg, of iedere gewenste formaat. </li><li> Kies een locatie en naam voor het geëxporteerde bestand en vervolgens op te slaan. Opmerking Het frame rate van de imaging software vereist zal zijn om een ​​tijdstempel op het beeld te geven. </li><li> Exporteren de tijdreeks als een film te selecteren: Bestand&gt; Opslaan als&gt; AVI, selecteer frame rate (~ 7 frames per seconde). </li><li> Kies een locatie en naam voor het geëxporteerde bestand en vervolgens op te slaan. </li><li> Om de aangepaste bestand in Fiji formaat op te slaan, selecteert u Bestand&gt; Opslaan. </li></ol>

<ol><li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitioning+from+egg+to+embryo%3A+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li>
<li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li>
<li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li>
<li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li>
<li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).</li>
<li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDouglass%2C+A+%22New+Techniques+in+Systems+Neuroscience%22">New Techniques in Systems Neuroscience</a>. , Springer. (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li>
<li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22JoVE+Science+Education+Database%22">JoVE Science Education Database</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li>
<li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li>
<li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li>
<li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23(2004).</li>
<li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De eerste cruciale stap in dit protocol is het isoleren van de rijpe eieren zonder schade. Dit kan worden bereikt door het voorzichtig manoeuvreren van de eieren met de dissectiesonde. Oefening zal deze manipulatie mogelijk maken zonder schade aan de eieren. Een tweede cruciale stap is het voorkomen van het verlies van het monster wanneer activeringsbuffer wordt toegepast op de rijpe ei in olie. Toepassing van de activeringsbuffer moet langzaam gebeuren en zonder contact met de dekglas. Deze stap kan uitdagend zijn als de microscoopopstelling geen gemakkelijke toegang tot het monster mogelijk maakt. Het is aan te raden om hulpstukken van de microscoop, zoals een temperatuurincubator, te verplaatsen.
Aanpassingen aan dit protocol kunnen worden gemaakt om andere fluorescerend gelabelde factoren te visualiseren, in plaats van Ca2+ bij eiactivering. Meer in het algemeen kunnen verschillende stadia van Drosophila-ontwikkeling of de resultaten van het toevoegen van een andere buffer worden geanalyseerd met behulp van dit protocol.
Foutopsporing kan nodig zijn als de instellingen op de microscoop niet optimaal zijn voor het visualiseren van het signaal van het monster. Dit kan worden bereikt door de laservermogen te verhogen of te verlagen, de opnamebereik te wijzigen en de Z-stack-parameters aan te passen. Een ander probleem kan zijn dat eieren consequent uit het gezichtsveld bewegen bij het toevoegen van activeringsbuffer. Als dit regelmatig gebeurt, laat dan de rijpe eieren langer op de dekglazen bezinken, 15 tot 20 minuten. Let erop dat het gebruik van olie met een hogere viscositeit de verplaatsing van de olie door activeringsbuffer zal veranderen.
Deze hier gepresenteerde techniek wordt beperkt door de werkafstand van het objectief, uitdroging van de rijpe eieren en de mogelijkheid om de rijpe eieren zonder schade te dissecteren. In vergelijking met in vivo beeldvormingsmethoden waarbij de rijpe oöcyt door het volwassen vrouwtje passeert en wordt afgezet 13, stelt onze methode meer ruimtelijke resolutie mogelijk, de optie om de rijpe ei fysiek te manipuleren vóór activering en de mogelijkheid om de rol van eiactivering zonder bevruchting te testen.
Er zijn veel potentiële toekomstige toepassingen van deze techniek, inclusief het testen van reporterconstructen voor cellulaire componenten bij eiactivering en het visualiseren van de Ca2+-golf in mutante achtergronden 14,24. Samen met experimentele en genetische tools maakt de ex vivo eiactiveringstest die hier wordt gepresenteerd, de studie van de trigger, voortplanting en downstream-effecten van de universeel geconserveerde Ca2+-golf mogelijk.

