Embryo micro-injectie en elektroporatie in de chordate Doorschijnende zakpijp

Het algemene doel van transiënte transfectietechnieken in Ciona-embryo's is om genexpressie en functie te bestuderen die nodig zijn om kikkervisje-achtige larven te vormen, gebruikmakend van hun invariante cellulaire lijn en compacte ongewervelde genoom, om inzicht te krijgen in de oorsprong van chordaten en ongewervelde dieren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van moleculaire genetica, zoals de geconserveerde mechanismen van het chordaat-ontwikkelingsprogramma die relevant zijn voor stamcelonderzoek en voor geneesmiddelontdekking. Het grote voordeel van deze techniek is dat met embryo-elektroporatie je honderden of duizenden gesynchroniseerde embryo's in één dag kunt behandelen.

Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn in deze methode worstelen, vanwege de fragiele dechorionatie van het embryo en omdat het lastig is om een efficiënte micro-injectietechniek te ontwikkelen. Begin met het dissecteren van Ciona-volwassenen in een koelkamer met embryo's van 18 graden Celsius. Gebruik kleine schaar om een incisie te maken aan het andere einde van de sifon en aan de zijkant van de kortere sifon, waaronder de eileider en spermaduct lopen.

Verleng de incisie om de eileider bloot te leggen. Gebruik vervolgens het uiteinde van de schaar om een precieze incisie in de eileider te maken. Druk voorzichtig op de eileider met de gesloten schaar en verwijder de eieren.

Laat de eieren rechtstreeks in een zes-puttenplaat met kunstzeewater met HEPES vallen. Gebruik een Pasteur-pipet, vooraf gespoeld met ASWH, om de resterende eieren te verzamelen en over te brengen. Om sperma te verzamelen, snijdt u de spermaduct met de schaar en gebruikt u vervolgens een apart Pasteur-pipet om geconcentreerd sperma te verzamelen en over te brengen in een buisje van 1,5 milliliter.

Activeer het sperma door één milliliter ASWH en 50 microliter Tris te combineren in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens 20 microliter geconcentreerd sperma toe, sluit de dop en meng voorzichtig door de buis om te draaien of door een Pasteur-pipet te gebruiken. Voeg vervolgens 100 tot 200 microliter van de geactiveerde sperma-oplossing toe aan elke put met eieren en meng goed door op en neer te pipetten, zodat de eieren in het medium drijven.

Begin met dechorionatie door de zygoten te verzamelen en in glazen buisjes te doseren. Met de handcentrifuge draait u de zygoten twaalfhonderd keer G gedurende ongeveer 20 seconden en stopt u vervolgens langzaam met de centrifuge. Verwijder het ASWH van de pellets met een Pasteur-pipet.

Voeg vier milliliter geactiveerde dechorionatie-oplossing toe aan de pellet in elke buis. Suspendeer de zygoten door voorzichtig op en neer te pipetten met een met tappelwater behandelde Pasteur-pipet, bovenop een kleine rubberen peer. De oplossing zou na 1 tot 3 minuten geelachtig moeten worden.

Tijdens dechorionatie verwijdert u een kleine aliquot van de dechorionerende suspensie met behulp van de Pasteur-pipet. Deponeer een druppel op een dia en observeer deze onder de dissectiemicroscoop. Pipetteer de zygotensuspensie op en neer en controleer elke 20 tot 30 seconden de dia.

Eerst loslaten de follikelcellen, dan wordt het chorion geel en ondoorzichtig, en tenslotte loslaat het zich van de zygoten. Roze dechorionerende zygoten zullen naar de bodem van het glazen buisje zinken. Zodra meer dan 50% van de zygoten dechorioneerd is, vult u de buis met ASWH.

Centrifugeer zeer voorzichtig gedurende ongeveer 10 tot 15 seconden, net genoeg om de dechorionerende zygoten te sedimenteren. Stop de centrifuge langzaam. Verwijder bijna alle vloeistof uit het glazen buisje, inclusief alle drijvende materialen, en vervang met ASWH.

Pipetteer langzaam op en neer om te wassen en centrifugeer vervolgens voorzichtig zoals eerder. Was opnieuw totdat er geen chorionresten meer zijn. Laat de was zwaartekracht sedimenteren naar dechorionerende zygoten in gesiliconiseerde buisjes van 1,5 milliliter.

Na sedimentatie verwijdert u het ASWH tot aan de 100 microliter-markering op de buis. Gebruik nu een Pasteur-pipet om 250 microliter van eerder bereide DNA in mannitol-oplossing toe te voegen aan één buis met zygoten. Meng voorzichtig en breng het mengsel onmiddellijk over in een vier millimeter elektroporatiecuvet.

Plaats de cuvet in de elektroporatiehouder en geef een enkele puls van 16 milliseconden bij 50 volt. Verwijder vervolgens de zygoten uit de cuvet met behulp van dezelfde Pasteur-pipet en breng ze over in een kweekschaaltje met vers, gefilterd ASWH. Roer het schaaltje om de zygoten uit te spreiden.

Spoel de pipet in een beker met ASWH en ga dan verder met het volgende monster. Na het elektroporiëren van alle zygoten, kweekt u de zygoten bij 15 tot 20 graden Celsius. Zet de micro-manipulator op in een koelkamer van 18 graden Celsius.

Verbind de plastic buis en de naaldhouder met een glazen spuit van 10 milliliter gevuld met minerale olie. Vul de buis en de naaldhouder met olie en verwijder eventuele luchtbellen. Plaats de injectienaald met 0,5 microliter injectieoplossing met groene vitale kleurstof in de naaldhouder.

En plaats de houder op de micro-manipulator. Pas de naaldhouder aan zodat deze zich langs een rechte lijn beweegt onder een hoek van 45 graden ten opzichte van het oppervlak. Orienteer dechorionerende eieren in een kleine agarose-gecoate kweekschaal langs een inkeping, zodat de eieren een voor een onder de dissectiemicroscoop kunnen worden geïnjecteerd.

Als het nodig is, breekt u de naaldtip door voorzichtig de naald tegen een stukje glazen dekglas te duwen, geplaatst op de agarose. Oefen lichte druk uit om te controleren of de naaldtip open is. Injecteer de onbevruchte eieren een voor een, door eerst de naald in het ei te introduceren en licht te aspireren om de eimembraan te breken.

Injecteer vervolgens de groene injectieoplossing in het midden van het ei, tot maximaal een derde van de celdiameter. Nadat alle eieren zijn geïn