Een verandering van de intracellulaire Ca2 + concentratie ei (eicel) activering is een geconserveerd deel van alle onderzochte organismen 1,2. Deze gebeurtenis start uiteenlopende Ca2 + -afhankelijke processen, waaronder de hervatting van de celcyclus en translatie van mRNAs opgeslagen. Door deze eis voor Ca2 + visualiseert de voorbijgaande veranderingen in de intracellulaire Ca2 + concentratie is van essentieel belang. Historisch gezien werden modelorganismen geselecteerd studies over eieren activatie gebaseerd op de grootte en de beschikbaarheid van eieren. Verschillende visualisatie benaderingen zijn gebruikt om veranderingen te volgen en kwantificeren intracellulaire Ca2 + concentraties in deze systemen, inclusief: het fotoproteïne aequorine in medaka vis 3; Ca 2+ gevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals Fura-2 in zee-egels en hamster 4,5; en calcium groen-1-dextran in Xenopus 6. Het genereren en verbetering van genetisch gecodeerd calcium indicatoren (Geçiş) heeft de mogelijkheid om te visualiseren Ca 2+ dynamiek in vivo 7 omgezet. Deze genetische constructen uitgedrukt in specifieke weefsels en beperken de noodzaak voor invasieve weefselpreparaten 8. GCaMPs een groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerde klasse Geçiş die zeer effectief zijn vanwege hun hoge Ca2 + affiniteit, signaal-ruisverhouding en capaciteit worden aangepast 9-11. In de aanwezigheid van Ca2 +, de GCaMP complex ondergaat een reeks conformationele veranderingen, te beginnen met de binding van Ca2 + aan calmoduline, wat leidt tot een toegenomen fluorescentie-intensiteit van het GFP component 9. GCaMPs zijn uitgebreid gebruikt in onderzoek Drosophila neuronen veranderingen in intracellulaire calcium 12 visualiseren. De recente applicatiop van GCaMP technologie om Ca 2+ te visualiseren in de volwassen Drosophila eieren is gebleken dat één van voorbijgaande aard Ca 2+ golf bij ei activering 13,14. De Ca 2+ golf kan worden gevisualiseerd op lage vergroting tijdens de ovulatie in vivo 13 of bij een hogere vergroting met behulp van een ex vivo activering assay 13,14. In de ex vivo analyse worden afzonderlijke rijpe oöcyten geïsoleerd van de eierstokken en geactiveerd door een hypotone oplossing, genoemd activeringsbuffer, waarvan is aangetoond dat de gebeurtenissen van in vivo activering 15-17 recapituleren. Deze ex vivo test maakt een eenvoudige hoge resolutie visualisatie van de Ca 2+ golf onder verschillende experimentele condities waaronder farmacologische verstoring, fysieke manipulaties en genetische mutanten. In dit artikel wordt de voorbereiding van de volwassen Drosophila eieren voor ex vivo activering en the daaropvolgende microscopie gebruikt om de Ca 2+ wave met behulp van GCaMP visualiseren. Deze benadering kan worden gebruikt voor de initiatie en controle van de Ca2 + golf testen en resultaten downstream probe.

<table><tbody><tr><td>Droge actieve gist</td><td>Fleischman&rsquo;s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Verschillende zullen werken</td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Mircotec Glasvezel</td><td>MF0-90</td><td>Verschillende zullen werken</td></tr><tr><td>Medische doekjes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Markeerstift</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen universeel, zwart - verkrijgbaar in de meeste kantoorartikelenwinkels. Superfijn Breedte 0,4 mm</td></tr><tr><td>CO2-pad</td><td>&nbsp;Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas Nr. 1,5, 22 x 50 mm</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon olie, serie 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Distributor in Europa:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olie 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Kan worden gebruikt in plaats van Halocarbon olie, serie 95</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Hoewel deze gereedschappen schoon moeten zijn, is het gebruik van een autoclaaf niet noodzakelijk, ethanol zou voldoende zijn.</td></tr><tr><td>Sonde</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Glazen pipet</td><td>Fisherbrand,</td><td>FB50251</td><td>Pasteur Pipetten, glas, ongestopt, 150 mm lengte&nbsp;</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

beeldvorming calcium in<em&gt; drosophila</em&gt; bij egg activering

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Ei-activatie is een universeel proces dat een reeks gebeurtenissen omvat om de bevruchte eicel in staat te stellen meiose te voltooien en embryonale ontwikkeling te initiëren. Eén aspect van ei-activatie, bewaard in alle onderzochte organismen, is een verandering in de intracellulaire concentratie van calcium (Ca2+), vaak aangeduid als een 'Ca2+-golf'. Hoewel de snelheid en het aantal oscillaties van de Ca2+-golf varieert tussen soorten, is de verandering in intracellulair Ca2+ essentieel voor het veroorzaken van cruciale gebeurtenissen voor embryonale ontwikkeling. Deze veranderingen omvatten hervatting van de celcyclus, mRNA-regulatie, exocytose van corticale korrels en herschikking van het cytoskelet.
In het volwassen Drosophila-ei vindt activatie plaats in de vrouwelijke eileider vóór bevruchting, waardoor een reeks Ca2+-afhankelijke gebeurtenissen wordt geïnitieerd. Hier presenteren we een protocol voor het visualiseren van de Ca2+-golf in Drosophila. Deze benadering biedt een manipuleerbaar modelsysteem om de mechanisme van de Ca2+-golf en de daaruit voortvloeiende veranderingen te onderzoeken.

Hier hebben we aangetoond hoe volwassen Drosophila eieren voor te bereiden op ex vivo activering. Eieren expressie een GECI mogelijk imaging Ca2 + dynamiek ei activering en het begin van de embryonale ontwikkeling (figuur 1). Opgemerkt wordt dat afhankelijk van de GCaMP gebruikt, met name de aanwezigheid van een myristoyl groep, kunnen de resultaten kleine kwaliteitsverschillen 13 14 hebben. Wij hebben ook een rol voor functionele actine tijdens de eieren activatie aangetoond door toevoeging van een remmer van actine polymerisatie, cytochalasine D, tot de activering buffer (figuur 2) 14. Een vereiste voor het cytoskelet bij ei activering wordt geconserveerd. In C. elegans, na de bevruchting, het cytoskelet componenten worden gereorganiseerd om de een-cel embryo voor te bereiden op de eerste asymmetrische divisie 21,22. In de zee-egel, verstoring van cytoskeletal reorganisatie na activering is aangetoond dat de celcyclus te beïnvloeden door het voorkomen contractiele ringvorming 23. De rol van actine in het bemiddelen van een Ca 2+ wave en de downstream-functie op ei activering in Drosophila nog niet volledig opgehelderd. In Drosophila, kan co-visualisatie van de Ca2 + golf en actine cytoskelet worden bereikt met deze ex vivo activatie assay. Tijdreeksen van meerdere kanalen kan worden verkregen en dynamiek van de intracellulaire Ca2 + kan worden gekoppeld aan veranderingen in actine organisatie in de eicel (figuur 3). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Figuur 1:. A Single Ca 2+ golf bij Drosophila Egg Activering Time reeks ex vivo volwassen Drosophila ei uitdrukken UASt- myrGCaMP5 na eenddition van de activering buffer (AH). De stijging van cytoplasmatische Ca2 + beginnend op het achterpool (B) en voortplant (BF) met een gemiddelde snelheid van ongeveer 1,5 um / sec. Initiatie van de golf wordt meestal waargenomen binnen 3 minuten van de toevoeging van activeringsbuffer. Na activering, het intracellulaire calciumgehalte van de rijpe eicel terug naar pre-activatie niveau (G, H). Zie aanvullende film 1 (totale tijd 33 min). Schaalbalken = 50 urn. Max projectie = 40 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Figuur 2: Toevoeging van cytochalasine D op Activation Buffer verstoort Ca2+ golfvoortplanting. Time reeks ex vivo volwassen Drosophila ei uitdrukken UASt- myrGCaMP5 na toevoeging van activering buffer die 10 ug / ml cytochalasine D uiteindelijke concentratie (AH). Terwijl de Ca2 + golf wordt ingeleid op achterpool (A) wordt aangetast en niet het voorste van het ei (F) te bereiken (witte pijlen duiden de voorkant van de golf). Geen verdere Ca2 + veranderingen werden waargenomen gedurende 30 min). Zie aanvullende film 2 (totale tijd 30 min). Schaalbalken = 50 urn. Max projectie = 40 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Figuur 3: Co-visualisatie van Actin en Ca2 + bij Egg activering in Drosophila. Time reeks ex vivo volwassen Drosophila ei uitdrukken UASt- myrGCaMP5 (cyaan) en UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) na toevoeging van activering buffer (AH). De Ca 2+ golf initieert uit de achterste paal en herstelt als in figuur 1. Actine lijkt te veranderen in de tijd, witte pijlpunten (A vs H). Het ontbreken van Ca2 + signaaldetectie in het midden van het rijpe eicel wordt veroorzaakt door beweging van het monster gedurende beeldopname. Schaalbalken = 50 urn. Max projectie = 40 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit artikel beschrijft een aanpasbare ex vivo protocol voor het visualiseren van Ca 2+ tijdens ei activering in Drosophila.

Beeldvorming Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bij Egg Activering

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van calcium tijdens de eiactivering in Drosophila melanogaster. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals wat de bron, dynamiek en stroomafwaartse rollen van calcium zijn bij de eiactivering. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat er een hogere ruimtelijke resolutie mogelijk is, dat het rijpe ei fysiek gemanipuleerd kan worden vóór de activering, en dat de rol van eiactivering zonder bevruchting kan worden getest.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het isoleren van de rijpe eicellen zonder schade aan te richten, en met het aanbrengen van de activatiebuffer op de rijpe eicel zonder het monster te verlieen. Stel bij de start van deze procedure de vergroting van de dissectiemicroscoop in op 4X. Scheid op het eerste dekglas de twee eierstokken door de eileider door te scheuren met een gesloten pincet en een dissectienaald, waarbij u er nauwgezet op let geen enkele eikamertje te doorprikken.Plaats vervolgens een standaard dissectieprobe in het centrum van de ovarium, naast de gesloten pincet. Sleep de dissectieprobe voorzichtig door het ovarium in de richting van de posterieure pool, waar de rijpe eicellen zich bevinden. Zodra de rijpe eicellen zichtbaar zijn op het dekglas buiten het ovarium, manoeuvreer er dan drie tot vijf in een lijn in het centrum.Verwijder vervolgens het resterende eierstokweefsel door het weg te slepen van de uitgelijnde eieren. Verwijder daarna het overtollige olie door dit weg te deppen met de hoek van een medisch doekje. Teken met een marker een vizier op het dekglas om het monster onder de microscoop te kunnen lokaliseren.Laat daarna de voorbereide eikamers vijf tot 10 minuten rusten op het dekglas, zodat de eitjes kunnen bezinken in de olie. Neem de voorbereide dekglazen, de activeringsbuffer op kamertemperatuur en glazen pipetten mee naar de beeldvormingsfaciliteit. Selecteer een objectief dat geschikt is voor het afbeelden van het volledige rijpe ei.Plaats vervolgens het eerste voorbereide dekglas op de objecttafel van de microscoop. Selecteer daarna een gezichtsveld van een volgroeide eikamere voor activatie. Stel de beeldparameters in voor standaard GFP-excitatie en -emissie.Stel daarna een brightfield-weergave in om het volwassen ei en de verplaatste olie te visualiseren en te oriënteren. Selecteer nu het laagste Z-vlak waarop de volwassen eieren zichtbaar zijn. Stel vervolgens een volledige Z-stack in over 40 µm met een stapgrootte van 2 µm.Stel vervolgens de tijdserie in om gedurende 30 minuten beelden vast te leggen. Start bij deze procedure de beeldopname en verzamel één tot twee volledige Z-stacks om de volwassen eicel vóór activatie te tonen. Neem daarna ongeveer 300 µL activatiebuffer op in een glazen pipet.Positioneer de punt van de glazen pipet met activatiebuffer in een hoek van 45 graden boven het dekglas en beweeg de pipet langzaam in het straalpad, totdat deze zich direct boven het eitje bevindt dat wordt afgebeeld. Voeg in minder dan vijf seconden één tot twee druppels activatiebuffer toe om de olie te verdrijven. De toevoeging van één tot twee druppels activatiebuffer moet onder de juiste hoek, voorzichtig en snel worden uitgevoerd.Controleer tijdens het toevoegen van de activatiebuffer tijdens de beeldacquisitie het bright-field kanaal om er zeker van te zijn dat de olie is verdrongen. Zodra de olie succesvol is verdrongen, laat u de tijdserie doorlopen tot voltooiing. Om een projectie van de verworven gegevens te maken, selecteert u een begin-Z-slice en een eind-Z-slice voor de gehele sectie.Select vervolgens een projectietype, bijvoorbeeld maximale intensiteit. Vink daarna het vakje Alle tijdsframes aan om de geselecteerde instellingen op de hele serie toe te passen. Om de helderheid en het contrast van het beeld aan te passen, selecteert u Afbeelding, vervolgens Aanpassen, gevolgd door Helderheid/Contrast.Om de tijdreeks als movie te exporteren, selecteert u Bestand, vervolgens Opslaan als, gevolgd door AVI. Selecteer daarna de framerate. Hier wordt de tijdreeks getoond van een ex vivo volwassen Drosophila-ei dat een genetisch gecodeerde calciumindicator tot expressie brengt na toevoeging van activeringsbuffer.De stijging van het cytoplasmatische calcium begint bij de posterieure pool en plant zich vervolgens voort met een gemiddelde snelheid van ongeveer 1,5 micrometer per seconde. De initiatie van de golf wordt doorgaans waargenomen binnen drie minuten na toevoeging van de activatiebuffer. Na activatie herstellen de intracellulaire calciumgehaltes van de volwassen eicel zich.In Drosophila kan co-visualisatie van de calciumgolf en het actine-cytoskelet worden bereikt met deze ex vivo activatie-assay. Actine lijkt in de loop van de tijd te veranderen, zoals aangegeven door de witte pijlpunten. Het uitblijven van de detectie van het calciumsignaal in het centrum van het volgroeide ei is te wijten aan beweging van het monster tijdens de beeldopname.Zodra de techniek onder de knie is, kan de gehele procedure in minder dan een uur worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de tijd te nemen bij het manoeuvreren van de eikamers en bij het instellen van de parameters voor de acquisitie. Deze procedure kan worden aangepast voor het visualiseren van andere fluorescentiegelabelde eiwitten, organellen of calciumindicatoren tijdens de activatie van het ei.Dit kan helpen bij het beantwoorden van vragen over de bron van calcium en de downstream effecten.

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het...

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

Deze video beschrijft in vivo calcium beeldvorming in Drosophila neuronen met behulp van GCaMP. De aanbevolen protocolclip laat zien hoe u veranderingen in GCaMP-fluorescentie van paddestoellichaamneuronen kunt registreren tijdens een olfactorisch conditioneringsexperiment.

Drosophila In Vivo Calcium imaging: een methode voor functionele beeldvorming van neuronale activiteit

This video demonstrates a technique for calcium imaging in individual neurons of behaving Caenorhabditis elegans using genetically encoded fluorescent reporter proteins. It outlines the steps involved in imaging worm movement and measuring reporter fluorescence ratios from neurons to correlate intracellular calcium levels with neuronal activity and behavioral changes during egg-laying.

Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates calcium imaging to study Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

De rechtopstaande beeldvormingsmethode die in dit protocol wordt beschreven, maakt de gedetailleerde visualisatie mogelijk van de polen van een zich ontwikkelend Drosophila melanogaster -ei. Deze uiteinden-op-weergave biedt een nieuw perspectief op de arrangementen en morfologieën van meerdere celtypen in het folliculaire epitheel.

Rechtop Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Dit witboek beschrijft een protocol voor ex vivo calcium beeldvorming van de hersenen van Drosophila . Bij deze methode, kunnen natuurlijke of synthetische verbindingen worden toegepast op de buffer voor het testen van hun vermogen om bepaalde neuronen in de hersenen activeren.

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Hier beschrijven we een protocol voor detectie en lokalisatie van Drosophila embryo-eiwit en RNA van verzameling tot pre-embedding en embedding, immunostaining en mRNA in situ hybridisatie.

Een protocol voor immunohistochemie en RNA-in-situ distributie binnen vroege drosophila-embryo's

Hier presenteren we een protocol voor ex vivo calciumbeeldvorming bij volwassen Drosophila met GCaMP6-expressie om epileptiforme activiteiten te monitoren. Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van ictale gebeurtenissen bij volwassen Drosophila door middel van ex vivo calciumbeeldvorming, waardoor de mogelijke mechanismen van epilepsie op cellulair niveau kunnen worden onderzocht.

Ex Vivo Calciumbeeldvorming voor Drosophila-model van epilepsie

Hier presenteren we protocollen en hulpmiddelen voor het visualiseren van calcium tijdens bevruchting en vroege embryogenese met behulp van een genetisch gecodeerde calciumreporter die tot expressie komt in de kiembaan van de modelnematode C. elegans.

In vivo visualisatie van calciumtransiënten tijdens bevruchting en vroege ontwikkeling in C. elegans

We presenteren calciumbeeldvormingsprotocollen voor een Drosophila-larvale olfactorische neuron, met behulp van een topische weefsellijm voor immobilisatie. Deze methode verbetert de stabiliteit en maakt betrouwbare in- en ex-vivo-experimenten mogelijk. Aangepaste R-scripts analyseren calciumsignalen en bieden een efficiënt platform voor gedetailleerd neurofysiologisch onderzoek.

In-vivo en ex-vivo calciumbeeldvorming van een reukcircuitneuron in de larve van de Drosophila melanogaster met een derde instar

Leer calciumbeeldvorming tijdens eiactivering in Drosophila melanogaster met dit ex vivo protocol. Deze methode maakt hoge resolutie en manipulatie van rijpe eieren mogelijk voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Beeldvorming Calcium in

Meer video's verkennen